叢艷飛，丁晶晶，李 芳，王莉莉

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗研究中心， 遼寧省環(huán)境與代謝疾病動物模型研究與應(yīng)用重點實驗室, 遼寧 本溪 117000)

近年來，主動吸煙和被動吸煙的人數(shù)在全世界范圍內(nèi)增加，女性暴露于二手煙的現(xiàn)象非常普遍，育齡期婦女吸煙率呈明顯上升趨勢[1]。在吸煙時，煙草煙霧(cigarette smoke，CS)中的有害物質(zhì)會通過呼吸道的粘膜進入人體的各個器官和組織造成全身性的傷害，例如CS中的有毒物質(zhì)通過降低胚胎植入率，減少卵巢中類固醇激素的生成和卵泡數(shù)量等，影響女性生殖的各個階段[2]。CS混合物中的有毒物質(zhì)也可導致子宮發(fā)育受損，子宮是哺乳動物重要的生殖器官，主要由3種類型的細胞(上皮細胞，基質(zhì)細胞和子宮肌層細胞)組成。研究發(fā)現(xiàn)，口服尼古丁會導致大鼠子宮腔上皮和腺上皮形態(tài)學改變[3]，CS暴露可導致子宮基質(zhì)金屬肽酶 9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)，4 型 CXC 趨化因子受體(recombinant chemokine C-X-C-motif receptor 4，CXCR4)和雌激素受體(estrogen receptor，ER)的表達增加[4]。曲古抑菌素 A(trichostatin A，TSA)能夠改變蛋白質(zhì)乙?；剑瑢Χ喾N疾病都有治療作用，例如TSA能夠緩解腎上腺嗜鉻細胞瘤造成的缺血性損傷[5]。在我們先前的研究中，CS暴露通過激活組蛋白脫乙?；?/2(histone deacetylase，HDAC)導致子宮組織形態(tài)發(fā)生變化，TSA 通過抑制 HDAC 1/2 和 mTOR 的激活，重新激活自噬，從而引起子宮組織形態(tài)改變[6]。由于CS含有多種復雜的有害成分，CS暴露對子宮損傷的機制尚未完全清楚。

嘌呤受體(purinergic receptor P2X，ligand-gated ion channel，7，P2RX7)是由細胞外三磷酸腺苷(eATP)激活的離子通道，在與天然配體胞外 ATP(eATP) 結(jié)合后介導細胞內(nèi)鈉和鈣的內(nèi)流以及鉀的外流。在子宮組織中，P2RX7 主要在子宮內(nèi)膜，子宮頸內(nèi)膜和外宮頸的上皮細胞中表達[7]。在大鼠子宮肌層細胞中 ATP 誘導的電流通過P2RX7 受體穿過細胞膜導致子宮收縮[8]。P2RX7 受體可以引起 Ca2+的強烈增加和胱冬肽酶(cysteinyl aspartate-specific proteases，caspase)的裂解來啟動細胞凋亡，也可以誘導 NLRP3 炎性體和 caspase-1 的激活導致促炎因子的分泌，最終發(fā)生細胞焦亡。研究發(fā)現(xiàn)，P2X7-NLRP3/ASC-caspase1/11-IL-1β/IL-18 軸在CS暴露導致的小鼠過敏性氣道炎癥中發(fā)揮重要作用[9]。此外，P2RX7 受體還可通過 caspase-9 介導的線粒體途徑誘導人宮頸上皮細胞凋亡[10]。綜上所述，P2RX7 受體在子宮組織中發(fā)揮重要的作用，而P2RX7 受體介導的細胞焦亡和凋亡是否參與了CS暴露導致的子宮損傷？P2RX7 受體是否參與TSA對CS暴露導致的子宮組織損傷的緩解作用？目前尚需要進一步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF 級 60 d C57 BL/6 小鼠 36 只，♀，體質(zhì)量(20±0.5)g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司[SCXK(遼)2015-0001]。實驗在中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院動物中心 SPF 級動物飼養(yǎng)室[SYXK(遼)2017-0004]進行，實驗動物飼養(yǎng)在室溫(22 ±3)℃，相對濕度 (50±20)%，暗循環(huán)，噪聲< 60 dB，氨≤1.5×10-6的SPF級房間中，自由喂食實驗動物飼料和水。針對實驗動物的所有操作流程關(guān)注動物福利，并通過中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(2013PS06K；2019PS263K)。實驗前詞養(yǎng) 1 周，觀察無明顯全身疾病及其他異常后開始實驗。CS暴露期間每2 d測量1次小鼠體重 。

1.1.2試劑 雄獅牌香煙(每支含0.7 mg 尼古丁和 8 mg 焦油)；TSA(Sigma；批號：T1952，規(guī)格：200 μL)；一抗來源：GAPDH(康成生物；批號：KC-5G4，規(guī)格：100 μL)；P2RX7(proteintech；批號：11144-1-AP，規(guī)格：150 μL)；NLRP3(abcam；批號：ab214185，規(guī)格：100 μL)；ASC(萬類生物；批號：WL02462，規(guī)格：50 μL)；cleaved caspase-1(萬類生物；批號：WL02996a，規(guī)格：50 μL)；IL-1β(萬類生物；批號：WLH3903，規(guī)格：50 μL)；cleaved caspase-3(萬類生物；批號：WL02117，規(guī)格：50 μL)；cleaved caspase-9(CST；批號：9509S，規(guī)格：100 μL)；羊抗兔二抗(Abbkine；批號：A23620，規(guī)格：50 μL)；羊抗鼠二抗(Abbkine；批號：A25012，規(guī)格：50 μL)

1.2 研究方法

1.2.1煙草煙霧暴露小鼠模型 將 36 只體質(zhì)量年齡大小相近的 C57 BL/6 小鼠按隨機分組的方法分為對照組、CS暴露組和CS+TSA 組，每組 12 只，對每組內(nèi)的小鼠進行編號，列表記錄它們的初始體質(zhì)量以及精神活動狀態(tài)。自制實驗性CS暴露裝置，CS暴露方法參照本課題組前期實驗[6]。CS暴露組和CS+TSA 組小鼠CS暴露時間為 30 d，每天2次CS暴露，每次CS暴露給2支煙持續(xù)暴露 2 h，CS暴露時間間隔為 5 h。每次進行CS暴露時取1支煙點燃，使煙霧進入CS暴露組小鼠所處的箱子內(nèi)，CS暴露組箱子放在無風環(huán)境中，保持一定的空氣流通。對照組小鼠吸入空氣。藥物 TSA(將TSA溶于DMSO，再用生理鹽水將其配制成濃度為1.98×10-5mol·L-1的溶液)，按 0.6 μg·g-1體質(zhì)量的劑量，每2 d 1次，腹腔內(nèi)注射給CS+TSA 組小鼠。CS暴露 30 d 后，對處于發(fā)情期的雌性小鼠實施安樂死，并從每組中至少收集了 5 個子宮用于進一步研究。

1.2.2HE染色 CS暴露 30 d 后，取CS暴露組和對照組小鼠的子宮組織，用 4% 多聚甲醛固定 24 h，再經(jīng)梯度酒精的洗滌、脫水、二甲苯透明，浸蠟，進行組織包埋，以4 μm 厚度連續(xù)切片，HE染色，中性樹脂封片后置于光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3Western blot 分析 提取對照組、CS暴露組和CS+TSA 組小鼠子宮組織總蛋白，然后將提取的各組子宮組織的總蛋白進行 SDS-PAGE 電泳，用P2RX7(1 ∶ 2 000稀釋)、ASC(1 ∶ 2 000稀釋)、IL-1β(1 ∶ 2 000稀釋)、GAPDH(1 ∶ 5 000 稀釋)、cleaved caspase1(1 ∶ 2 000稀釋)、NLRP3(1 ∶ 500稀釋)、cleaved caspase3(1 ∶ 2 000稀釋)和 cleaved caspase-9(1 ∶ 2 000稀釋)抗體孵育。實驗結(jié)束后用 Image-J 軟件對光密度值進行定量檢測，對不同分子量蛋白的表達情況進行分析。

1.2.4Real time-PCR 使用 TRIzol 試劑從子宮中分離總 RNA(n=3～4/組)，并用 oligo(dT)引物和 SuperScript Ⅱ 反轉(zhuǎn)錄 RNA(1 mg)。在具有 SYBR Green 的 Roche 480 PCR系統(tǒng)上進行實時定量 PCR。將 GAPDH 作為內(nèi)源性對照，并使用 2-ΔΔct方法計算每個樣品的基因表達相對水平?；虻囊镄蛄?。

Tab 1 Primers for genes used in q-PCR

1.3 統(tǒng)計學分析方法應(yīng)用 GraphPad Prism 7.00 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，2 組比較采用獨立樣本t檢驗，3 組比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 CS暴露導致子宮組織結(jié)構(gòu)改變CS暴露導致子宮組織形態(tài)學改變。Fig 1C結(jié)果顯示，CS暴露后的小鼠比暴露于室內(nèi)空氣的小鼠的子宮肌層(中環(huán)肌和內(nèi)縱肌)和子宮內(nèi)膜更薄。Fig 1D結(jié)果顯示，CS暴露后小鼠子宮腺體組織和間質(zhì)細胞明顯減少。我們先前的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TSA 有效抑制了CS暴露引起的小鼠子宮肌層變薄以及腺體組織和間質(zhì)細胞的減少[6]。

Fig 1 Histomorphologic alterations in uterine caused by CS exposure

A: The morphology of uterine tissues of mice in the optical microscope (HE，×40) Control group; B: The enlarged optical microscope image of the myometrial region in Fig A (HE，×400); C: The morphology of uterine tissues of mice in the optical microscope (HE，×40) CS group; D: The enlarged optical microscope image of the myometrial region in Fig C (HE，×400). Blue arrows point to interstitial cells, black arrows to myometrium and red arrows to glandular tissues.

2.2 TSA 抑制了CS暴露誘導的小鼠子宮組織細胞焦亡的發(fā)生我們前期的研究表明，CS暴露能夠引起小鼠子宮組織形態(tài)學改變，TSA 能夠改善CS暴露引起的小鼠子宮組織形態(tài)學改變[6]。因此，我們進一步探索了TSA是否能夠通過抑制P2RX7 介導的細胞焦亡緩解CS暴露引起的子宮組織形態(tài)學改變。首先，我們采用 Western blot 技術(shù)檢測了各組(對照組、CS暴露組和CS+TSA 組)小鼠子宮組織中P2RX7 和細胞焦亡相關(guān)蛋白的表達水平，細胞焦亡相關(guān)蛋白包括核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NACHT-LRRPYD-containing proteins 3 inflammasome，NLRP3)，白細胞介素 1β (interleukin 1β，IL-1β)，凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和cleaved caspase 1。結(jié)果表明，CS暴露后小鼠子宮組織P2RX7 和細胞焦亡相關(guān)蛋白表達水平明顯升高，TSA有效抑制了CS暴露誘導的小鼠子宮組織P2RX7和細胞焦亡相關(guān)蛋白的表達。此外，我們通過 Real time-PCR 檢測了小鼠子宮組織中Hdac1，IL-1β，P2rx7 和Asc的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，CS暴露后小鼠子宮組織中Hdac1，P2rx7和Asc的mRNA轉(zhuǎn)錄活性升高，并且TSA明顯抑制了CS暴露后小鼠子宮組織中Hdac1，Il-1β，P2rx7和Asc的mRNA 轉(zhuǎn)錄活性。因此，我們的結(jié)果表明,TSA能夠通過抑制P2RX7 介導的細胞焦亡改善CS暴露引起的子宮組織形態(tài)改變。

Fig 2 Activation of markers of pyroptosis activation induced by CS exposure inhibited by TSA )

Blots of expression of P2RX7 and pyroptosis related proteins in three groups.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsCS

2.3 TSA 抑制了CS暴露誘導的小鼠子宮組織細胞凋亡的發(fā)生為了進一步探索TSA能否通過抑制P2RX7 介導的細胞凋亡，緩解CS暴露導致的小鼠子宮損傷，我們使用 Western blot 技術(shù)檢測了各組(對照組、CS暴露組和CS+TSA 組)小鼠子宮組織中細胞凋亡相關(guān)蛋白(cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9)的表達水平。結(jié)果表明，CS暴露后小鼠子宮組織細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達水平增加，TSA 抑制了CS暴露誘導的小鼠子宮組織細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達。因此，我們的研究結(jié)果證實TSA也能夠通過抑制P2RX7 介導的細胞凋亡改善CS暴露引起的子宮組織形態(tài)改變。

Electrophoresis results of PCR products ofGapdh,Hdac1,P2rx7,AscandIl-1β. The mRNA levels ofHdac1,P2rx7 andAscincreased andIl-1βdecreased in the uterus after CS exposure, and TSA significantly inhibited the transcriptional activity ofHdac1,P2rx7 andAsc. Data are shown as means±SEM.**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsCS

Fig 4 Activation of markers of apoptosis activation induced by CS exposure inhibited by TSA n=3 )

Blots of expression of apoptosis related proteins in three groups.*P<0.05vscontrol;#P<0.05;##P<0.01vsCS

3 討論

CS混合物中含有碳氫類化合物，醇類，酚類，醛類，酮類，生物堿類，酸類和重金屬等多種有害的化學物質(zhì)，這些有害物質(zhì)能夠?qū)е屡陨彻δ苁軗p。有研究報道，CS暴露可通過 AMP 激活的蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)途徑誘導自噬級聯(lián)反應(yīng)，以及抑制抗自噬相關(guān)蛋白 AKT 和 mTOR 的表達，導致卵巢卵泡丟失[11]，同時，臨床研究表明，CS暴露后可能通過多種途徑導致卵巢雌激素合成減少[12]，因此，CS暴露能夠損傷女性卵巢功能。雖然關(guān)于CS暴露導致卵巢損傷使女性生育能力受損的報道很多，但是關(guān)于CS暴露導致子宮損傷的作用和機制的研究較少。子宮在女性生育過程中發(fā)揮重要的作用，如果子宮組織發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，可影響受精卵的著床，胚胎發(fā)育和激素分泌等多個過程，進而使女性生育能力受損。僅有的文獻證實，口服尼古丁可以導致大鼠子宮組織重量減少、使上皮組織、子宮肌層和子宮內(nèi)膜變薄[4]。本實驗使用CS暴露 30 d 的方法建立了小鼠子宮損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)，CS暴露導致 C57 BL/6 小鼠子宮組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學改變，包括子宮肌層和子宮內(nèi)膜變薄，子宮腺體組織和間質(zhì)細胞也明顯減少。本研究CS暴露 30 d 后 C57 BL/6 小鼠子宮組織發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化和文獻報道的CS暴露導致的大鼠子宮組織結(jié)構(gòu)改變相似。TSA 是一種泛去乙?；敢种苿?，可以通過改變蛋白質(zhì)的乙?；秸{(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能。關(guān)于TSA的治療作用已經(jīng)有多篇文獻進行了報道，例如TSA可以改善大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤導致的 PC12 細胞缺血性損傷[5]。我們的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CS暴露能夠通過激活 HDAC1/2 導致子宮肌層和子宮內(nèi)膜變薄，而TSA可以抑制 HDAC1/2 和 mTOR 的活化重新激活自噬，從而緩解CS暴露引起的子宮組織形態(tài)改變[6]。因此，我們的CS暴露方法可以成功制作出子宮損傷的小鼠動物模型，為進一步揭示CS暴露導致子宮損傷的機制提供了很好的前期基礎(chǔ)。由于CS含有多種復雜的有害成分，所以，關(guān)于CS暴露導致的子宮損傷的機制還需要我們進一步探索，為臨床治療吸煙引起的女性不孕提供新的靶標。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)CS暴露導致小鼠子宮組織中P2RX7、細胞焦亡相關(guān)蛋白(ASC、NLRP3、IL-1β和cleaved caspase-1)和細胞凋亡相關(guān)蛋白(cleaved caspase-3和cleaved caspase-9)的表達水平升高。因此，CS暴露可能通過P2RX7 介導的細胞焦亡和凋亡導致子宮組織形態(tài)學改變。細胞焦亡是一種主要由炎性小體介導的程序性細胞死亡方式，通過切割 GSDMD 蛋白在細胞膜上打孔，改變細胞滲透壓使細胞膨脹，釋放內(nèi)容物和相關(guān)炎癥因子導致機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在機體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。細胞凋亡也是一種程序性細胞死亡方式，它的發(fā)生主要依賴于半胱天冬酶 caspase-3、6、8 等，伴隨著凋亡小體的形成，由細胞膜對細胞內(nèi)容物進行包裹，再由巨噬細胞對其進行非炎癥性吞噬，進而維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[13]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞焦亡和凋亡在子宮的某些病理損傷變化中發(fā)揮著重要作用。例如金黃色葡萄球菌通過誘導子宮組織發(fā)生細胞焦亡和凋亡引起子宮內(nèi)膜炎[14]，順鉑在雌性大鼠卵巢和子宮組織中能夠參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡的發(fā)生等[15]。以上發(fā)現(xiàn)均表明細胞焦亡和凋亡在子宮組織的發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用，因此，抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡都有可能治療子宮的病理損傷變化。P2RX7受體是同源三聚體配體門控陽離子通道，其特征在于有2個跨膜結(jié)構(gòu)域，這種受體已在全身多種細胞中發(fā)現(xiàn)，但是在免疫細胞中表達最多。ATP是P2RX7受體的天然配體，胞外 ATP 激活受體會引起 Ca2+、Na+和K+在質(zhì)膜上的流動。P2RX7受體可以引起Ca2+的強烈增加和 caspase 的裂解來啟動細胞凋亡，還可通過激活 caspase-1 和 NLRP3 來啟動細胞焦亡。P2RX7 參與了很多疾病的發(fā)展過程，研究發(fā)現(xiàn)P2RX7 抑制劑具有治療多種疾病的潛力，包括神經(jīng)退行性疾病、精神疾病、癲癇和肌肉骨骼疾病等[16]。關(guān)于CS暴露后P2RX7介導的細胞焦亡導致慢性阻塞性肺病肺組織損傷的報道很多[9]。但是P2RX7 受體在子宮中相關(guān)功能的研究很少，僅有的文獻證實，P2RX7受體能夠介導人宮頸上皮細胞凋亡[10]。迄今為止，CS暴露后P2RX7 受體在子宮組織中的作用尚未有人進行研究。關(guān)于P2RX7 介導的細胞焦亡和凋亡在CS暴露所致的子宮損傷中是否發(fā)揮作用尚不清楚。本研究證實了P2RX7 介導的細胞焦亡和凋亡參與了CS暴露導致的雌性小鼠子宮損傷。然而，P2RX7 受體是否參與TSA對CS暴露導致的子宮組織損傷的緩解作用還未有人進行研究。本研究發(fā)現(xiàn)，TSA抑制了CS暴露導致的P2RX7、細胞焦亡相關(guān)蛋白(ASC、NLRP3、IL-1β和cleaved caspase-1)和細胞凋亡相關(guān)蛋白(cleaved caspase-3和cleaved caspase-9)的表達水平升高，并且TSA抑制了CS暴露導致的子宮組織Hdac1、P2rx7、AscmRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高。因此，本研究證實P2RX7 介導的細胞焦亡和凋亡參與了TSA緩解的CS暴露所致的小鼠子宮損傷過程。CS暴露后子宮組織Il-1β的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達水平不一致，我們推測可能存在其它復雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制影響Il-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，未來我們會進一步進行探索。

綜上所述，P2RX7 介導的細胞焦亡和凋亡參與TSA緩解的煙草煙霧暴露所致的小鼠子宮損傷過程。本研究為TSA靶向治療煙草煙霧暴露導致的女性生育能力受損提供了依據(jù)，為闡明煙草煙霧暴露導致女性不孕的機制奠定了基礎(chǔ)，對未來治療吸煙引起的女性不孕提供一定的指導意義。

(致謝：感謝中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗研究中心提供實驗平臺)。