張 媛, 吳彥霖, 納 濤, 楊澤岸, 胡文言, 高 華

(1.中國食品藥品檢定研究院化學(xué)藥品檢定所藥理室, 北京 102629; 2.中國生化制藥工業(yè)協(xié)會，北京 100068)

骨肽類藥物是由新鮮或冷凍的豬、鹿或胎牛四肢骨經(jīng)生物技術(shù)提取的骨活性物質(zhì)精制而成，內(nèi)含有骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMPs)等多種多肽類骨代謝活性因子，以及多種骨修復(fù)所需的無機(jī)元素、氨基酸及微量元素等[1，2]。目前骨肽類藥物作為治療骨折的臨床常用藥物，主要通過刺激成骨細(xì)胞增殖，對鈣磷代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得鈣沉積有效增加，從而幫助新骨形成[3-4]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓中的一種多能干細(xì)胞，具有干細(xì)胞的所有共性，即自我更新和多向誘導(dǎo)分化能力，具有來源廣泛、獲取簡單、易于培養(yǎng)、體外增殖能力強(qiáng)和自體移植無排斥反應(yīng)等特點，廣泛應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，被公認(rèn)為是骨組織工程最為常用的種子細(xì)胞[5]。機(jī)體骨折后的修復(fù)過程類似于胚胎期骨形成，需要骨折部位局部聚集足夠數(shù)量的BMSCs來進(jìn)行骨修復(fù)，近年來許多體外研究以不同藥物作為誘導(dǎo)劑加入BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)體系中，對其進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化。在BMSCs誘導(dǎo)分化過程中，多種骨代謝因子發(fā)揮了重要作用，骨肽中含有多種骨誘導(dǎo)活性因子，具有誘導(dǎo)BMSCs成骨細(xì)胞分化的潛質(zhì)。因此，本研究選用BMSCs為研究對象，探索骨肽原液誘導(dǎo)胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(fetal marrow mesenchymal stem cells, F-BMSCs)成骨分化的分子作用機(jī)制，并對不同廠家的骨肽原液進(jìn)行比較。

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑BMSCs完全培養(yǎng)基(HUXMF-90011)、0.1%茜素紅S染液，購于賽業(yè)生物科技有限公司；Fetal Bovine Serum(10099141C)、0.25%Trypsin-EDTA(25200056)、Stempro成骨誘導(dǎo)分化試劑盒(A1007201)購于Gibco；磷酸鹽緩沖液(SH30256.01B)購于Hyclone；CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(CK04)購于Dojindo；4%多聚甲醛(P1110-100ml)購于索萊寶；ALP檢測試劑盒(P0321)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(6×)(P0015F)、 Western及IP細(xì)胞裂解液(無抑制劑)(P0013J)購于碧云天；TRIzol(15596026)購于Invitrogen；DEPC-treated water(R0601)、RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit(K1622)購于Fermentas；Runx2 Monoclonal Antibody(AMAB90591)、Anti-Actin antibody(A3853-100UL)購于Sigma；Osteocalcin Polyclonal Antibody (PA5-11849)、Western blotting顯影液(34095)購于Thermo；兔源二抗(NA9340-1ML)、鼠源二抗(NXA931-1ML)購于GE；脫脂奶粉(232100)購于DIFCO；硝酸纖維素膜(IPVH00010)購于PALL；人間充質(zhì)干細(xì)胞分析試劑盒(562245) 購于BD。 骨肽原液來源于4個生產(chǎn)廠家：廠家A、B、C、L。

1.2 細(xì)胞株大鼠骨肉瘤細(xì)胞株(UMR106)，購于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心；胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(F-BMSCs)，購于賽業(yè)生物科技有限公司。

1.3 儀器生物安全柜，Thermo，型號：1389 A2；二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo，型號：3141；高速離心機(jī)，Beckman Coulter，型號：6R；細(xì)胞計數(shù)儀，Beckman Coulter，型號：Z2；多功能微板檢測儀酶標(biāo)儀，Biotek，型號： SYNERGY HT；電熱恒溫水浴鍋，上海森信，型號：DK S26；紫外分光光度計，北京普析，型號：TU-1901；實時熒光定量PCR儀，Applied Biosystems，型號：AB7500 FAST；PeqSTAR 96 universal gradient PCR儀，PeqlabGmbH，型號：BCS015850；超微量分光光度計，Malcom，型號E-SPECT；醫(yī)用洗片機(jī)，泰興市泰晟醫(yī)療器械廠，型號 TS435-A；流式細(xì)胞儀，BD FACS Calibur；電泳儀，Bio-Rad PowerPac；超純水機(jī)，ADVANTAGE，型號：A10。

2 實驗方法

2.1 促UMR106細(xì)胞增殖作用[6]UMR106細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時，用0.25% Trypsin進(jìn)行消化。將消化下來的細(xì)胞用1%FBS培養(yǎng)基稀釋成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107·L-1接種至96孔板，每孔加入100 μL。細(xì)胞貼壁24 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，設(shè)不同組別，更換培養(yǎng)基。其中，陰性對照組加入含PBS(與加入藥物等體積)的1%FBS的培養(yǎng)基，供試品組加入含不同濃度骨肽原液的1%FBS培養(yǎng)基，另設(shè)不含細(xì)胞的完全空白組。將廠家A、B、C、L骨肽原液配制為0.06、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 g·L-1濃度的含藥1%FBS培養(yǎng)基，每孔分別加入對應(yīng)的組別藥物100 μL，作用48 h、72 h后使用CCK-8法進(jìn)行測定，計算細(xì)胞增殖率，以細(xì)胞增殖率的大小評價骨肽原液促UMR106細(xì)胞增殖活性。細(xì)胞增殖率/%=[(供試品組OD值-完全空白組OD值)/(陰性對照組OD值-完全空白組OD值)]×100%

2.2 F-BMSCs免疫表型檢測F-BMSCs置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時，用人間充質(zhì)干細(xì)胞分析試劑盒中的抗體標(biāo)記細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀檢測。用FlowJo軟件對間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白CD73、CD90、CD105和陰性對照標(biāo)志蛋白CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR進(jìn)行分析。

2.3 CCK-8法檢測骨肽原液對F-BMSCs的影響當(dāng)培養(yǎng)的F-BMSCs融合度達(dá)到80%～90%時，消化并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107·L-1接種至96孔板，每孔培養(yǎng)體系為100 μL。24 h后，吸棄孔內(nèi)完全培養(yǎng)基，每孔加入含1 g·L-1骨肽原液的完全培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)，并于加藥后72 h、96 h、144 h使用 CCK-8法進(jìn)行測定，實驗操作參照試劑盒說明書。

2.4 骨肽原液對F-BMSCs誘導(dǎo)成骨ALP活性檢測當(dāng)培養(yǎng)的F-BMSCs融合度達(dá)到80%～90%時，消化并調(diào)整細(xì)胞濃度5×107·L-1接種至12孔板中，每孔培養(yǎng)體系為1 mL。培養(yǎng)24 h后，不同組別更換培養(yǎng)基，每孔加入1 mL相應(yīng)培養(yǎng)基。設(shè)置陰性對照組：含PBS(與加入藥物等體積)的完全培養(yǎng)基；誘導(dǎo)組：含PBS(與加入藥物等體積)的誘導(dǎo)液；供試品組：含1.0 g·L-1骨肽原液的誘導(dǎo)液。每2～3 d更換新鮮的各組培養(yǎng)基。誘導(dǎo)5 d、7 d 時，去除12孔板中培養(yǎng)基，用1 mL PBS洗1遍，盡量將PBS除凈，每孔加入100 μL Western及IP裂解液(無抑制劑)，用槍吹打數(shù)下，使裂解液與細(xì)胞充分接觸，收集細(xì)胞裂解液。按照ALP活性測定試劑盒說明書進(jìn)行測定。

2.5 茜素紅S礦化結(jié)節(jié)染色當(dāng)培養(yǎng)的F-BMSCs融合度達(dá)到80%～90%時，消化并調(diào)整細(xì)胞濃度5×107·L-1接種至12孔板中，每孔培養(yǎng)體系為1 mL。培養(yǎng)24 h后，不同組別更換培養(yǎng)基，每孔加入1 mL相應(yīng)培養(yǎng)基。設(shè)置陰性對照組：含PBS(與加入藥物等體積)的完全培養(yǎng)基；誘導(dǎo)組：含PBS(與加入藥物等體積)的誘導(dǎo)液；供試品組：含1 g·L-1骨肽原液的誘導(dǎo)液。每2～3 d更換新鮮的各組培養(yǎng)基。每2～3 d更換新鮮的各組培養(yǎng)基。誘導(dǎo)14 d 時，經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，茜素紅S染色，顯微鏡觀察，拍照。

2.6 Real time RT-PCR檢測

2.6.1RNA抽提 當(dāng)培養(yǎng)的F-BMSCs融合度達(dá)到80%～90%時，消化并調(diào)整細(xì)胞濃度5×107·L-1接種至6孔板中，每孔培養(yǎng)體系為2 mL。培養(yǎng)24 h后，不同組別更換培養(yǎng)基，每孔加入2 mL相應(yīng)培養(yǎng)基。設(shè)置陰性對照組：含PBS(與加入藥物等體積)的完全培養(yǎng)基；誘導(dǎo)組：含PBS(與加入藥物等體積)的誘導(dǎo)液；供試品組：含1 g·L-1骨肽原液的誘導(dǎo)液。每2～3 d 更換新鮮的各組培養(yǎng)基。分別在第誘導(dǎo)6、8 d 時，用TRIzol裂解并提取各組細(xì)胞RNA。

2.6.2cDNA鏈的合成 每組取1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備得到cDNA用于后續(xù)實驗。

2.6.3Real time RT-PCR 利用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0 進(jìn)行引物設(shè)計，內(nèi)參為GAPDH。引物信息見下Tab 1。

以SYBR Green定量的Real time-PCR方法檢測基因表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參，采用法計算mRNA的相對表達(dá)水平(根據(jù)2-△Ct法計算樣品中檢測基因相對于內(nèi)參基因GAPDH的相對表達(dá)量，具體算法如下：相對表達(dá)量=2-(Ct檢測基因-Ct GAPDH))。

Tab 1 Primer sequences used for real-time PCR

2.7 Western blot檢測當(dāng)培養(yǎng)的F-BMSCs融合度達(dá)到80%～90%時，消化細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度5×107·L-1接種至6孔板中，每孔培養(yǎng)體系為2 mL。培養(yǎng)24 h后，不同組別更換培養(yǎng)基，每孔加入2 mL相應(yīng)培養(yǎng)基。設(shè)置陰性對照組：含PBS(與加入藥物等體積)的完全培養(yǎng)基；誘導(dǎo)組：含PBS(與加入藥物等體積)的誘導(dǎo)液；供試品組：含1 g·L-1骨肽原液的誘導(dǎo)液。每2d ～3 d 更換新鮮的各組培養(yǎng)基。

在誘導(dǎo)第6 d、8 d、10 d時，使用細(xì)胞蛋白裂解液裂解細(xì)胞，并將收取的蛋白樣品置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。各組蛋白樣品采用SDS-PAGE電泳后，濕轉(zhuǎn)，并將濕轉(zhuǎn)后的硝酸纖維素膜封閉，然后膜與一抗(1 ∶ 1 000)4 ℃孵育過夜后，與二抗(1 ∶ 10 000)室溫孵育1 h，最后用化學(xué)發(fā)光液顯色成像。

3 實驗結(jié)果

3.1 促UMR106細(xì)胞增殖作用骨肽原液藥物濃度在0.06～2.0 g·L-1范圍內(nèi)對UMR106細(xì)胞的影響具體結(jié)果詳見Fig 1。廠家A的骨肽原液對UMR106細(xì)胞無促進(jìn)增殖作用；廠家B、C、L的骨肽原液對UMR106細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用，且在0.06～1.0 g·L-1范圍內(nèi)對UMR106細(xì)胞增殖作用呈時間-劑量依賴性。

3.2 F-BMSCs免疫表型檢測各表面標(biāo)志蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞占細(xì)胞總體的比例：CD73為99.6%，CD90為99.0%，CD105為98.5%，均大于95%；各表面標(biāo)志蛋白表達(dá)陰性的細(xì)胞占細(xì)胞總體的比例：CD11b/CD19/CD34/CD45/HLA-DR為0%。測定結(jié)果符合目前國際干細(xì)胞協(xié)會提出的干細(xì)胞鑒別標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果詳見Fig 2。

3.3 CCK-8法檢測骨肽原液對F-BMSCs的影響CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒測定結(jié)果表明，廠家A、B、C、L四個生產(chǎn)廠家的骨肽原液，在1.0 g·L-1濃度作用下，對F-BMSCs的增殖未見明顯改變。具體測定結(jié)果詳見Fig 3。

Fig 1 Effect of proliferation on UMR106 cells of ossotide stock solution from four n=3)

Fig 2 Expression rate of various surface marker proteins of F-BMSCs

Fig 3 Effect of proliferation on F-BMSCs of ossotide stock solution from four manufacturers n=6)

A,B,C,L :represent for manufacture A,B,C,L

3.4 骨肽原液對F-BMSCs誘導(dǎo)成骨ALP活性檢測F-BMSCs誘導(dǎo)7 d 時，與陰性對照組相比，誘導(dǎo)組F-BMSCs的ALP活性為(1.40±0.046)mmol·L-1，明顯增加(P<0.05)，表明誘導(dǎo)成功。與誘導(dǎo)組相比，供試品組中廠家C骨肽原液處理的F-BMSCs ALP活性明顯增高分別為(2.46±0.148)mmol·L-1，差異有顯著性(P<0.05)；廠家B、L骨肽原液處理的F-BMSCs ALP活性高于誘導(dǎo)組，但差異無顯著性(P>0.05)。具體結(jié)果詳見Fig 4。

3.5 茜素紅S礦化結(jié)節(jié)染色F-BMSCs誘導(dǎo)第14 d，與陰性對照組相比，誘導(dǎo)組F-BMSCs茜素紅染色呈陽性，表明誘導(dǎo)成功F-BMSCs。與誘導(dǎo)組相比，肉眼觀察供試品組(廠家B、C、L)骨肽原液處理的F-BMSCs紅色明顯增強(qiáng)；顯微鏡下，廠家B、C、L骨肽原液處理的F-BMSCs茜素紅染色陽性結(jié)節(jié)狀覆蓋面積增多。染色結(jié)果見Fig 5。

Fig 4 Effect of ossotide stock solution on ALP

**P<0.01vsblank group;#P<0.05vscontrol group. Blank for negative group, control for osteoinduction group;A,B,C,L for ossotide group(manufacturer A,B,C,L).

3.6 Real time RT-PCR測定結(jié)果F-BMSCs誘導(dǎo)6 d時，與陰性對照組相比，誘導(dǎo)組、供試品組(廠家B)F-BMSCs中成骨分化標(biāo)志物基因OPN、OCN、Runx2、ALP的mRNA表達(dá)量無明顯變化；誘導(dǎo)8 d 時，供試品組F-BMSCs 上述mRNA的表達(dá)量增加，且高于誘導(dǎo)組。檢測結(jié)果見Fig 6。

3.7 Western blot檢測結(jié)果F-BMSCs誘導(dǎo)第6～8 d 時，與陰性對照組相比，誘導(dǎo)組與供試品組(廠家B)F-BMSCs的Runx2、Osteocalcin(OCN)蛋白表達(dá)均增加，但兩組無明顯差別；誘導(dǎo)第10 d 時，供試品組F-BMSCs Runx2、OCN蛋白表達(dá)明顯高于誘導(dǎo)組。檢測結(jié)果見Fig 7。

4 討論

BMSCs作為骨組織工程的常用細(xì)胞，具有成骨細(xì)胞群的增殖和分化行為，即高ALP活性和形成礦化骨基質(zhì)的能力。BMSCs在體外向成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化時，大致主要經(jīng)歷細(xì)胞增殖期和細(xì)胞分化期：首先根據(jù)細(xì)胞所在微環(huán)境進(jìn)行譜系定向；繼而進(jìn)入細(xì)胞增殖階段；之后為成骨早期，細(xì)胞分泌大量ALP，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成熟；最后為成骨后期，即基質(zhì)礦化階段，成熟的成骨細(xì)胞礦化活力增加，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化，形成鈣化結(jié)節(jié)[7-8]。因而，ALP及礦化結(jié)節(jié)分別是BMSCs向成骨細(xì)胞分化的早期及晚期的特異性標(biāo)志。因此，ALP活性測定和茜素紅染色是成骨分化最為常用的鑒定手段[9]。本研究選取4個不同生產(chǎn)廠家的骨肽原液進(jìn)行成骨分化實驗，部分廠家的骨肽原液作用于BMSCs后，供試品組F-BMSCs的ALP活性及茜素紅染色均較誘導(dǎo)組明顯增強(qiáng)，且兩指標(biāo)測定結(jié)果基本一致。表明骨肽原液可一定程度促進(jìn)BMSCs的成骨作用。

Fig 5 Results of Alizarin red staining assay. Blank for negative group, control for osteoinduction group.

Fig 6 The expression results of osteogenic differentiation related marker genes detected by RT-PCR after osteogenic induction of F-BMSCs by ossotide (manufacturer B)

Blank for negative group, control for osteoinduction group.

Fig 7 The expression results of osteogenic differentiation related protein detected by Western blot after osteogenic induction of F-BMSCs by ossotide (manufacturer B)

Blank for negative group, control for osteoinduction group, B for ossotide group(manufacturer B).

成骨相關(guān)基因的表達(dá)亦是BMSCs 向成骨細(xì)胞分化的特點，這是體內(nèi)成骨的典型特征。ALP、Runx2、OCN、OPN等基因是成骨細(xì)胞標(biāo)志基因。成骨分化過程中，ALP、Runx2、OCN、OPN等成骨相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，這些基因在成骨分化不同時期表達(dá)，調(diào)控骨基質(zhì)的分泌和礦化。其中，Runx2 是 Runx 家族的轉(zhuǎn)錄因子之一，可與許多其他轉(zhuǎn)錄因子和共調(diào)節(jié)因子在其靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中相互作用，是成骨分化和骨形成過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，亦是骨形成過程中早期并最具特征性的標(biāo)志蛋白[10-12]。OCN是由成熟成骨細(xì)胞分泌的最豐富的非膠原蛋白之一，促進(jìn)骨形成礦化物質(zhì)沉積的正常鈣化，維持骨的正常礦化速率，與羥磷灰石結(jié)合抑制其結(jié)晶的形成，并抑制軟骨細(xì)胞礦化的速率，從而促進(jìn)骨組織礦物質(zhì)沉積的正常鈣化過程，是成骨細(xì)胞分化晚期的特異性指標(biāo)[13-14]。實驗結(jié)果顯示：與誘導(dǎo)組相比，BMSCs細(xì)胞經(jīng)骨肽原液處理后，可使得ALP、Runx2、OCN、OPN基因的 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，Runx2、OCN蛋白表達(dá)量增加，表明骨肽原液具有促進(jìn)誘導(dǎo)F-BMSCs成骨細(xì)胞分化的作用。

此外，本研究采用王燦等[6]報道的骨肽類藥物體外活性測定方法，對4個生產(chǎn)廠家的骨肽原液進(jìn)行活性測定，測定結(jié)果顯示廠家A生產(chǎn)的骨肽原液對UMR106細(xì)胞無促進(jìn)增殖作用；廠家B、C、L生產(chǎn)的骨肽原液對UMR106細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用，且在一定劑量范圍內(nèi)對UMR106細(xì)胞增殖作用呈時間-劑量依賴性。以上結(jié)果表明，骨肽原液的生物活性高低與其促進(jìn)BMSCs誘導(dǎo)成骨作用的強(qiáng)弱基本一致。

綜上所述，骨肽原液可通過上調(diào)ALP、Runx2、OCN、OPN等成骨相關(guān)標(biāo)志基因，促進(jìn)Runx2、OCN等成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)骨形成的活性作用。