吳儀,湖南中醫(yī)藥大學 湖南省長沙市 410208

龍承星,湖南人文科技學院數(shù)學與金融學院 湖南省婁底市 417000

0 引言

泄瀉肝氣乘脾證,古稱腸風饗泄,病機為土虛木乘,典型特征為瀉前或瀉時必有腹痛、瀉后痛減,且與情志不暢呈正相關(guān)關(guān)系[1].中醫(yī)在認識及治療泄瀉肝氣乘脾具有特色和優(yōu)勢,隨著醫(yī)學模式的發(fā)展到生物-心理-社會醫(yī)學模式,人們逐漸認識到心理應激所致的心身疾病其發(fā)生發(fā)展與肝脾不調(diào)證密切相關(guān),而泄瀉肝氣乘脾即是其中典型而又常見的一種[2].根據(jù)臨床調(diào)查,泄瀉肝氣乘脾證是泄瀉中最常見的類型,因此對泄瀉肝氣乘脾的研究具有較強的臨床意義.泄瀉肝氣乘脾造模采用番瀉葉-束縛夾尾法,以番瀉葉灌胃及饑飽失常造成脾虛體質(zhì)[3],出現(xiàn)腹瀉及精神不振等表現(xiàn),又以隨機、頻繁束縛夾尾模擬心理應激,使動物產(chǎn)生煩躁、焦慮等情志不暢表現(xiàn),造成肝氣不暢病機,從而進一步橫逆犯脾,加重脾虛,刺激泄瀉,使其總體表現(xiàn)為泄瀉肝氣乘脾證.中醫(yī)認為脾胃為“氣血生化之源”、“后天之本”,與血液和衛(wèi)氣關(guān)系密切;肝主疏泄,主藏血,與凝血功能相關(guān),且課題組前期研究發(fā)現(xiàn)脾虛泄瀉造模對血常規(guī)有一定的影響.本實驗經(jīng)建立泄瀉肝氣乘脾模型,探究造模對小鼠血常規(guī)及臟器系數(shù)的影響,有一定的理論依據(jù)及研究基礎.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：雄性SPF級昆明種小鼠20只[湖南斯萊克斯實驗有限公司,動物許可證編號為：SCXK(湘)2016-0002],質(zhì)量為18-22 g.動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物實驗中心,屏障環(huán)境動物房(室溫23 ℃-25 ℃,相對濕度47%-53%,12 h光照/12 h黑暗).實驗單位使用許可證編號為：SYXK(湘)2015-0003.

1.1.2 藥物：番瀉葉煎煮液制備：番瀉葉(安徽毫藥千草國藥股份有限公司,批號：1703228) 500 g,煎煮得濃度為1 g/mL番瀉葉水煎液,4 ℃保存以備用.

1.1.3 模型制備：按參考文獻[4],正常組每天上午灌純凈水7 d (17.5 mL/kg·d),模型組每天上午灌番瀉葉水煎液7 d (17.5 mL/kg·d),每次灌胃前均禁食12 h.下午模型組用離心管束縛并夾尾1 h,長尾夾取小鼠尾巴遠端1/3處夾住,正常組不做處理.晚上所有組別均撤食,自由飲水.連續(xù)7 d,小鼠出現(xiàn)情緒暴怒,躁動不安、伴有腹瀉便溏即模型制備成功.

1.1.4 動物分組：將20只小鼠適應性飼養(yǎng)2 d后隨機分成2組,正常組10只與模型組10只.

1.2 方法

1.2.1 小鼠一般狀態(tài)觀察：實驗過程中仔細觀察比較小鼠有無發(fā)生泄瀉及泄瀉的特點,情緒及行為有無異常,肛門有無異常.觀察并記錄小鼠體重進食、飲水、精神狀態(tài)、毛發(fā)狀態(tài)等一般狀態(tài).

1.2.2 血樣檢測：于采血前12 h禁食,前1 h禁水,摘除眼球采血1-1.5 mL,注入EDTA-K2抗凝管中,混勻送檢至湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科.

1.2.3 小鼠免疫器官的測定：造模結(jié)束后,小鼠稱重,頸椎脫臼處死,迅速解剖取出主要臟器(肝、脾、胸腺),剔除脂肪和筋膜,用濾紙吸干表面的液體,并參考文獻[5]計算相應的臟器指數(shù)：脾臟指數(shù)=脾臟體質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100%,胸腺指數(shù)=胸腺體質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100%,肝臟指數(shù)=肝臟體質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100%.

統(tǒng)計學處理用SPSS 21.00軟件進行分析.各組所得計量數(shù)據(jù)均采用mean±SD表示,均用獨立樣本t檢驗.P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀態(tài)觀察 實驗過程中正常組小鼠的飲水正常,食欲佳,皮毛平整有光澤,糞便柔軟成型,干濕適中,呈黑褐色,肛周干凈.造模2 d后,模型組小鼠排便變稀或便溏,排便次數(shù)增加,情緒激動,開始出現(xiàn)打斗現(xiàn)象,呈站立姿態(tài),毛發(fā)豎起.造模第4-5天,模型組小鼠大便溏稀,且肛周不潔,肛門紅腫,常有糞便附著,頻頻出現(xiàn)爬籠、站立姿勢,下午束縛夾尾時便溏量多而頻繁.造模第7天,模型組小鼠灌胃抵抗增強,情緒依舊激動,暴躁易怒.與泄瀉肝氣乘脾證癥狀基本相符.

2.2 泄瀉肝氣乘脾造模對小鼠血常規(guī)的影響

2.2.1 泄瀉肝氣乘脾造模對小鼠血小板的影響：由表1可知,模型組血小板計數(shù)(platelet count,PLT)、血小板比容(platelet specific volume,PCT)均低于對照組且具有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.05).實驗結(jié)果表明造模對血小板平均體積、血小板分布寬度無影響.

2.2.2 泄瀉肝氣乘脾造模對小鼠紅細胞的影響：由表2可知,模型組紅細胞計數(shù)、紅細胞比容較正常組低,但差異不明顯(P＞0.05);模型組紅細胞平均體積、紅細胞分布寬度變異系數(shù)、紅細胞分布寬度標準差與正常組之間無明顯差別.

2.2.3 泄瀉肝氣乘脾造模對小鼠血紅蛋白的影響：由表3可知,與正常組相比,模型組紅細胞平均血紅蛋白濃度升高且具有顯著性差異(P＜0.05);模型組血紅蛋白含量、紅細胞平均血紅蛋白含量升高或降低,但差異不顯著(P＞0.05).造模對小鼠紅細胞功能無影響.

2.2.4 泄瀉肝氣乘脾造模對小鼠白細胞的影響：由圖1可知,與正常組相比,模型組小鼠白細胞計數(shù)降低且具有顯著性差異(P＜0.05).

2.3 泄瀉肝氣乘脾造模對小鼠臟器的影響 從表4可知,經(jīng)造模處理小鼠后,模型組小鼠胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)均低于正常組,其中模型組胸腺系數(shù)與正常組相比具有顯著性差異(P＜0.05).肝臟系數(shù)方面模型組雖高于正常組,但與正常組相比不具有顯著性差異(P＞0.05).

3 討論

肝氣乘脾證病機為土虛木乘,即機體脾胃功能降低、肝氣旺盛而導致肝脾功能失調(diào)出現(xiàn)泄瀉.土虛主要體現(xiàn)在脾氣虛,運化失常,癥狀表現(xiàn)在食欲降低、精神不佳、免疫力下降.木旺體現(xiàn)在情志的不暢,癥狀表現(xiàn)在情緒易怒、煩躁、不穩(wěn)定.《黃帝內(nèi)經(jīng)·營衛(wèi)生會第十八》云“人受氣于谷,谷入于胃,以傳與肺,五臟六腑,皆受其氣.其清者為營,濁者為衛(wèi),營在脈中,衛(wèi)在脈外”.此條文說明了以下兩個觀點,一為脾胃為“后天之本”,為“氣血生化之源”,故脾胃之異常會影響到血液生成與運行,一般來說,脾虛會導致脾氣的生成不足甚至導致血液的生成不足.二為脾胃與機體免疫功能也密切相關(guān),中醫(yī)認為衛(wèi)氣是人體內(nèi)具有抵御外邪、保護機體功能的一類精微物質(zhì),并有觀點認為衛(wèi)氣是“免疫細胞”的中醫(yī)表達形式[6,7].脾胃是衛(wèi)氣的重要生成來源,脾胃與衛(wèi)氣的關(guān)系可以表達為“脾胃—營衛(wèi)—脾胃”反饋調(diào)節(jié)機制[8],即脾胃與衛(wèi)氣能相互作用而非單向作用.而在肝氣乘脾證當中究竟對脾與肝產(chǎn)生什么樣的影響,通過本次實驗可說明.

3.1 泄瀉肝氣乘脾造模對小鼠血液指標的影響可以在一定程度上反應模型的成功 本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：模型組小鼠PLT、PCT均低于正常小鼠,說明泄瀉肝氣乘脾模型降低小鼠凝血功能.泄瀉肝氣乘脾證中一個重要的影響因素為情志不暢,造模過程中夾尾束縛造成小鼠情緒的暴躁甚至抑郁,李自越等[9]的研究認為：應激刺激會引起垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)興奮,糖皮質(zhì)激素分泌增加,從而PLT增加,而PCT的升高是因為PLT的升高.中醫(yī)認為肝的重要生理功能為肝主疏泄,調(diào)暢氣機,調(diào)節(jié)精神情志,同時還能貯藏血液;若肝發(fā)為病理,則主要表現(xiàn)為疏泄與藏血功能失常[10],泄瀉肝氣乘脾造模對肝臟功能的影響主要體現(xiàn)在肝氣旺盛,情志受到刺激.故PCT、PLT的降低可能與肝臟疏泄失常及藏血功能失常有關(guān).但同時根據(jù)本課題組《番瀉葉所致脾虛泄瀉小鼠血常規(guī)的研究》發(fā)現(xiàn)番瀉葉會降低小鼠的血小板數(shù)量,但對其他血液指標沒有影響,故究竟是番瀉葉還是應激刺激導致小鼠血小板降低需要進一步實驗證明.白細胞是機體內(nèi)負責防御的一類重要細胞,具有抵御外邪的功能,相當于中醫(yī)學中“衛(wèi)氣”發(fā)揮的一部分作用,與脾臟功能密切相關(guān),課題組前期脾虛造模并未發(fā)現(xiàn)白細胞水平降低到的趨勢,而李盛強等[11]研究表明,脾虛證犬類中白細胞較正常組明顯降低且差異顯著(P＜0.01),考慮白細胞水平的降低可能與小鼠脾胃受損影響衛(wèi)氣的生成有關(guān).但無法排除研究中情志刺激對白細胞降低的影響,或是肝脾兩者共同作用導致,因此有望今后在本研究基礎上進一步探究,為臨床提供一定的指導意義.

表1 各組血小板的變化情況比較(mean±SD)

表2 各組紅細胞的變化情況比較(mean±SD)

表3 各組血紅蛋白的變化情況比較(mean±SD)

表4 各組小鼠臟器的變化情況比較(mean±SD)

圖1 各組白細胞的變化情況比較.與正常組比較,aP＜0.05.

3.2 泄瀉肝氣乘脾造模降低了小鼠免疫功能 模型組小鼠胸腺指數(shù)的降低說明泄瀉肝氣乘脾造模降低了小鼠免疫功能[12,13],李云等[14]實驗表明,脾虛模型的小鼠胸腺指數(shù)明顯低于正常組且差異顯著(P＜0.5);結(jié)合上述對白細胞的分析,本次實驗組證明了泄瀉肝氣乘脾造模降低了小鼠免疫力(衛(wèi)氣/脾氣),降低了凝血功能(肝藏血功能),與中醫(yī)學“先傷氣后傷血(先傷陽后傷陰)”的觀點不謀而合;對脾虛及肝氣乘脾客觀化及臨床指導提供了一定依據(jù).

3.3 不足與展望 本次實驗方法簡單,從臨床檢查角度僅對血常規(guī)及臟器系數(shù)進行分析,但結(jié)果表明泄瀉肝氣乘脾模型值得進一步研究,除了再深入探究肝、脾對血常規(guī)、免疫力的影響外,還可進一步在本研究基礎上對腸道菌群及腸道消化酶進行分析.

文章亮點

實驗背景

中醫(yī)藥治療泄瀉肝氣乘脾證十分有效,但目前對泄瀉肝氣乘脾證的機制研究極少.本研究創(chuàng)新性的于肝主疏泄、主藏血理論基礎上探究泄瀉肝氣乘脾證對機體血常規(guī)以及臟器系數(shù)的影響.

實驗動機

泄瀉肝氣乘脾證的病理機制及模型建立研究不夠深入,從血常規(guī)角度研究該模型,有助于更好的理解泄瀉肝氣乘脾證,為臨床提供指導,為模型提供輔助指標.

實驗目標

在一定程度上輔助泄瀉肝氣乘脾模型的建立,探究模型對血常規(guī)及臟器系數(shù)的影響,為臨床提供一定的參考.

實驗方法

本研究采用“番瀉葉-束縛夾尾法”7 d制備泄瀉肝氣乘脾小鼠模型,并使用血常規(guī)檢測、臟器系數(shù)測定,選擇獨立樣本t檢驗進行兩組間比較.

實驗結(jié)果

模型組小鼠血小板計數(shù)、血小板比容均顯著性低于正常組小鼠,造模降低了小鼠凝血功能;模型組白細胞計數(shù)、胸腺系數(shù)顯著性低于正常組小鼠,說明造?？赡軐γ庖呦到y(tǒng)產(chǎn)生影響.

實驗結(jié)論

泄瀉肝氣乘脾造模降低了機體凝血功能,與肝臟功能的損害密切相關(guān).在一定程度上能反應模型的成功,并可能對小鼠免疫系統(tǒng)功能產(chǎn)生影響.

展望前景

泄瀉肝氣乘脾證型中醫(yī)治療效果明顯,西醫(yī)對癥支持治療具有局限性,研究該證型的中醫(yī)病理機制對臨床具有潛在意義.

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