柯宏基，李向民，陳傅曉,3，樊佳偉，王永波,3，譚 圍,3

(1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306； 2.海南省海洋與漁業(yè)科學院，?？?571126； 3.熱帶海洋生物資源利用與保護教育部重點實驗室，海南三亞 572022)

彈涂魚(Periophthalmusmodestus)棲息于海邊灘涂處及紅樹林等區(qū)域[1]，其肉質細嫩，味道鮮美，營養(yǎng)價值豐富[2]，不僅具有較高的經濟價值，其作為沿海灘涂特色小型魚類還具有獨特的生態(tài)研究價值 。近年來由于海域環(huán)境的惡化，彈涂魚的生存環(huán)境受到影響，資源數量下降，因此保護彈涂魚資源勢在必行。

COⅠ基因是線粒體氨基酸編碼基因，具有結構簡單、進化速率適中、母系遺傳等特點，廣泛應用于遺傳多樣性、遺傳結構、物種鑒定等方面的研究[3-4]。李瑜等[5]采集廣東省珠海市淇澳島的青彈涂魚(Scartelaoshistophorus)、大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)和大鰭彈涂魚(Periophthalmusmagnuspinnatus)，分析這些物種個體的核基因RAG1以及線粒體基因COⅠ的序列，得出種間遺傳距離最大的是大鰭彈涂魚與青彈涂魚，大鰭彈涂魚相比大彈涂魚和青彈涂魚遺傳多樣性最高。廖健等[6]基于COⅠ和D-loop區(qū)序列分析了雷州半島紅樹林海區(qū)2種野生彈涂魚的遺傳變異，結果表明彈涂魚種群遺傳多樣性高于大彈涂魚，目前海南島彈涂魚的相關研究較少[7]。本研究擬通過對海南島8個不同群體的彈涂魚COⅠ基因序列進行分析，以期揭示不同群體之間的遺傳多樣性及遺傳結構差異，為彈涂魚遺傳多樣性保護等工作提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及擴增測序

彈涂魚群體于2018—2019年分別在?？?簡稱HK)、澄邁(簡稱CM)、臨高(簡稱LG)、儋州(簡稱DZ)、昌江(簡稱CJ)、東方(簡稱DF)、樂東(簡稱LD)、三亞(簡稱SY)野外人工捕捉。樣本活體運輸至海南省海洋與漁業(yè)科學院瓊海科研基地，取背部肌肉組織于75%的乙醇中保存24 h，更換為 95%乙醇保存 24 h，最后于無水乙醇中常溫保存。采用TAKARA DNA提取試劑盒提取8個群體236尾彈涂魚的基因組 DNA，其中海口30尾、澄邁30尾、臨高30尾、儋州30尾、昌江30尾、東方29尾、樂東30尾、三亞27尾。DNA樣品經 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，保存于-20 ℃冰箱中備用。彈涂魚線粒體COⅠ基因擴增所用引物序列如下[8]：cox F：5′-TCAACCAACCACAAAGACAATGGCAC-3′；cox R：5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′，擴增程序為：94 ℃ 預變性1 min 20 s；94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 50 s，30個循環(huán)，72 ℃下延伸 5 min。PCR 產物經電泳檢測后，送至廣州艾基生物技術有限公司進行雙向測序。

圖1 采樣點示意圖Fig.1 Map of sampling locations

1.2 數據分析

測序完成后，用SeqMan拼裝校對COⅠ基因序列。通過 MEGA 7.0軟件對測序結果進行比對分析。采用軟件DNASP 6.0計算序列變異位點數、單倍型數目、單倍型多樣性和核苷酸多樣性等遺傳參數；利用MEGA 7.0軟件分析序列的堿基組成，基于Kimura 2-parameter模型計算群體內及群體間的遺傳距離，采用鄰接法 (neighbor-joining，NJ)構建彈涂魚單倍型鄰接關系進化樹[9]，節(jié)點支持率采用 Bootstrap 1 000 次重復檢驗置信度；利用 Arlequin 3.11軟件計算兩兩群體間的遺傳分化指數(Fst) ，并進行分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA)，用于遺傳變異和地理結構特點研究；使用核苷酸不配對分析(mismatch distribution) 和中性檢驗(neutrality tests) 來檢測海南彈涂魚的種群歷史動態(tài)，利用 Network 5.0軟件構建單倍型網絡圖，分析單倍型之間的進化關系。種群擴張時間(T) 利用公式τ=2ut進行估算，其中t表示種群擴張至今所經歷的代數，T=t×代時，代時為研究對象的生殖周期；τ為擴張時間參數;u=μk，μ為線粒體COⅠ基因變異速率;k表示序列長度。

2 結果與分析

2.1 序列分析

實驗共獲得236條彈涂魚COⅠ基因片段序列，序列長度為621 bp，序列組成顯示平均 A、T、G、C堿基含量分別為 31.2% 、26.3%、26.0%、16.4%，A+T(57.5%)含量高于G+C(42.4%)的含量，236個樣本檢測到59個單倍型，發(fā)現了54個變異位點(表1)，占總位點數的8.7%，25個單變異位點，29個為簡約信息位點。

2.2 彈涂魚遺傳多樣性

各地理群體的單倍型數、多態(tài)位點數、單倍型多樣性和核苷酸多樣性數據結果見表1，8個群體的單倍型數在12～15種，其中以HK、CM、LG、DF 4個群體單倍型最多，有15種單倍型，單倍型數從高到低依次為 HK、CM、LG、DF群體(15種)、CJ群體(14種)、LD、SY群體(13種)、DZ群體(12種)。

單倍型多樣性指數在0.805～0.919 之間，核苷酸多樣性指數在 0.003 23～0.006 15 之間。平均核苷酸差異數為2.002～3.813，其在DF群體中最多為 3.813個，在DZ群體中最少為 2.002個?？傮w單倍型多樣性為0.861±0.019；由單倍型參數可知，DF群體的單倍型多樣性最為豐富，單倍型多樣性為0.919±0.030；LD群體單倍型多樣性最低，單倍型多樣性為0.805±0.070；8個群體的單倍型多樣性均大于0.500，屬于高水平?？傮w核苷酸多樣性為0.004 39±0.000 24；由核苷酸參數可知，DF群體的核苷酸多樣性最為豐富，核苷酸多樣性為0.006 15±0.000 65；DZ群體核苷酸多樣性最低，核苷酸多樣性為0.003 23±0.000 57；8個群體只有DF和CM兩個群體的核苷酸多樣性大于0.005 00，其余群體均小于0.005 00，屬于低水平。結果顯示，8個群體中DF和CM群體具有較高的遺傳多樣性，其余群體遺傳多樣性相對較低。

2.3 單倍型在群體中的分布

在236條彈涂魚COⅠ基因片段序列中共檢測到59個單倍型(表2)，其中17個為共享單倍型，其余42個為獨有單倍型。單倍型Hap1和Hap4為所有群體的共享單倍型，Hap1出現頻次最高，分布于80個樣本中，占總樣本數的33.9%。Hap6為7個群體共享(HK、CM、 LG、DZ、CJ、DF、LD)，Hap10為7個群體共享(HK、CM、 LG、DZ、CJ、DF、LD)，Hap3為6個群體共享(HK、CM、CJ、DF、LD、SY)，Hap19為5個群體所共享(CM、CJ、DF、LD、SY)，Hap5為4個群體所共享(HK、LG、DZ、LD)，Hap12為4個群體共享(HK、LG、DZ、SY)，Hap14為4個群體共享(HK、CM、LG、CJ)，其余共享單倍型分別為2～3個群體共享。在獨有單倍型中HK群體有6個(Hap2、Hap8、Hap9、Hap11、Hap13、Hap15)，CM群體有6個(Hap16、Hap18、Hap20、Hap21、Hap22、Hap24)，LG群體有7個(Hap25、Hap26、Hap27、Hap28、Hap29、Hap30、Hap32)，DZ群體有5個(Hap33、Hap34、Hap35、Hap37、Hap38)，CJ群體有3個(Hap39、 Hap40、Hap42)，DF群體有6個(Hap44、Hap45、Hap46、Hap48、Hap49、Hap50),LD群體有4個(Hap51、Hap52、Hap53、 Hap54),SY群體有5個(Hap55、Hap56、Hap57、Hap58、Hap59)。

2.4 遺傳分化

利用 Network5.0 軟件分析彈涂魚單倍型之間的進化關系(圖2)：單倍型沒有按不同地理群體形成獨立的分支，而是星形放射狀結構。單倍型在各群體的分布狀況如圖2所示，共享單倍型約占所有單倍型的28.8%(17/59)， 其中 Hap1和Hap4 由8個群體共享。

8個彈涂魚群體的種內和種間遺傳距離見表3所示。從表3中可以看出，彈涂魚群體內的遺傳距離為0.003～0.006，群體間的遺傳距離為0.003～0.006，CM和DF以及CJ和DF群體的遺傳距離最大(0.006)，其余群體之間的遺傳距離在0.004～0.005之間。

群體間Fst分析結果顯示：兩兩群體間的Fst值在 -0.023 54～0.060 42之間(表4)，除了SY與LG、DF群體Fst大于0.05且小于0.15(SY與LG群體差異極顯著，SY與DF群體差異顯著),其余群體Fst均小于0.05?；蛄骶笥?或小于0 。

8個彈涂魚地理群體的AMOVA結果(表5)顯示，群體間的遺傳變異僅占所有遺傳變異的極少部分，絕大部分的遺傳變異(99.36%)來源于群體內部;Fst為0.006 37,基因流為77.992 94，表明群體間基因交流頻繁，不存在明顯的遺傳分化。

2.5 彈涂魚的種群歷史動態(tài)

中性檢驗結果(表6)表明全部群體Tajima’sD值均為負值，其中LG、DZ、SY群體差異顯著；Fu’sFS值均為負值，DF群體差異顯著，其余群體差異極顯著?；贏rlequin核苷酸不配對分析圖表明，HK、DZ、CJ、SY群體為單峰狀(圖4)。DZ群體SSD (sum of square deviations)檢驗顯著，其他群體SSD和r(Harpending’s raggedness index)這兩個統(tǒng)計檢驗不顯著(表7)。

表2 彈涂魚單倍型的地理分布Tab.2 Distribution of haplotypes of 8 Periophthalmus modestus populations from the Hainan Island

圖2 彈涂魚 mtDNA COⅠ單倍型網絡結構圖Fig.2 Haplotype network of Periophthalmus modestus based on COⅠ of mtDNA

表3 基于 COⅠ基因序列的彈涂魚群體遺傳距離Tab.3 Genetic distances within/among Periophthalmus modestus populations based on COⅠ

注: 對角線表示群體內遺傳距離，對角線下為群體間遺傳距離。HK:?？冢?CM:澄邁； LG:臨高； DZ:儋州； CJ:昌江； DF:東方； LD:樂東； SY:三亞

Note: The diagonal stands for the genetic distance within populations and genetic distance among populations is below the diagonal. HK:Haikou； CM:Chengmai； LG:Lingoao； DZ:Danzhou； CJ:Changjiang； DF:Dongfang； LD:Ledong； SY:Sanya

表4 彈涂魚遺傳分化指數(對角線下方)和基因交流值(對角線上方) Tab.4 Matrix of pairwise Fst (below diagonal) and Nm (above diagonal) among populations of Periophthalmus modestus

注:*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。HK:?？?； CM:澄邁； LG:臨高； DZ:儋州； CJ:昌江； DF:東方； LD:樂東； SY:三亞

Note:*means significant differences (P<0.05);**means extremely significant differences (P<0.01). HK:Haikou； CM:Chengmai； LG:Lingoao； DZ:Danzhou； CJ:Changjiang； DF:Dongfang； LD:Ledong； SY:Sanya

圖3 彈涂魚COⅠ單倍型鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining tree for COⅠ haplotypes of Periophthalmus modestus

表5 彈涂魚群體遺傳差異的AMOVA分析Tab.5 Analysis of molecular variance (AMOVA) among populations of Periophthalmus modestus

注：Va：群體間方差組分;Vb：群體內方差組分

Note: Va:variance components among populations;Vb:variance components within populations

表6 中性檢驗Tab.6 Neutrality tests

注:*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。HK:?？?； CM:澄邁； LG:臨高； DZ:儋州； CJ:昌江； DF:東方； LD:樂東； SY:三亞

Note:*means significant differences (P<0.05);**means extremely significant difference (P<0.01). HK:Haikou； CM:Chengmai； LG:Lingoao； DZ:Danzhou； CJ:Changjiang； DF:Dongfang； LD:Ledong； SY:Sanya

表7 吻合度檢驗Tab.7 Goodness-of-fit test

注:*表示差異顯著(P<0.05)。HK:海口； CM:澄邁； LG:臨高； DZ:儋州； CJ:昌江； DF:東方； LD:樂東； SY:三亞

Note:*means significant differences (P<0.05). HK:Haikou； CM:Chengmai； LG:Lingoao； DZ:Danzhou； CJ:Changjiang； DF:Dongfang； LD:Ledong； SY:Sanya

3 討論

本研究中，8個彈涂魚群體的單倍型多樣性指數在0.805～0.919之間，核苷酸多樣性指數在0.003 23～0.006 15 之間，總體單倍型多樣性指數為0.861，核苷酸多樣性指數為0.004 39。單倍型多樣性指數和核苷酸多樣性指數都是用來說明遺傳多樣性的重要指標。這兩者的臨界值在0.5(單倍型多樣性指數)和0.005(核苷酸多樣性指數)，越大表明遺傳多樣性越高。根據GRANT和BOWEN[10]提出的4種模式，海南島8個彈涂魚群體分為兩個類型：一是單倍型多樣性高、核苷酸多樣性低，表明在群體瓶頸后快速增長和突變積累；二是單倍型多樣性及核苷酸多樣性都高，表明群體規(guī)模足夠大，長期進化歷史中十分穩(wěn)定，或包含了兩個不同世系的次級結構[11]。海南島群體總體與雷州半島群體[6]及東海群體[12]對比表明：海南島的單倍型多樣性指數和核苷酸多樣性指數均低于雷州半島群體以及東海群體。目前海南島彈涂魚不是主要的經濟食用魚種，影響其生存的主要威脅并非過度捕捉。根據走訪調查發(fā)現，沿海環(huán)境的惡化以及人為活動導致彈涂魚原有的生存環(huán)境發(fā)生改變，而棲息地的退化和消失，使得彈涂魚的分布區(qū)域不斷減少，這可能是彈涂魚種質資源下降的主要原因，因此需要采取相應的保護措施，防止彈涂魚資源進一步退化。

遺傳分化系數Fst是反映群體間遺傳分化程度的重要指標，較高水平的Fst表明其具有較高水平的遺傳分化，當Fst為0～0.05時無分化，0.05～0.15為中度分化，0.15～0.25為高度分化[13]。群體間基因交流值(Nm)一般用來評估兩兩群體間的基因交流是否頻繁。兩個群體頻繁地隨機交配時，出現Nm< 0 或Nm>4；當兩群體達到中等程度分化時，Nm值范圍約為 1～4；當兩群體間基因交流較為匱乏，如隔離的產生使基因交流受阻嚴重時，Nm值范圍約在 0～1 之間[14]。本文群體間Fst分析結果顯示：兩兩群體間的Fst值在 -0.023 54～0.060 42之間，除了SY與LG、DF群體0.05

中性檢驗結果表明，8個群體Tajima’sD值均為負值，其中LG、DZ、SY群體P﹤0.05；Fu’sFS值均為負值，DF群體差異顯著，其余群體差異極顯著?；贏rlequin不配對分布表明HK、DZ、CJ、SY群體為單峰狀。DZ群體SSD檢驗顯著，其他群體SSD和r這兩個統(tǒng)計檢驗不顯著。由于目前缺乏關于彈涂魚性成熟年齡的準確數據，本研究以與彈涂魚相近的大彈涂魚種類為參考[17]，大彈涂魚性成熟的年齡為1齡，線粒體COⅠ基因進化速率參考為每百萬年 1% ～3%[18]，推算HK群體擴張時間為8.05～2.60萬年前，LG群體擴張時間為24.2～8.1萬年前，DZ群體擴張時間為7.2～2.4萬年前，CJ群體擴張時間為30.6～10.2萬年前，SY群體擴張時間為14.5～4.8萬年前。30.6～2.4萬年前在第四紀，這期間也有其他海洋生物發(fā)生擴張[19]，主要經歷了中國倒數第二次冰期、末次間冰期、末次冰期。第四紀時期海面隨冰期-間冰期的交替而升降變化，寒冷時期大陸冰川發(fā)展，大量淡水結冰停留在陸地冰川中，海面下降；氣候轉暖，冰川溶解，海面升高[20]。這些氣候變化會給生物生存環(huán)境帶來各方面的影響，彈涂魚群體可能受到這些方面的影響從而發(fā)生群體擴張。

本研究對海南島8個彈涂魚群體的分析結果表明，海南島彈涂魚整體遺傳分化程度不高，是一個隨機交配的群體。海南島部分群體經歷過種群擴張，整體遺傳多樣性較低，應加強資源保護。調查中發(fā)現，海南島彈涂魚資源分布區(qū)域基本同海南省近岸海域生態(tài)保護紅線劃定重疊，因此，嚴格遵守生態(tài)保護紅線和環(huán)境質量底線，對今后彈涂魚等生物資源的保護將發(fā)揮重要作用。