張 彬，高一切，劉東敏，韓蕓嬌，張媛媛

（1.石家莊學(xué)院 a.人事處；b.化工學(xué)院,河北 石家莊 050035;2.承德市科學(xué)技術(shù)情報(bào)研究所,河北 承德 06700）

0 引言

燃料乙醇作為可再生清潔能源，格外受到科學(xué)工作者的青睞.隨著國家各項(xiàng)環(huán)保政策的出臺(tái)以及新能源產(chǎn)業(yè)的興起，使得生物乙醇這類新型可再生能源再次成為研究的熱點(diǎn)[1，2].一直以來，乙醇生產(chǎn)菌大多采用釀酒酵母，其特有的生理特性和發(fā)酵性能可以產(chǎn)生人類需要的乙醇[3].乙醇發(fā)酵過程中釀酒酵母會(huì)受到諸多因素影響，包括溫度、滲透壓以及產(chǎn)物抑制作用，其中產(chǎn)物的抑制作用對(duì)乙醇的生產(chǎn)能力制約最為強(qiáng)烈.因此，通過提高生產(chǎn)菌株的耐受性可以進(jìn)一步提高乙醇的產(chǎn)量，從而提高乙醇的產(chǎn)率，降低企業(yè)的生產(chǎn)成本.

本研究采用的是自然分離篩選和紫外誘變育種相結(jié)合的方法[4]，從白酒酒糟中分離篩選出長勢(shì)優(yōu)良的純種酵母，對(duì)其進(jìn)行紫外誘變，通過耐受性實(shí)驗(yàn)，篩選出具有高耐受性的乙醇生產(chǎn)菌株，從而達(dá)到提高乙醇產(chǎn)率、減少能耗和降低成本的目的.

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 材料與試劑

酒糟由五糧液酒廠提供；新啤酵母（實(shí)驗(yàn)室保藏），丹啤酵母（實(shí)驗(yàn)室保藏）；無水葡萄糖（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；酵母膏（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；瓊脂（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；青霉素（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院）；三苯基四氮唑鹽酸鹽（TTC）（成都百事興科技實(shí)業(yè)有限公司）；蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）.

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基及種子培養(yǎng)液：酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（YPD）液體培養(yǎng)基（20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，1%酵母膏）；平板分離及斜面保藏用培養(yǎng)基：YPD固體培養(yǎng)基（20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，20 g/L瓊脂，10 g/L酵母膏）；初篩：TTC上層培養(yǎng)基（TTC 0.05 g，葡萄糖0.5 g，瓊脂 0.5 g，100 mL無菌水）；TTC 下層培養(yǎng)基：YPD固體培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基（YFM）（150 g/L的葡萄糖，5 g/L的酵母膏）.

1.3 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9052，天津順諾股份有限公司）；搖床（MX-YZ，金壇市梅香儀器有限公司）；超凈臺(tái)（SW-CJ-1Cu，鄭州宏朗有限公司）；紫外分光光度計(jì)（UV-6100BS，上海美普達(dá)股份有限公司）；紫外誘變儀（CBIO-OV4，北京賽百奧科技有限公司）；高溫滅菌鍋（LX-B100L，合肥華泰有限公司）；乙醇計(jì)（武強(qiáng)縣華鷗儀器儀表廠）.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 酵母的分離篩選

2.1.1 取樣

準(zhǔn)確稱取10 g酒糟，加入150 mL無菌水，共10組，120 r/min下懸搖10 min，紗布過濾后用于富集培養(yǎng)[5].

2.1.2 富集培養(yǎng)

移取菌液5 mL加入裝有150 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，添加適量青霉素，于30℃、120 r/min下進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每48 h接種一次，重復(fù)3次后進(jìn)行分離純化.

分別取一環(huán)新啤酵母和丹啤酵母接入到盛有150 mL富集培養(yǎng)基中重復(fù)上述操作.

2.1.3 分離純化

移取1 mL富集好的菌液，在裝有10 mL無菌水的試管中稀釋7次，然后吸取0.1 mL稀釋好的菌液涂布于分離培養(yǎng)基平板上，30℃下恒溫培養(yǎng)24 h，挑取具有典型酵母菌落特征的菌落至YPD斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行劃線分純并保藏.

2.1.4 初篩

分別取分離得到的菌株各一環(huán)依次接入到TTC下層培養(yǎng)基中，30℃下恒溫培養(yǎng)24 h，長出菌落后將上層培養(yǎng)基倒在下層培養(yǎng)基上，30℃恒溫、陰暗放置2～3 h.產(chǎn)乙醇能力較強(qiáng)酵母菌具有可還原TTC的特性，使其變?yōu)樯罴t色，根據(jù)這一特性篩選出長勢(shì)良好的菌落，接種于斜面培養(yǎng)基中低溫保存.

2.1.5 復(fù)篩

分別接一環(huán)斜面培養(yǎng)基中的菌種于種子培養(yǎng)液中，于30℃、170 r/min條件下的生物搖床中培養(yǎng)24 h.取4 mL菌懸液接入裝有80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐角瓶中，于30℃下的恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵24 h，計(jì)算其產(chǎn)氣情況及乙醇含量.

2.1.6 紫外誘變

取復(fù)篩后的酵母菌接種于種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，45℃下處理20 min，然后取5 mL菌液于無菌平板中進(jìn)行紫外垂直照射（紫外燈功率15 W，照射距離20 cm，照射時(shí)間30 min），然后對(duì)菌液進(jìn)行富培、分離、純化，并對(duì)菌體進(jìn)行鏡檢.

2.2 酵母的耐受性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 耐受性實(shí)驗(yàn)

2.2.1.1 耐熱性實(shí)驗(yàn)

取一環(huán)菌種于發(fā)酵培養(yǎng)基中分別在30，35，40，45℃條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)48 h，觀察菌種生長情況.

2.2.1.2 耐乙醇濃度實(shí)驗(yàn)

分別設(shè)置種子培養(yǎng)液的乙醇起始濃度為0%，4%，6%，8%，12%，16%，于30℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌種生長情況，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液吸光值.

2.2.1.3 耐糖度實(shí)驗(yàn)

分別設(shè)置發(fā)酵培養(yǎng)基糖起始濃度為150，250，350，450 g/L，30℃下培養(yǎng)48 h，用密度瓶法測(cè)定菌液生長情況.

2.2.2 乙醇濃度測(cè)定

采用密度瓶法計(jì)算發(fā)酵液中乙醇的含量.用干凈恒重后的100 mL容量瓶準(zhǔn)確稱取發(fā)酵液100 mL，倒入蒸餾瓶中，用50 mL蒸餾水分多次潤洗容量瓶，沖洗液也全部倒入蒸餾瓶中.連接冷凝裝置，使用恒溫水浴鍋控制溫度為80℃，室內(nèi)溫度不高于25℃，開啟冷凝水，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行緩慢加熱蒸餾.蒸餾操作完成后將收集的餾出液倒入100 mL容量瓶中，調(diào)節(jié)瓶?jī)?nèi)的液溫至20℃，用蒸餾水定容至100 mL，備用.反復(fù)對(duì)密度瓶進(jìn)行清洗、干燥、稱量等操作，至其恒重.將煮沸并冷卻的蒸餾水注滿處理好的密度瓶，插上溫度計(jì)，浸于20℃恒溫水浴鍋中恒溫處理，瓶中液溫達(dá)到20℃，并保持5 min以上不變時(shí)，取出密度瓶，用濾紙吸取支管中溢出的水，蓋好小帽，用擦鏡紙擦拭干凈后放入分析天平進(jìn)行稱量.將水倒凈，用備好的餾出液樣品潤洗密度瓶2～3次，注滿密度瓶，重復(fù)以上操作步驟.20℃發(fā)酵液餾出液的密度ρ液利用式（1）計(jì)算：

式中ρ液表示發(fā)酵液餾出液在20℃時(shí)的密度，g/L；m表示密度瓶質(zhì)量，g；m1表示20℃密度瓶于注滿密度瓶蒸餾水的總質(zhì)量，g；m2表示20℃密度瓶于注滿密度瓶發(fā)酵液餾出液的總質(zhì)量，g.最終發(fā)酵液的乙醇濃度可通過對(duì)照表（20℃）查得.

3 結(jié)果與分析

酒糟中分離的菌株經(jīng)初篩和復(fù)篩得到兩株生產(chǎn)乙醇能力較強(qiáng)的酵母菌，編號(hào)分別為223和261，通過紫外誘變選育得到菌株Z223和Z261，以丹啤酵母和新啤酵母作為對(duì)照樣，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

3.1 幾種酵母菌耐熱性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 酵母對(duì)高溫的生長耐受性結(jié)果

對(duì)篩選菌株、誘變菌株和對(duì)照菌株進(jìn)行耐熱性實(shí)驗(yàn)，測(cè)試其在30～50℃范圍內(nèi)的生長情況，結(jié)果如表1所示，從表1可以看出，在30℃下，誘變菌株Z223和Z261、原始菌株223和261以及對(duì)照菌株丹啤、新啤均生長良好，超過40℃對(duì)這幾種酵母菌的生長都有一定的影響，在50℃下，都沒有生長現(xiàn)象，總的來說，這幾種酵母菌的耐熱性能沒有明顯差異.

表1 溫度對(duì)菌落生長的影響

表2 不同溫度下酵母菌的吸光值變化

3.1.2 酵母菌在不同溫度下的生長情況

將6種酵母菌置于不同溫度下進(jìn)行液體培養(yǎng)，并于560 nm測(cè)定吸光度值，結(jié)果如表2所示，從表2可以看出，誘變菌株Z223和Z261的活力較高，在各溫度下進(jìn)行培養(yǎng)其吸光值明顯高于其他4株酵母菌，說明這兩株酵母菌活力較強(qiáng)，在相同的條件下生長得到的菌液濃度較高.

3.1.3酵母菌在不同溫度下乙醇生產(chǎn)能力比較

對(duì)6種酵母菌在不同溫度下的乙醇生產(chǎn)能力（乙醇濃度）進(jìn)行測(cè)定，所得結(jié)果見表3，從表3可以看出，菌株Z223、Z261、223和261與對(duì)照組相比都具有較好的乙醇生產(chǎn)能力，在高溫下誘變得到的菌株Z223、Z261表現(xiàn)出更好的乙醇生產(chǎn)能力.

綜上所述，和對(duì)照組相比，菌株Z223、Z261、223和261在高溫下具有更好的生長能力和乙醇生產(chǎn)能力，在這4株酵母菌中誘變菌株Z223的高溫耐受性和生產(chǎn)性能更好.

3.2 幾種酵母菌乙醇耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 酵母菌對(duì)乙醇的生長耐受情況

將6種酵母菌分別接種入不同乙醇濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)其生長情況進(jìn)行記錄，結(jié)果如表4所示，從表4可以看出，相比于對(duì)照組，菌株Z223、Z261、223和261具有更好的乙醇耐受性.尤其是菌株223和Z223在12%乙醇濃度的培養(yǎng)基中仍然能夠生長繁殖.

3.2.2 酵母菌在不同乙醇濃度下的生長情況

將6種酵母菌在含不同乙醇濃度的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，之后測(cè)定吸光度值，結(jié)果如表5所示，由表5可知，隨著培養(yǎng)基乙醇濃度的增加，酵母菌生長受抑制的現(xiàn)象明顯，說明高濃度乙醇對(duì)酵母的生長繁殖有一定的抑制作用.菌株223和誘變菌株Z223在高濃度乙醇存在的情況下，仍然具有較好的生長繁殖能力，尤其是菌株Z223，相較于對(duì)照組，其乙醇耐受力良好.

表3 發(fā)酵溫度對(duì)酵母菌生產(chǎn)乙醇能力的影響%

表4 乙醇濃度對(duì)菌落生長的影響

3.3 幾種酵母菌糖耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 酵母菌對(duì)糖濃度的生長耐受情況

蔗糖在酵母發(fā)酵過程中會(huì)轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳，在適宜糖濃度的范圍內(nèi)，糖濃度越高，乙醇濃度也就相對(duì)增加，但是如果糖濃度過高，就會(huì)改變酵母細(xì)胞滲透壓，抑制菌株生長[6].將6種酵母菌分別培養(yǎng)在不同糖濃度的培養(yǎng)基中，觀察其生長情況，結(jié)果見表6，通過表6可以看出，發(fā)酵起始糖濃度在150 g/L和250 g/L的時(shí)候所有菌株長勢(shì)均良好，當(dāng)起始糖濃度達(dá)到350 g/L時(shí)，菌株生長勢(shì)頭逐漸趨緩，在450 g/L的條件下，菌株223、261和對(duì)照菌株已經(jīng)停止生長繁殖，而菌株Z223和Z261在高濃糖溶液中長勢(shì)較好.

3.3.2 酵母菌在不同糖濃度下乙醇生產(chǎn)能力比較

對(duì)6種酵母菌在不同起始糖濃度下的發(fā)酵性能進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表7所示，從表7可以看出，當(dāng)培養(yǎng)液中糖濃度為250 g/L，各酵母菌的乙醇生產(chǎn)能力都達(dá)到高峰，再增加糖濃度，乙醇生產(chǎn)能力反而會(huì)下降.菌株Z233和Z261在高糖濃度下的乙醇生產(chǎn)性能要優(yōu)于其他4種酵母菌.說明經(jīng)誘變得到的酵母菌對(duì)乙醇的耐受性較好.

表5 不同乙醇濃度下酵母菌的吸光值變化

表6 糖濃度對(duì)菌落生長的影響

表7 糖濃度對(duì)酵母菌生產(chǎn)乙醇能力的影響%

4 結(jié)論

通過自然分離篩選法從白酒酒糟中分離篩選出長勢(shì)優(yōu)良的兩株酵母菌223和261，分別經(jīng)過紫外誘變，得到誘變菌株Z223和Z261.通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，誘變菌株Z223和Z261具有較好的高溫耐受性和高糖耐受性，菌株Z233具有較為突出的乙醇耐受性，可以在12%乙醇濃度下進(jìn)行生長繁殖，具有很好的應(yīng)用前景，可作為工作化生產(chǎn)菌株使用.