張 彬，張 弦，趙 華，顧宇峰，周 躍，金愛萍，譚曉慧，張海峰

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院1 感染性疾病科；2 影像中心，江蘇226001）

不明原因發(fā)熱（FUO）鑒別診斷一直是困擾臨床醫(yī)生，尤其是感染性疾病科醫(yī)生的問題，其病因常見三大類:感染、風(fēng)濕免疫性疾病、惡性腫瘤等[1]。有時(shí)會因機(jī)體免疫反應(yīng)失控導(dǎo)致類似全身炎癥反應(yīng)表現(xiàn)，重癥者甚至累及多個臟器系統(tǒng)而發(fā)生多器官功能障礙（MODS）。臨床上識別感染性發(fā)熱對合理用藥，尤其抗菌藥物具有重要意義。本研究選擇2018 年7月—2019 年10 月我院收治的51 例不明原因發(fā)熱患者，觀察宏基因組學(xué)二代測序（mNGS）技術(shù)在病原檢測中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 不明原因發(fā)熱51 例，其中男性33例，女性 18 例；年齡 15～79 歲，平均 54.57±16.73 歲；發(fā)熱時(shí)間 12～35 天，平均 19.82±4.93 天。納入標(biāo)準(zhǔn):（1）在我院經(jīng)1 周以上全面系統(tǒng)的發(fā)熱病因篩查未能明確者；（2）非免疫力缺陷患者。系統(tǒng)篩查包括血、尿、大便三大常規(guī)，大便隱血試驗(yàn)，肝、腎功能，電解質(zhì)，血糖，血、尿、痰培養(yǎng)，血清自身抗體、全胸片（或胸部CT）和腹部B 超等。

1.2 標(biāo)本留取 根據(jù)患者臨床表現(xiàn)以及實(shí)驗(yàn)室篩查結(jié)果，經(jīng)醫(yī)患充分溝通，患方簽署針對mNGS 高額費(fèi)用知情同意書及采信院外檢查結(jié)果知情同意書。于停用抗菌藥物12 小時(shí)以上發(fā)熱時(shí)，留取可疑部位血液、尿、痰或肺泡灌洗液、骨髓、腦脊液等標(biāo)本，一份送本院微生物室作細(xì)菌培養(yǎng)，另留一份mNGS 標(biāo)本外送華大基因檢測公司作病原學(xué)檢測。mNGS 標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)輸嚴(yán)格按照該公司標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范執(zhí)行。

1.3 病原學(xué)mNGS 檢測

1.3.1 標(biāo)本處理和DNA 提取:血液標(biāo)本離心后取300 μL 血漿，痰液或肺泡灌洗液經(jīng)玻璃珠混合震蕩后取0.5～3 mL，腦脊液取300 μL。使用TIANamp Micro DNA Kit（DP316，TIANGEN BIOTECH，Beijing，China），根據(jù)試劑盒說明書提取DNA（用作DNA 文庫構(gòu)建），應(yīng)用超聲破碎至200～300 bp 的片段備用。

1.3.2 文庫構(gòu)建和測序、數(shù)據(jù)分析:使用Agilent 2100 Bioanalyzer 質(zhì)控文庫、Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.）質(zhì)控 DNA 文庫，文庫經(jīng)環(huán)化后再滾環(huán)復(fù)制（RCA）形成DNB 納米球，然后加載至測序芯片，應(yīng)用BGISEQ-500 進(jìn)行高通量mNGS 測序。測序所得原始結(jié)果中去除質(zhì)量低的數(shù)據(jù)，通過所得高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對BWA:（http://biobwa.sourceforge.net/）去除人參考基因組序列和低復(fù)雜度結(jié)果（Reads），最后參照微生物大數(shù)據(jù)庫，將比對后的數(shù)據(jù)按照細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體/衣原體等分類羅列形成初步實(shí)驗(yàn)室報(bào)告。對于與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果明顯不符、高度懷疑的病原學(xué)mNGS 結(jié)果，采用PCR 擴(kuò)增/Sanger 測序驗(yàn)證。

1.4 臨床解讀 臨床醫(yī)生依據(jù)患者病情、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查以及經(jīng)驗(yàn)，全面分析細(xì)菌培養(yǎng)、mNGS病原檢測報(bào)告，區(qū)分非無菌部位定植與感染，去除mNGS 背景病原檢測假陽性結(jié)果，確定FUO 相關(guān)致病病原體。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。應(yīng)用四格表計(jì)算傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和mNGS 病原二代測序的敏感性，特異性，陽性、陰性預(yù)測值和約登指數(shù)（Youden index）；病原學(xué)mNGS 與傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果比較采用配對χ2檢驗(yàn)，兩種方法診斷結(jié)果的一致性采用Kappa 檢驗(yàn)，并統(tǒng)計(jì)病原微生物檢出診斷效能。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床標(biāo)本陽性檢測結(jié)果 血、骨髓、腦脊液、痰液、肺泡灌洗液等標(biāo)本病原mNGS 檢出的病原體數(shù)量和種類明顯多于傳統(tǒng)培養(yǎng)，見表1。傳統(tǒng)培養(yǎng)和mNGS 檢測將1 例4573746 患者診斷為白假絲酵母菌和嗜麥芽窄食單孢菌混合感染；1 例4493789 患者mNGS 檢測發(fā)現(xiàn)煙曲霉、尖端賽多孢子菌，但培養(yǎng)僅煙曲霉陽性；另2 例患者培養(yǎng)示肺炎克雷伯菌，但其中1 例3871916 患者mNGS 檢測發(fā)現(xiàn)除肺炎克雷伯菌，尚有產(chǎn)黃青霉，另1 例4033977 患者還發(fā)現(xiàn)嗜麥芽窄食單孢菌感染；1 例4412395 患者培養(yǎng)出白假絲酵母菌，而mNGS 未檢測到；1 例患者痰標(biāo)本培養(yǎng)示鮑曼不動桿菌，但病原mNGS 另外還檢測到人類腺病毒7 型。值得一提的是，傳統(tǒng)方法無法培養(yǎng)病毒，而病原mNGS 在20 例患者標(biāo)本中檢測出6 種病毒:乙型肝炎病毒、單純皰疹病毒1 型、人類皰疹病毒7 型、巨細(xì)胞病毒、EB 病毒和人類腺病毒7 型。1例患者標(biāo)本中檢測到鸚鵡熱支原體。

2.2 病原mNGS 與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測陽性率及一致性 表1 按病原體分類列出傳統(tǒng)培養(yǎng)和病原mNGS檢測結(jié)果，傳統(tǒng)培養(yǎng)共檢出細(xì)菌8 例（結(jié)核分枝桿菌1 例），真菌 4 例；相比之下，病原 mNGS 在 30 份標(biāo)本中鑒定出60 個病原體，其中細(xì)菌22 例（結(jié)核分枝桿菌4 例）、真菌12 例。結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)和病原mNGS檢測，在30 例標(biāo)本中鑒定出25 種病原體。依據(jù)臨床表現(xiàn)、血常規(guī)、PCT、hCRP、前期經(jīng)驗(yàn)性治療效果，最終判定病原mNGS 結(jié)果，見表2。病原mNGS 檢測陽性率41.18%（21/51），高于傳統(tǒng)培養(yǎng)陽性率23.53%（12/51），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012）。Kappa 一致性檢驗(yàn)表明，病原mNGS 與傳統(tǒng)培養(yǎng)診斷結(jié)果存在一般一致性（Kappa=0.524，P＜0.001）。

表1 mNGS 與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測病原體陽性結(jié)果比較 例

表2 病原學(xué)mNGS 與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測細(xì)菌、真菌陽性結(jié)果比較

2.3 桑格（Sanger）一代測序驗(yàn)證 在本研究中當(dāng)傳統(tǒng)培養(yǎng)與病原mNGS 結(jié)果不符，尤其是后者陽性病原體多于2 種時(shí)，應(yīng)用桑格一代測序行病原體驗(yàn)證測試，結(jié)合臨床表現(xiàn)、原有經(jīng)驗(yàn)性治療療效判定致病病原體，結(jié)果顯示病原mNGS 與Sanger 驗(yàn)證病原體檢測一致性為100%。

2.4 兩種方法的診斷效能 如果沿用傳統(tǒng)培養(yǎng)作為診斷細(xì)菌（結(jié)核分枝桿菌）、真菌感染金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)表2，病原mNGS 檢測細(xì)菌、真菌的靈敏度，特異性，陽性預(yù)測值，陰性預(yù)測值和約登指數(shù)分別為91.67%，74.36%、52.38%、96.67%、0.6603。如果將mNGS 檢測到的病毒、支原體計(jì)算在內(nèi)，檢測陽性率從傳統(tǒng)培養(yǎng)的 23.53%（12/51）增至 60.78%（31/51）。提示病原mNGS 技術(shù)在同時(shí)檢測細(xì)菌、真菌、病毒和支原體等不易培養(yǎng)的病原體方面具有明顯優(yōu)勢。

3 討 論

不明原因發(fā)熱（FUO）病因鑒別非常重要，只有篩查出非感染性發(fā)熱者，才能減少不必要的抗菌藥物暴露和治療費(fèi)用，對臨床合理使用抗菌藥物具有積極意義[2]。傳統(tǒng)檢測感染病原體主要依靠血液、體液、組織等培養(yǎng)以及分子生物學(xué)診斷技術(shù)，微生物培養(yǎng)目前仍是感染病原診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但臨床上并非所有病原體都可通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法識別。此外，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法存在耗時(shí)長、不同病原體需不同培養(yǎng)基、陽性率過低等缺陷。分子生物學(xué)診斷方法，如酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）原位雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、一代桑格測序以及MALDI-TOF MS 均依賴于病原體核酸的已知序列[3]，ELISA 基于抗原-抗體反應(yīng)，這些檢測方法每次檢測僅識別有限甚至特定的病原體種類。

近年來尋找更理想的感染病原學(xué)檢測方法成為研究熱點(diǎn)。高通量mNGS 既往在遺傳性疾病、肝炎、炎癥性腸病和惡性腫瘤等臨床中獲得應(yīng)用[4]，隨著該技術(shù)更快的檢測周期和費(fèi)用降低而用于病原微生物的篩查。與傳統(tǒng)培養(yǎng)相比，病原mNGS 檢測幾乎達(dá)到“一網(wǎng)打盡”效果，能同時(shí)敏感識別不同類病原體，尤其在細(xì)菌感染合并真菌、病毒、支原體、衣原體或原蟲等感染時(shí)更具顯著意義。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)同一患者需同時(shí)排查所有病原體時(shí)，mNGS 檢測可使陽性率從傳統(tǒng)培養(yǎng)的23.53%（12/51）增高至60.78%（31/51）；與傳統(tǒng)培養(yǎng)比較，mNGS 檢測陽性病原體增加了 8 種細(xì)菌、3 種真菌、6 種 DNA 病毒、1 種支原體。兩種方法的細(xì)菌、真菌診斷結(jié)果存在明顯差異，發(fā)現(xiàn)10 例標(biāo)本傳統(tǒng)培養(yǎng)為陰性，但mNGS 檢測為陽性，結(jié)合臨床表現(xiàn)、經(jīng)驗(yàn)性治療療效等判定為感染者。其原因可能在留取標(biāo)本前懷疑細(xì)菌、真菌感染，已經(jīng)驗(yàn)性使用抗菌藥物，導(dǎo)致病原微生物不易培養(yǎng)，而mNGS 可檢出更微量的病原體核酸，具有更廣的微生物譜。傳統(tǒng)培養(yǎng)僅能檢測到一種優(yōu)勢病原體，而其他合并感染的病原體可能被抑制而無法檢出，而mNGS 更高的敏感性使得病原體檢出更全面。如本研究中4493789 患者傳統(tǒng)培養(yǎng)僅檢出煙曲霉，而mNGS 還同時(shí)發(fā)現(xiàn)煙曲霉和尖端賽多孢子菌；另2例患者培養(yǎng)示肺炎克雷伯菌，但mNGS 發(fā)現(xiàn)其中3871916 患者尚合并產(chǎn)黃青霉，4033977 患者合并嗜麥芽窄食單孢菌感染。

文獻(xiàn)[5-7]報(bào)道及本研究結(jié)果均提示mNGS 對病原體檢測較傳統(tǒng)培養(yǎng)敏感性更高，可以幫助感染患者明確診斷。細(xì)菌、病毒等感染患者可表現(xiàn)相似的臨床癥狀，針對病因進(jìn)行正確干預(yù)，對指導(dǎo)抗菌藥物合理使用具有積極作用。當(dāng)然，mNGS 的高敏感性也會帶來一些麻煩。本研究中少部分患者，尤其是危重癥或糖尿病患者，mNGS 從同一標(biāo)本中檢出細(xì)菌、真菌、病毒等多種病原體，這需要經(jīng)驗(yàn)豐富的臨床醫(yī)生在區(qū)分定植致病病原微生物后，依據(jù)讀取病原體條帶數(shù)，結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、經(jīng)驗(yàn)性治療效果、血常規(guī)、PCT、CRP 等檢查結(jié)果，確定可能的病原體。同時(shí)需注意不同來源標(biāo)本陽性結(jié)果的價(jià)值有差異，與體外相通體腔留取的標(biāo)本，如痰液標(biāo)本陽性，尤其存在多部位感染時(shí)，需區(qū)分定植與感染，而無菌體液如腦脊液、血液標(biāo)本則不存在這類困擾。

感染病原mNGS 檢測存在不足之處，除可能出現(xiàn)的假陽性外，儀器設(shè)備昂貴、檢測技術(shù)要求高等原因使其難以在各家醫(yī)院普及[8]，多數(shù)醫(yī)院需與檢測公司合作，外送標(biāo)本定點(diǎn)檢測。mNGS 測試周期雖然比傳統(tǒng)培養(yǎng)短，一般在72 小時(shí)內(nèi)出具報(bào)告，但這對于重癥感染患者來說時(shí)間過長，直接影響患者精準(zhǔn)治療與預(yù)后。目前mNGS 檢測費(fèi)用高，難以成為感染性病原常規(guī)診斷方法。mNGS 已成功用于鑒定某些病毒感染[9-10]，但目前外送標(biāo)本異地集中檢測，途中RNA 易降解，致RNA 病毒檢出率較低。隨著公司布點(diǎn)增多、技術(shù)進(jìn)步，縮短檢測周期和降低檢測費(fèi)用，有望病原mNGS 檢測在臨床上廣泛開展，更好地服務(wù)發(fā)熱患者。