陳 雅，袁德義，鄒 鋒，朱周俊，李艷民，張默涵

（中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室，湖南 長沙 410004）

油茶Camellia oleifera，山茶科Theaceae 山茶屬Camellia植物，我國特有的木本食用油料樹種，與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界4 大木本油料植物，被譽為“東方的橄欖樹”[1-2]。油茶葉作為重要的營養(yǎng)生長器官，提供了生殖生長所需的能量和物質(zhì)的來源[3-4]，也是衡量植物生長發(fā)育好壞的重要標志。葉片表型特征是遺傳育種、經(jīng)濟作物栽培等方面所涉及的內(nèi)容之一[5]。呂天星等[6]研究發(fā)現(xiàn)蘋果雜交后代的葉片性狀呈現(xiàn)明顯衰退趨勢，存在廣泛變異。胡位榮等[7]指出梨樹雜交后代的葉片大小是由多基因控制的數(shù)量性狀，葉面積和葉橫縱徑出現(xiàn)不明顯的偏小遺傳。刁松峰等[8]對柿樹雜交F1 代14 個葉片數(shù)量性狀測定發(fā)現(xiàn)，14 個數(shù)量性狀符合多基因控制數(shù)量性狀遺傳特征，存在較明顯的非加性效應(yīng)解體的影響。葉乃興等[9]根據(jù)F1 群體葉片性狀測定，推測茶樹葉片形態(tài)性狀屬于數(shù)量性狀，受多基因控制。王東雪等[10]對“岑軟24 號×湘林210”雜交F1 代進行葉表型性狀的遺傳變異特征分析，發(fā)現(xiàn)其中10個性狀的中親優(yōu)勢值為正值，葉面積、葉周長、葉長和葉片干物質(zhì)含量這4 個性狀的超親優(yōu)勢值為正值。與此同時，育種中利用相關(guān)性進行選擇，可以加快選育速度及提高選育質(zhì)量。王金星等[11]對核桃進行研究發(fā)現(xiàn)，葉寬、葉面積和葉形指數(shù)與單果質(zhì)量呈顯著相關(guān)的關(guān)系。張緒萍等[12]對香梨雜種后代測定葉片性狀及葉片和果實性狀進行相關(guān)性分析，指出葉面積與葉長、葉寬、果實縱徑和果形指數(shù)呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系。因此，研究油茶種間雜交F1 代葉片性狀及其遺傳變異特征對其育種具有重要意義。目前國內(nèi)學(xué)者主要對油茶的果實經(jīng)濟性狀進行遺傳變異分析[13]，對油茶種間雜交后代葉片性狀遺傳變異特征等相關(guān)遺傳學(xué)方面的研究少見報道。對此，本文從形態(tài)學(xué)角度分析了攸縣油茶C.yuhsienensisHu[14]和普通油茶‘華碩’C.oleifera‘Huashuo’[15]種間雜交F1 代的葉片表型多樣性，旨在弄清油茶雜交后代葉片表型性狀的變異特征，探究葉片性狀的遺傳規(guī)律，為進一步研究油茶新種質(zhì)的遺傳多樣性及雜交育種的開發(fā)與利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 親本和后代材料

2012年11月中下旬，正值油茶盛花期，采集‘華碩’的花粉并貯藏備用。2013年2月，選擇母本攸縣油茶發(fā)育良好的花蕾。上午去除待授粉的攸縣油茶花苞中全部雄蕊后，進行人工授粉并套袋，做標記，7 d 左右后拆袋。當年10月下旬果實成熟，收獲150 余粒雜交種子。2014年3月，雜交種子播種和育苗，單株標號隨機定植在苗圃地。2017年，獲得攸縣油茶×普通油茶‘華碩’種間雜交F1 代單株（4 a），共47 株，單株以YH-1，YH-2,…, YH-47 表示（表1）。雜交F1 代株行距為 3 m×4 m，統(tǒng)一常規(guī)水肥管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 數(shù)量性狀的測定

2017年11月對親本和F1 群體的數(shù)量性狀進行調(diào)查，包括葉長、葉寬、葉型指數(shù)（葉長/葉寬）、葉面積、葉厚、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量、葉片含水率、比葉重、葉頂角、葉基角和葉柄長等12個數(shù)量性狀。具體統(tǒng)計方法參見覃柳輝的方法[16]。雜種優(yōu)勢以中親優(yōu)勢（Hm）和中親優(yōu)勢率（RHm,%）來表示[17]。某一性狀的平均值（Fm）與雜交F1 代親本的平均值（中親值，MPV）之差分別被確定為某一性狀的中親優(yōu)勢，其公式分別為：

表1 親本材料及雜交后代編號和名稱Table 1 Parent material and hybrid progeny numbers and names

1.2.2 質(zhì)量性狀的測定

選擇4 種表型的質(zhì)量性狀，包括新葉顏色、葉背腺點、葉形和葉緣形態(tài)，并進行目測比較，再對性狀予以賦值。具體統(tǒng)計方法參見文獻[18]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0 等數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件對12 個數(shù)量性狀的變異系數(shù)（CV）進行分析，描述油茶雜交F1 代群體中12 個數(shù)量性狀的離散程度并檢驗數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布；采用Shannon-Weinner 多樣性指數(shù)H'來反映雜交后代群體質(zhì)量性狀的遺傳多樣性水平，并參考劉新龍等人[19]的方法，公式為：

式中：Pi為性狀i編碼值出現(xiàn)的頻率。

聚類分析采用離差平方和方法[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交F1 代葉片12 個數(shù)量性狀的變異情況及遺傳表現(xiàn)

攸縣油茶×普通油茶‘華碩’雜交F1 代葉片數(shù)量特征值見表2。攸縣油茶×普通油茶‘華碩’F1 代葉片的12 個數(shù)量性狀具有不同的離散變異程度，其中變異系數(shù)＞20%為葉干質(zhì)量、葉鮮質(zhì)量、葉頂角和葉柄長；變異系數(shù)介于10%～20%之間為葉面積、比葉重、葉厚、葉片含水率、葉基角、葉長和葉寬；變異系數(shù)＜10%為葉型指數(shù)。這表明雜交后代出現(xiàn)的分離情況相對較大，這在一定程度上為更深層的遺傳分析提供了良好的遺傳差異基礎(chǔ)。

從表1 中的K值和Sig 值及F1 群體各葉片相關(guān)性狀的分布（圖1）可以看出，12 個數(shù)量性狀表現(xiàn)出良好連續(xù)性的正態(tài)分布，表明它們可能屬于多基因控制的數(shù)量性狀。除葉厚、葉柄長和葉面積外，葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量、葉片含水率、葉長、葉寬、葉型指數(shù)、比葉重、葉基角和葉頂角的中親優(yōu)勢值達到極顯著水平。F1 群體中，葉干質(zhì)量、比葉重、葉型指數(shù)、葉長、葉面積和葉厚的中親優(yōu)勢率為正值，范圍為1.80%～25.93%，這些性狀分別相當于中親值的123.3%、131.3%、131.1%、106.0%、104.0%和102.9%。其中，超高親本F1 個體分別占27.66%、89.36%、80.85%、2.13%、6.38%和17.02%。而葉鮮質(zhì)量、葉片含水率、葉寬、葉柄長、葉基角和葉頂角的中親優(yōu)勢均為負值，范圍為-3.71%～-30.15%，這些性狀的平均值小于中親值，其中葉鮮質(zhì)量、葉寬和葉柄長為趨中變異，介于雙親之間的F1 單株個體分別占93.62%、97.87%和93.62%。其中，葉鮮質(zhì)量高于高親值的F1 個體占F1 代總個體的4.26%，而葉片含水率、葉基角和葉頂角的平均值小于低親值的F1 個體分別占后代材料的97.67%、87.23%和55.23%。

2.2 雜交F1 代葉片4 個質(zhì)量性狀變異情況及遺傳傾向表現(xiàn)

表2 攸縣油茶×普通油茶‘華碩’雜交F1 子代12 個葉片數(shù)量性狀雜種優(yōu)勢表現(xiàn)?Table 2 Heterosis of the leaves twelve phenotypic quantitative traits of F1 generation of C.yuhsienensisHu (♀)×C.oleifera ‘Huashuo’(♂)

圖1 油茶F1 代12 個葉片表型數(shù)量性狀的頻度分布Fig.1 Frequency distribution diagram for 12 quantitative traits in F1 progeny of Camellialeaf morphology

表3 F1 群體葉片表型4 個質(zhì)量性狀頻度分布和多樣性指數(shù)?Table 3 Frequency distribution and diversity index of four phenotypic quality traits of F1 population

攸縣油茶×普通油茶‘華碩’雜交F1 群體葉片質(zhì)量性狀的頻度分布情況和Shannon-Weinner多樣性指數(shù)結(jié)果見表3。油茶雜交后代葉片表型的4 種質(zhì)量性狀在F1 代中出現(xiàn)了明顯的分離。F1 群體中的4 個質(zhì)量性狀的Shannon-Weinner 多樣性指數(shù)的平均值為0.871，其中葉緣形態(tài)的多樣性指數(shù)最高，為1.254；新葉顏色最低，為0.691，這說明油茶雜交后代葉片4 種質(zhì)量性狀在F1 代中多樣性指數(shù)較高，群體內(nèi)不同個體間存在一定的形態(tài)多樣性。F1 群體的葉形為長橢圓形和闊橢圓形，長橢圓形的頻度分布為74.47%，是闊橢圓形的2.92倍，葉形有偏長橢圓形的遺傳趨勢，說明雜交后代呈傾向母本的遺傳傾向；F1 代葉背腺點略明顯和明顯的比重大，葉背腺點趨明顯偏向母本的遺傳趨勢；雜交F1 代中葉緣形態(tài)性狀呈現(xiàn)不同程度的分離，主要是齒銳痕深為主，分別是齒銳痕淺、齒鈍痕淺和齒鈍痕深的4.29、3.75 和14.98 倍，與父本相似性狀的比例是63.83%，說明葉緣形態(tài)有偏向父本的遺傳傾向；新葉顏色是綠色和紅色趨近1:1，分別是53.19%和46.81%，與母本相同的新葉顏色占46.81%，符合孟德爾遺傳規(guī)律。

2.3 F1 代不同葉片性狀間的相關(guān)性分析

對油茶雜交F1 代葉片性狀進行相關(guān)性分析，結(jié)果（表4）表明，質(zhì)量性狀與質(zhì)量性狀之間的相關(guān)性低。4 個質(zhì)量性狀與12 個數(shù)量性狀之間相關(guān)性不高，葉頂角與葉形呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.444，與新葉顏色呈顯著正相關(guān)；新葉顏色與葉寬極顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.453；新葉顏色與葉長顯著負相關(guān)；葉型指數(shù)與葉緣形態(tài)呈顯著正相關(guān)關(guān)系。然而，葉片數(shù)量性狀之間存在錯綜復(fù)雜的關(guān)系：葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量、葉長、葉寬、葉面積和葉柄長5 個性狀之間的相關(guān)達到了顯著和極顯著水平，相關(guān)系數(shù)最高為0.793；比葉重與葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量、葉厚、葉長和葉寬呈顯著或極顯著正相關(guān)；葉型指數(shù)與葉長呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.442，與葉基角呈極顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.530；葉頂角與葉基角呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.423，與葉長和葉寬呈極顯著負相關(guān)。這表明這些數(shù)量性狀間存在密切聯(lián)系，表型是基因型和遺傳本質(zhì)的外部表現(xiàn)，說明其存在一定的遺傳相關(guān)性。不同性狀間的正相關(guān)系數(shù)表明基于一個性狀的選擇也可能同時改良另一個性狀。因此，在篩選葉干質(zhì)量和葉型指數(shù)均高的品種時可以參考葉長指標。

2.4 F1 代葉片表型遺傳距離與聚類分析

利用SPSS19.0 軟件對油茶雜交F1 代個體編號（1，2，3，4，…，47）及雙親本編號（48 和49）的16 個表型性狀進行聚類分析，在遺傳距離為20.00 處將其分為Ⅰ和Ⅱ2 個類群（圖2）。在遺傳距離為10.0 處，第Ⅰ大類群分為2 個亞類，分別為Ⅰ-a 亞類和Ⅰ-b 亞類。第Ⅰ大類群是由YH-17、YH-45 等38 份后代材料組成，占后代材料的80.85%，為聚類材料份數(shù)最多的類群。其中Ⅰ-a 亞類由YH-17、YH-45 等20 份后代材料組成，Ⅰ-b亞類由YH-5、YH-6 等18 份后代材料組成。第Ⅰ大類群與母本攸縣油茶聚在一起，這說明38 個雜交后代與母本的親緣關(guān)系更近，形態(tài)表現(xiàn)與母本相似度更高，為偏母型。其中，Ⅰ-b 亞類與母本的親緣關(guān)系最近。第Ⅱ類群是由YH-33、YH-30 等9份后代材料組成，占后代材料的19.15%，與父本普通油茶‘華碩’聚在一起，這說明9 個后代的親緣關(guān)系更接近父本，為偏父型。12 個數(shù)量性狀中，除葉片含水率、葉型指數(shù)、葉基角和葉頂角外，其余8個性狀均表現(xiàn)為：第Ⅰ大類群＞第Ⅱ大類群，在第Ⅰ大類群中葉長、葉寬、葉形指數(shù)、葉干質(zhì)量和葉面積等性狀都表現(xiàn)優(yōu)良。

由表5 可知，在12 個數(shù)量性狀中，除葉片含水率、葉基角和葉頂角外，其余9 個性狀均表現(xiàn)為第Ⅰ大類群優(yōu)于第Ⅱ大類群。在4 個質(zhì)量性狀中，在葉緣形態(tài)方面Ⅰ大類群趨近于齒鈍痕淺狀，而Ⅱ大類群趨近齒銳痕深狀；在葉形方面，Ⅰ和Ⅱ大類群趨長橢圓形；葉片顏色趨勢不明顯；葉片腺點明顯趨近略顯程度。

3 結(jié)論與討論

本研究是利用攸縣油茶和普通油茶‘華碩’進行種間雜交，即雜交親本由于親緣關(guān)系較遠，雜交后代出現(xiàn)廣泛的分離現(xiàn)象會更加明顯。因此，本研究評價了F1 代葉表型變異特征及相關(guān)遺傳關(guān)系，旨在更好地了解攸縣油茶與普通油茶‘華碩’種間雜交F1 代葉表型性狀的變異及多態(tài)性，為油茶后代材料的選擇及其后續(xù)的雜交或回交利用提供理論依據(jù)。

本研究中涉及的葉片表型4 個質(zhì)量性狀表現(xiàn)出較豐富的多樣性，數(shù)量性狀的香農(nóng)-威爾多樣性指數(shù)平均值為0.871，參考劉新龍等人[19]的方法，該研究中葉緣形態(tài)＞1，說明其表現(xiàn)出較豐富的多態(tài)性；葉形、葉背腺點和新葉顏色接近1，說明多樣性處于中等水平；而新葉顏色的多樣性偏低，這說明在F1 代中葉片4 個質(zhì)量性狀的多樣性指數(shù)較高，表現(xiàn)出較豐富的多樣性。在4 個質(zhì)量性狀中，葉形和葉背腺點有偏向母本的遺傳趨勢，表現(xiàn)為母性遺傳，為了進一步確認，下一步的育種工作中應(yīng)進行反交實驗驗證；葉緣形態(tài)有偏離母本的遺傳趨向，說明父本效應(yīng)起的作用大于母本；新葉顏色是綠色和紅色接近1:1，分別是53.19%和46.81%，與母本相同的新葉顏色占46.81%，符合孟德爾遺傳規(guī)律，說明油茶具有基因雜合度高、生長周期長、自交不親和性的特點，因此，開展其性狀遺傳研究，依據(jù)F1 代的性狀表現(xiàn)推測雙親基因型具有可行性，但本研究根據(jù)親本及子代的性狀表現(xiàn)無法確定油茶葉色相對性狀的顯隱關(guān)系，需進一步深入探討。

表4 油茶F1 代葉片不同性狀間的相關(guān)性分析?Table 4 Correlation analysis of different traits of leaves of F1 generation

圖2 油茶雜交親本及子代的聚類分析Fig.2 Clustering analysis of parents and progenies of Camellia

表5 油茶雜交F1 代的不同類群葉片表型性狀均值Table 5 Mean values of leaf phenotype characters in F1 progeny among different groups

本研究中，F(xiàn)1 群體中葉片數(shù)量性狀分離比較廣泛。除葉型指數(shù)外，其余數(shù)量性狀變異系數(shù)大于10%，其中葉干質(zhì)量、葉鮮質(zhì)量、葉尖長、葉頂角和葉柄長的變異系數(shù)大于20%，為強變異[21]； 而葉面積、比葉重、葉厚、葉片含水率、葉基角、葉長和葉寬變異系數(shù)大于10%，為中變異[21]。這為遺傳分析提供了良好的遺傳差異基礎(chǔ)[22]。 同時也表明由于油茶復(fù)雜遺傳背景且雜合度較高，其雜交F1 代葉片表型的數(shù)量性狀表現(xiàn)出比較廣泛的分離特征——具有良好連續(xù)性的正態(tài)分布，符合多基因控制的數(shù)量性狀的遺傳特征。這也驗證了一旦種間雜交基因重組后，非加性效應(yīng)解體[23]。這與前人對柿樹Diospyros kaki[8]、茶樹C.sinensis[9]、油茶C.oleifera[14]和蘋果Malus pumlia[24]等物種的研究基本一致。與此同時，發(fā)現(xiàn)在油茶F1 代中葉片數(shù)量性狀大多處于父母本之間，也有低親和超親現(xiàn)象。本研究中除葉厚、葉柄長和葉面積外，其他10 個數(shù)量性狀的中親優(yōu)勢值均達到了極顯著水平；葉鮮質(zhì)量、葉片含水率、葉寬、葉柄長、葉基角和葉頂角的中親優(yōu)勢均為負，其葉片含水率、葉基角和葉頂角的平均值小于低親值的F1 個體分別占后代材料的97.67%、87.23%和55.23%。顯然，這些性狀存在低親的雜交衰退現(xiàn)象，說明這些在基因重組中非加性效應(yīng)的解體而使多數(shù)個體性狀劣于親本性狀[25]，這可能導(dǎo)致雜種優(yōu)勢的利用受到限制[26]。而葉干質(zhì)量、比葉重、葉型指數(shù)、葉長、葉面積和葉厚的中親優(yōu)勢率為正，其中葉干質(zhì)量、葉長、葉面積和葉厚數(shù)量性狀介于父母本之間，而葉型指數(shù)和比葉重的平均值高于高親值，存在超親現(xiàn)象，這說明重組的基因也將形成新的非加性效應(yīng)，導(dǎo)致超親個體的出現(xiàn)[27]。葉乃興[9]和王東雪等人[10]]研究發(fā)現(xiàn)雜交后代的葉長和葉厚的平均值都超過高值親本平均值，葉寬和葉面積的平均值接近高值親本平均值，與本研究存在一定的差異，這可能是因為不同的雜交組合中親本的異質(zhì)性和其雜種優(yōu)勢表型不同。

通過對雜交F1 代16 個葉片性狀進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，其表現(xiàn)出錯綜復(fù)雜的相關(guān)性。對聚類分析結(jié)果進行分析后發(fā)現(xiàn)，第Ⅰ大類群中葉長、葉寬、葉形指數(shù)、葉干質(zhì)量和葉面積等性狀均表現(xiàn)優(yōu)良，形態(tài)表現(xiàn)與母本相似度更高，為偏母型。根據(jù)王金星等人[11]和張緒萍等人[12]的研究，葉長、葉寬、葉面積和葉形指數(shù)與單果質(zhì)量呈顯著相關(guān)的關(guān)系。這說明第Ⅰ大類群中后代材料可能具有一定的增產(chǎn)潛能，是優(yōu)良單株的備選材料，是進一步開發(fā)利用種質(zhì)資源和選育新品種的基礎(chǔ)材料。

本課題組無法按常規(guī)的人工控制授粉技術(shù)手段創(chuàng)制出普通油茶‘華碩’為母本和攸縣油茶為父本的雜交后代，僅從形態(tài)學(xué)角度分析了攸縣油茶為母本和普通油茶‘華碩’為父本種間雜交F1代的葉片性狀（4 個質(zhì)量性狀和12 個數(shù)量性狀）的分離規(guī)律和遺傳變異特征，因此親本正、反交后在哪些葉片形狀方面有無顯著差異，差異多大等無從得知，進而也無法得知葉片中16 個性狀是細胞核遺傳還是細胞質(zhì)遺傳占主導(dǎo)地位。因此，為創(chuàng)制此組配的雜交后代，下一步應(yīng)探究普通油茶‘華碩’為母本和攸縣油茶為父本這一組合無法成功坐果的原因及改良雜交授粉技術(shù)手段，進而對其正、反交進行差異比較和遺傳估算，從而掌握油茶葉片的遺傳規(guī)律，為提高油茶雜種后代的選擇效果以及油茶育種效率奠定基礎(chǔ)。