張瑩瑩，楊 青，代資舉，王 艷，王新濤

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物設(shè)計中心，河南 鄭州 450002)

葉片是影響植株構(gòu)型的重要因素，同時也是植株進行光合作用的主要器官。合理的葉片結(jié)構(gòu)有利于植株葉片的合理分布，從而影響植株的株型結(jié)構(gòu)以及光合效率[1-3]。葉寬是影響葉片形態(tài)的主要因素，對植株的光合能力有著重要影響。一方面，較窄的葉片有利于透光，但會影響自身對于光的吸收；另一方面，葉片較寬又會影響下層葉片對于光的吸收，從而降低整體的光合效率[4]。因此，研究玉米葉寬形成的分子機制，對于玉米植株株型改良以及光合效率提高有著重要意義。

玉米葉寬是由多基因控制的數(shù)量性狀，目前國內(nèi)外研究者通過QTL定位方法，利用不同的遺傳群體材料對葉寬進行遺傳分析，在10條染色體上均定位到與葉寬相關(guān)的QTL[5-16]。REYMOND等[5]利用F-2與Io構(gòu)建的145個重組自交系(RIL)群體對玉米葉寬進行QTL定位，檢測到9個與葉寬有關(guān)的QTL。鄭祖平等[6]利用Mo17與黃早四為親本構(gòu)建的RIL群體在不同供氮水平下檢測到2個與玉米穗位葉葉寬相關(guān)的QTL，且位于第5號染色體的QTL為主效QTL，可解釋17.32%的表型變異。KU等[7-8]利用分別由Yu82和Shen137以及Yu82和Yu87-1為親本構(gòu)建的2套F2:3群體，共檢測到9個與葉寬相關(guān)的QTL，可解釋表型變異率為4.86%～20.40%。LIU等[9]利用以S-951和Q319為親本構(gòu)建的RIL群體和IF2群體對玉米葉寬進行QTL定位，在3個不同環(huán)境下檢測到47個QTL，可解釋表型變異率為3.5%～17.0%，其中檢測到14個與穗三葉葉寬有關(guān)的QTL，可解釋表型變異率為5.4%～13.4%。

玉米果穗葉及其上下兩葉合稱為穗三葉，其葉面積最大，功能期最長，與玉米籽粒形成時期較為一致，對玉米生長發(fā)育及產(chǎn)量形成有著重要影響，而葉寬又是影響葉片形態(tài)的主要因素[17-18]。因此，研究穗三葉葉寬的遺傳機制可以為玉米株型的遺傳改良提供理論依據(jù)。國內(nèi)外研究人員發(fā)現(xiàn)了許多與玉米穗三葉葉寬有關(guān)的QTL[5-16]，但不同研究中QTL數(shù)目以及位置存在差異，且目前有關(guān)玉米穗三葉葉寬的Meta-QTL分析還鮮有報道。Meta分析可利用統(tǒng)計學(xué)原理對不同來源的QTL進行整合分析，縮小QTL置信區(qū)間，發(fā)掘穩(wěn)定的QTL位點?；诖?，本研究以玉米自交系鄭58和D863F為親本，構(gòu)建了包含241個家系的RIL群體，利用215對SSR標記構(gòu)建遺傳圖譜，在3個不同環(huán)境下對玉米穗三葉葉寬進行QTL分析，檢測穩(wěn)定表達的QTL位點，之后整合不同遺傳群體定位到的有關(guān)玉米穗三葉葉寬的QTL，通過Meta-QTL分析，發(fā)掘控制玉米穗三葉葉寬的一致性QTL(mQTL)，為下一步玉米穗三葉葉寬主效QTL的精細定位和優(yōu)良株型育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以玉米自交系鄭58和D863F為親本，從F2代后采用單粒傳法連續(xù)自交至F7代，構(gòu)建含有241個家系的RIL群體。

1.2 田間試驗及表型數(shù)據(jù)測定

1.3 遺傳圖譜的構(gòu)建

運用CTAB法[19]提取鄭58和D863F及其群體的基因組DNA，篩選出均勻覆蓋玉米10條染色體的SSR標記，并進行多態(tài)性篩選，選出親本間有差異的SSR標記215對，利用這些SSR標記對群體以及親本DNA進行分析。利用JoinMap 4.0軟件進行遺傳圖譜繪制。

1.4 QTL定位方法

運用QTL IciMapping 4.0軟件的完備區(qū)間作圖法[20]對3個環(huán)境下的穗三葉葉寬進行QTL檢測。按照軟件默認值設(shè)置參數(shù)，LOD閾值為2.5，QTL顯著性閾值為P<0.01水平，通過1 000次排列檢測確定。QTL命名方式為q-性狀命名-環(huán)境-所在染色體，其中，原陽、西平、樂東3個環(huán)境分別用1、2、3來表示。若1個染色體上存在多個QTL位點，則在染色體后加數(shù)字1、2、3等加以區(qū)分。

1.5 玉米穗三葉葉寬的Meta分析

從已發(fā)表文獻中收集與玉米穗三葉葉寬有關(guān)的QTL信息[6,9-14]，主要包括作圖群體類型、群體大小、QTL數(shù)目、QTL位置、LOD值、置信區(qū)間以及貢獻率等。以IBM2 2008 Neighbors為參考圖譜，對不同來源的穗三葉葉寬QTL進行整合，對置信區(qū)間未知的QTL，根據(jù)DARVASI等[21]的公式推斷其95%置信區(qū)間。

C.I.=530/(N×R2)

(1)

C.I.=163/(N×R2)

(2)

其中，C.I.為置信區(qū)間，N代表作圖群體大小，R2代表貢獻率，公式(1)適用于回交和F2作圖群體，公式(2)適用于RIL作圖群體。之后利用BioMercator 4.2軟件將所收集的圖譜與參考圖譜進行比對，對QTL進行整理。mQTL命名規(guī)則為m-QTL-性狀-所在染色體。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同環(huán)境下玉米穗三葉葉寬表型數(shù)據(jù)分析

對原陽、西平、樂東3個環(huán)境下的玉米親本及RIL群體的穗三葉葉寬進行測量并分析，結(jié)果(表1)顯示，3個環(huán)境下，鄭58和D863F的穗三葉葉寬均存在極顯著差異，D863F的穗三葉葉寬(9.7～11.4 cm)均高于鄭58(7.0～7.9 cm)。在RIL群體中，穗三葉葉寬(5.20～11.93 cm)存在明顯的超親分離，且在3個環(huán)境下，玉米穗三葉葉寬在群體中表現(xiàn)出連續(xù)變異(圖1—3)，基本符合正態(tài)分布，屬于典型的數(shù)量性狀遺傳特點，適宜于QTL定位研究。

表1 不同環(huán)境下玉米穗三葉葉寬表型值的描述統(tǒng)計

注：**表示t測驗0.01水平上差異極顯著。

Note：**mean significantly different at 0.01 probability level by usingt-test.

圖1 原陽環(huán)境下RILs群體穗三葉的葉寬分布

圖2 西平環(huán)境下RILs群體穗三葉的葉寬分布

圖3 樂東環(huán)境下RILs群體穗三葉的葉寬分布

對3個環(huán)境下玉米RIL群體的穗下葉、穗位葉、穗上葉的葉寬數(shù)據(jù)進行方差分析(表2)發(fā)現(xiàn)，穗下葉、穗位葉、穗上葉葉寬在家系、環(huán)境以及家系×環(huán)境互作下的差異水平均達到極顯著水平，且均具有較高的廣義遺傳力，分別為93.69%、93.37%、92.83%。

表2 不同環(huán)境下玉米穗三葉葉寬的方差分析

注：**表示在0.01水平上差異極顯著。

Note：**mean significantly different at 0.01 probability level.

2.2 玉米RIL群體遺傳圖譜的構(gòu)建

對親本鄭58和D863F進行多態(tài)性SSR標記篩選，共鑒定出有差異性的標記215對。構(gòu)建遺傳圖譜全長為1 832.35 cM，平均圖距為8.52 cM，其中第8號染色體標記密度最高，平均遺傳距離為8.13 cM(圖4)。

圖4 玉米RILs群體遺傳圖譜

2.3 不同環(huán)境下玉米穗三葉葉寬QTL定位結(jié)果

在3個不同環(huán)境條件下，檢測到與穗三葉葉寬有關(guān)的QTL共17個，分別位于5、6、8號染色體上，除6號染色體上檢測到的qFirLW2-6增效基因來源于鄭58，其余QTL的增效基因均來自于D863F。原陽、西平、樂東3個環(huán)境下分別檢測到5、7、5個與穗三葉葉寬有關(guān)的QTL，單個QTL可解釋表型變異率為5.30%～12.77%，表明穗三葉葉寬是受多基因控制的數(shù)量性狀(表3)。

表3 玉米RILs群體穗三葉葉寬的QTL分析結(jié)果

3個環(huán)境下，均于8號染色體bnlg1056—bnlg1131區(qū)間內(nèi)檢測到與穗上葉葉寬有關(guān)的QTL，可解釋表型變異率為9.93%～12.77%；同時，在該位點也檢測到與穗下葉葉寬及穗位葉葉寬有關(guān)的QTL，可解釋表型變異率為10.53%～12.34%，表明該位點是一個控制穗三葉葉寬的主效QTL。在5號染色體umc2216—umc2201和8號染色體umc1882—umc1959區(qū)間內(nèi)，同時在原陽和西平2個環(huán)境下檢測到與穗下葉葉寬有關(guān)的QTL，可解釋表型變異率7.40%～8.43%；且在西平環(huán)境下，5號染色體umc2216—umc2201區(qū)間和8號染色體umc1882—umc1959區(qū)間內(nèi)還檢測到與穗位葉葉寬有關(guān)的QTL，可解釋表型變異率分別為9.27%、8.35%。另外，在樂東環(huán)境下，5號染色體umc1253—bnlg1006區(qū)間，檢測到與穗下葉葉寬、穗位葉葉寬有關(guān)的QTL，可解釋表型變異率分別為8.84%、11.27%。其余位點則是在單環(huán)境下檢測到的單QTL位點，解釋表型變異率為5.30%～5.89%。

2.4 玉米穗三葉葉寬的QTL映射及Meta分析

收集整合文獻報道的控制玉米穗三葉葉寬的119個QTL，將其同本研究定位到的17個QTL共同映射到整合圖譜上，共計獲得20個mQTL(表4)，置信區(qū)間為3.61～33.83 cM。除10號染色體外，在1—9號染色體上均獲得了mQTL，其中，在 1、3、4號染色體上均獲得了3個QTL，在2、5、6、8、9號染色體上均獲得2個mQTL，7號染色體上獲得1個QTL。每個mQTL包含2個及以上的不同QTL。結(jié)合表3可以看出，本研究檢測到的5號染色體上的qThiLW2-5位于mQTL5-1區(qū)段內(nèi)，6號染色體上的qFirLW2-6位于mQTL6-1區(qū)段內(nèi)，8號染色體上的qFirLW1-8、qFirLW2-8、qSecLW2-8位于mQTL8-1區(qū)段內(nèi)。

表4 玉米穗三葉葉寬mQTL及其相關(guān)信息

3 結(jié)論與討論

葉寬是復(fù)雜的數(shù)量性狀，遺傳背景、群體類型以及試驗環(huán)境的差異會造成其QTL定位結(jié)果的不同。本研究通過由穗三葉葉寬存在顯著差異的親本鄭58和D863F及其構(gòu)建的RIL群體對玉米穗三葉葉寬進行QTL定位，共計定位到17個與葉寬有關(guān)的QTL，其中有3個QTL在2個及以上環(huán)境均能檢測到，分別位于5、8號染色體上。利用IBM2 2008 Neighbors圖譜對不同遺傳群體、不同環(huán)境條件以及不同的標記定位到的玉米穗三葉葉寬相關(guān)QTL進行整合分析，獲得相同或鄰近染色體位置的mQTL。其中，mQTL5-1、mQTL6-1、mQTL8-1三個mQTL均含有本研究所定位到的QTL位點。

與前人研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，在5號染色體umc1680—phi101區(qū)間內(nèi)定位到qThiLW2-5與LIU等[9]通過IF2和RIL群體檢測到的結(jié)果一致，在本研究的元分析結(jié)果中也得到驗證；LIU等[9]的研究還表明，該位點與玉米穗上葉葉寬也有關(guān)聯(lián)，證明該位點很可能存在控制玉米葉寬的基因。另外，在5號染色體umc1253—bnlg1006區(qū)間內(nèi)定位到的qFirLW3-5、qSecLW3-5與WANG等[15]的研究結(jié)果一致。在8號染色體umc1882—umc1959區(qū)間內(nèi)定位到的與穗下葉、穗位葉有關(guān)的qFirLW1-8、qFirLW2-8、qSecLW2-8與GUO等[11]的研究結(jié)果一致，在元分析結(jié)果中得到驗證，位于mQTL8-1區(qū)間內(nèi)。

本研究在2個環(huán)境下均定位到5號染色體umc2216—umc2201區(qū)間內(nèi)存在1個與穗下葉葉寬的有關(guān)的QTL位點，該位點也與穗位葉葉寬有關(guān)，郭書磊等[22]對不同研究檢測到的QTL進行Meta-QTL分析，發(fā)現(xiàn)該位點存在1個與葉形有關(guān)的mQTL，并且經(jīng)過候選基因分析發(fā)現(xiàn)，該位點區(qū)域內(nèi)含有1個GRF1基因。研究表明，玉米GRF家族是一類轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠調(diào)控不同組織器官的發(fā)育，從而影響植株的形態(tài)建成。GRF1過量表達能夠?qū)е氯~片變大，而GRF10過表達會導(dǎo)致葉片變小、變窄[23]。KIM等[24]、HORIGUCHI等[25]研究表明，GRF家族過表達能夠通過調(diào)控細胞分裂和膨大來調(diào)控葉片的形態(tài)大小。推測GRF家族可能參與玉米穗三葉的形態(tài)發(fā)育。本研究在8號染色體bnlg1056—bnlg1131區(qū)間內(nèi)檢測到與穗三葉葉寬均有關(guān)的QTL位點，且在3個環(huán)境下均檢測到，證明該位點是一個可以穩(wěn)定表達的遺傳位點。ZHAO等[26]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析在該區(qū)段內(nèi)同樣發(fā)現(xiàn)了控制葉寬的顯著性位點，通過對該區(qū)段的候選基因進行分析，發(fā)現(xiàn)了1個與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶有關(guān)的基因，其與C4植物光合作用中二氧化碳的固定反應(yīng)有關(guān)。本研究為揭示玉米穗三葉葉寬的遺傳機制以及玉米的優(yōu)良株型育種提供了理論依據(jù)。