王瑞敏，祝凌云，陳 穎，姚秀文，白景偉，陳 旭，張齊齊，曹福亮

（1.南京林業(yè)大學 a.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心；b.生物與環(huán)境學院；c.林學院，江蘇 南京 210037； 2.南京昂科利醫(yī)藥科技創(chuàng)新研究院有限公司，江蘇 南京 211100）

銀杏Ginkgo biloba，又名白果、公孫樹，其起源可追溯到3.2 ～3.3 億萬年前的古生代石炭紀，具有重要的科學價值，集材用、花用、果用、藥用價值于一體，也是優(yōu)良的園林觀賞樹種[1]。金葉銀杏Ginkgo biloba‘Goldern-leaf’是南京林業(yè)大學、湖北安陸市林業(yè)局等單位的科研人員在對銀杏葉色長期觀察的基礎上篩選出的一個芽變銀杏新品種，其生態(tài)習性和普通銀杏相似，具有很強的適應性。普通銀杏只有在秋季時葉片才變?yōu)榻瘘S色，而金葉銀杏葉片在4—5月和9—10月都呈現(xiàn)橙黃色至金黃色，具有2 個觀賞季節(jié)，特別是在春季，因而具有極高的園林觀賞利用價值[2-3]。

由于金葉銀杏是一種芽變性狀，種子繁殖遺傳性狀不穩(wěn)定，因而無性繁殖是金葉銀杏培育的主要方式，目前金葉銀杏的繁殖方式主要是嫁接繁殖，但是嫁接繁殖系數(shù)較低；組織培養(yǎng)可以實現(xiàn)快速繁殖，但目前體系還不健全，難以滿足日益增長的市場需求，因此扦插繁殖是較優(yōu)的一種快繁方式。對銀杏的扦插有了一些研究，如鄧蔭偉等[4]利用根蘗苗條、王永格等[5]利用嫩枝、程貴蘭等[6]利用硬枝進行了扦繁殖研究，岳劍云等[7]研究了枝條部位和年齡與不定根形成、非結構碳水化合物的關系，但對銀杏不定根形成機制的深入研究不多，對金葉銀杏扦插生根研究尚未見報道。

本研究通過對金葉銀杏硬枝插穗進行不同生長調(diào)節(jié)劑處理，研究提高金葉銀杏硬枝扦插生根率和成活率的技術措施，探討金葉銀杏的生根機制，為金葉銀杏苗木扦插快繁技術體系的建立，快速、大規(guī)模地生產(chǎn)出具有優(yōu)良遺傳性狀的銀杏苗木，促進金葉銀杏的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及材料來源

扦插池設置在南京林業(yè)大學教學實驗基地，插池基質(zhì)為珍珠巖和蛭石的混合物（1∶1），底部鋪有碎石。扦插前翻曬扦插池基質(zhì)，于扦插前3 d平整扦插池，澆透水1 次，次日用0.3%的高錳酸鉀溶液對基質(zhì)進行淋灑消毒，3 d 后用水將高錳酸鉀溶液淋洗干凈。

1.2 插穗的采集、處理、扦插及管理

插穗來源于南京林業(yè)大學培育而成的金葉銀杏嫁接苗。該嫁接苗是以湖北安陸地區(qū)芽變銀杏母樹上的芽為接穗，以南京林業(yè)大學銀杏基地上的4年生實生苗為砧木嫁接培育而成[2-3]。3月8日，選取生長健壯、無病蟲害的1年生金葉銀杏枝條作插穗，扦插前將枝條剪成長10 ～15 cm 的莖段，要求上切口平切，下切口斜切。剪好的插穗捆好后分別放入含有α-萘乙酸（NAA）（200、500、800、1 500 mg·L-1）或者吲哚丁酸（IBA） （200、500、800、1 500 mg·L-1）， 以 及NAA+ IBA（200+200、400+400、600+600 mg·L-1）的不同 調(diào)節(jié)劑溶液中浸潤1 h，以清水為對照。插穗浸入溶液深度為2 ～5 cm，每個處理30 根 （500 mg·L-1IBA 處理的60 根），3 個重復。扦插時插穗入土壤深度為7 ～8 cm，插后壓實。

插池采用全光照自動間歇噴霧系統(tǒng)進行間歇澆水，每天淋水3 次，每次2 ～3 min，雨天停噴。扦插后每隔30 d 噴灑一次500 ～800 倍多菌靈消毒，常規(guī)管理。

1.3 插穗生根過程中生長指標的測定

插后每隔7 d 觀察插穗愈傷組織形成及不定根的發(fā)生情況，隨機抽取6 根插穗觀察記錄生根情況：愈傷組織出現(xiàn)期（d）、不定根出現(xiàn)期（d）等。插后4 個月（120 d），隨機從各處理中的每個重復中抽取10 根插穗，進行生根率、根數(shù)、根長等指標的測定和統(tǒng)計。

1.4 插穗生根過程中生理指標的測定

用刀片剝?nèi)〔逅牖? cm 長的韌皮部放入自封袋中，液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于生理指標的測定。樣品均取自于500 mg·L-1IBA 溶液處理的插穗，每個時間點隨機取插穗18根，分為3 個重復，分別在扦插之前、扦插之后每隔20 d 取樣，共6 次。

可溶性糖、淀粉采用蒽酮法測定，可溶性蛋白采用考馬斯亮藍法測定，超氧歧化酶（SOD）采用NBT 染色法測定，過氧化物酶（POD）采用愈創(chuàng)木酚法測定，以上方法均參照文獻[8]；多酚氧化酶（PPO）參照張志良的鄰苯二酚法[9]測定。內(nèi)源激素測定（酶聯(lián)免疫法（ELISA））參照徐瀾[10]的方法測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Microsoft Excel 2016 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和繪制圖表，采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 金葉銀杏硬枝扦插生根過程觀察

金葉銀杏插穗生根屬于愈傷組織和皮部混合生根型，有90%的不定根是從插穗基部愈傷和皮部的交界處伸出（圖1A ～D），有少量不定根從插穗莖段芽點處產(chǎn)生（圖1E）。NAA 和IBA處理的插穗盡管在生根時間上有差異，但整個生根過程表現(xiàn)基本一致（除1 500 mg·L-1的NAA 和IBA 處理外），可分為4 個階段：愈傷組織誘導期（20 ～26 d）、愈傷組織形成期（26 ～42 d）、不定根發(fā)生期（42 ～53 d）、不定根形成期（53 ～ 79 d）。以500 mg·L-1IBA 處理的插穗生根過程為例，在第27 天時發(fā)現(xiàn)部分插穗基部切口處皮層開始膨大（圖1A），第42 天時，插穗切口處產(chǎn)生白色點狀突起（圖1B），47 d 時，切口白色突起愈傷組織連接成環(huán)狀，將切口包圍。之后愈傷組織逐漸消失，基部進一步膨大開裂，至61 d時在插穗基部有白色根點長出，有的長至0.5 cm （圖1C ～D），這時期插穗上芽的葉片也逐漸展開。在74 d 時，插穗基部已有4 ～6 個不定根（圖1，F(xiàn)），之后不定根主要進行伸長生長（圖1G ～H），葉片完全展開（圖1I）。

2.2 不同質(zhì)量濃度NAA 處理對金葉銀杏扦插生根性狀的影響

經(jīng)不同質(zhì)量濃度的NAA 處理后都能顯著改善或提高金葉銀杏插穗的生根性狀和生根指標。其中500 ～800 mg·L-1的處理效果較好，愈傷組織形成期、不定根出現(xiàn)期都較對照和其他處理早，不定根出現(xiàn)期比對照分別提早了17 d 和8 d。 500 mg·L-1處理的生根率最高，達41.1%，比對照增加了147%；800 mg·L-1處理的生根率雖低于500 mg·L-1處理，但差異不顯著，且不定根數(shù)比后者高。200 mg·L-1處理較前兩者稍差些， 1 500 mg·L-1處理的生根率也高于對照，但其根數(shù)和不定根長都顯著低于對照，說明該質(zhì)量濃度對插穗生根有抑制作用（表1）。

2.3 不同質(zhì)量濃度IBA 處理對金葉銀杏扦插生根性狀的影響

從表2 的數(shù)據(jù)來看，各IBA 質(zhì)量濃度處理的效果優(yōu)于NAA 處理。4 個IBA 質(zhì)量濃度處理都顯著改善了金葉銀杏插穗生根的狀況和提高生根指標，其中800 mg·L-1處理的效果最好，其愈傷組織形成期比對照提早了13 d，不定根出現(xiàn)期比對照提前了26 d，生根率最高達64.4%，比對照增加了2.86 倍，不定根長和不定根數(shù)分別增加了1.00和2.01 倍。盡管500 mg·L-1處理的各指標都低于 800 mg·L-1處理，但兩者的根長和根數(shù)之間都沒有顯著差異（P＜0.01）。200 mg·L-1（低質(zhì)量濃 度）和1 500 mg·L-1（高質(zhì)量濃度）處理的效果也都顯著好于對照，其生根率分別比對照增加了1.06 和0.88 倍，但總體效果 沒 有500 mg·L-1和 800 mg·L-1處理好。

圖1 金葉銀杏硬枝扦插生根過程Fig.1 Cuttings rootting process of the Ginkgo biloba‘Golden-leaf’

表1 不同質(zhì)量濃度NAA 處理下金葉銀杏扦插生根指標的變化?Table 1 The changes of rooting indexes in Ginkgo biloba‘Golden-leaf’ cuttings under different NAA concentration treatments

表2 不同質(zhì)量濃度IBA 處理下金葉銀杏扦插生根指標的變化Table 2 The changes of rooting indexes in Ginkgo biloba ‘Golden-leaf’ cuttings under different IBA concentration treatments

2.4 NAA 與IBA 混合處理對金葉銀杏硬枝扦插生根性狀的影響

對銀杏插穗進行NAA 和IBA 的混合處理后，發(fā)現(xiàn)混合處理插穗與單獨NAA 和IBA 處理相比，其愈傷組織和不定根出現(xiàn)期都比單獨500 或 800 mg·L-1相應質(zhì)量濃度處理晚，但都早于對照；從生根指標來看，（200+200）mg·L-1和（400+ 400）mg·L-1混合處理好于單獨NAA及IBA處理，另外（400+400）mg·L-1處理與最佳處理的IBA 相比可顯著提高不定根數(shù)，達9.3 條，其生根率（51.1%）與單獨IBA 處理無顯著差異，說明混合處理對提高插穗的不定根數(shù)有益。（600+ 600）mg·L-1混合處理的效果都不及前兩者，但仍好于對照（表3）。

表3 不同質(zhì)量濃度NAA 與IBA 混合處理對扦插生根性狀的影響Table 3 Changes on rooting indexes in Ginkgo biloba L.‘Golden-leaf’ cuttings under different levels of NAA and IBA treatments

2.5 金葉銀杏扦插生根過程中關鍵酶活性和可溶性、淀粉含量的變化

從圖2 中可以看出，對照和500 mg·L-1IBA 處理下的插穗韌皮部SOD（超氧歧化酶）活性均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但在500 mg·L-1IBA 處理下各時期的SOD 活性都顯著地高于對照，且在插后40 d 達到高點，后出現(xiàn)緩慢下降趨勢，而對照處理的SOD 活性在插后60 d 出現(xiàn)峰值，后出現(xiàn)下降。對照處理的POD（過氧化物酶）活性在整個扦插期內(nèi)變化不大，在60 d 時達到高點，在100 d 時有所回升；而500 mg·L-1IBA 處理下插穗的POD 活性在插后40 d 內(nèi)達到高點后出現(xiàn)下降，在60 d 時達到最低點（0 d 除外），后又出現(xiàn)上升，到第100 天后又高于第40 天時的數(shù)值。PPO（多酚氧化酶）的活性變化趨勢同SOD 酶，也是先上升后下降，不過高峰出現(xiàn)的時間推遲，其中 500 mg·L-1IBA 處理在第60 天達到峰值，對照在第80 天（圖2A ～C）。

500 mg·L-1IBA 處理的插穗可溶性糖在20 d 內(nèi)出現(xiàn)上升，后逐漸下降，到第80 天后有所回升，除第40 天外都高于對照；淀粉的含量變化在初期與可溶性糖相反，在40 d 內(nèi)顯著下降，到60 d 后又逐漸上升（圖2D、E）。

2.6 金葉銀杏扦插生根過程中IAA、ZR、ABA含量的變化

從圖3A 中可以看出，在整個扦插期內(nèi)，IBA處理組插穗韌皮部的IAA 含量出現(xiàn)2 個峰值和一個谷值，即在0 ～20 d，IBA 處理組插穗中IAA含量顯著升高；而在第40 天即愈傷誘導形成期時處理組IAA 含量大幅下降，然后開始回升；在第60 天，即不定根突出前的生根誘導期，IAA 含量達到第二峰值（此時比對照IAA 的含量高2.22倍），后又出現(xiàn)下降；到100 d 時，不定根伸長期時IAA 的含量低于對照。對照組插穗中IAA 含量的谷值在第60 天，比處理組推遲40 d，后IAA的含量又出現(xiàn)上升，但總體的含量都低于處理組 （0 d 和100 d 除外）。從圖3B 中可以看出，扦插初期處理組的ZR 含量一直處于較低水平，之后開始上升，在第40 天時達到峰值，此時比對照達到峰值期（60 d）時的含量高60.1%，此后ZR 含量又大幅下降，至第60 天時達到最低并維持此水平至第80 天，到100 d 時又開始回升。對照組插穗ZR 含量在第60 天時達到峰值，但在前40 d 其含量顯著低于處理組，在60 ～80 d 內(nèi)又高于處理組水平。

從圖3C 中可以看出，扦插穗生根過程中GA的變化趨勢與IAA 變化呈相反趨勢，即先下降后上升，且處理組各時間段的含量都低于對照。處理組的下降與上升的拐點在第80 天，比對照拐點時（60 d）GA 含量低40.1%，兩者在第100 天時都有所回升。

從圖3D 中IBA 處理的金葉銀杏插穗中的ABA 含量在第20 天時達到高點，以后逐漸下降，到100 d 時ABA 的含量比0 d 下降了55.2%；對照組的ABA 變化趨勢同處理組，但對照組在第40天時達到最高，盡管以后也出現(xiàn)下降，但各時間段的含量都高于處理組，第100 天時只比對照（0 d）下降了11.6%。

2.7 金葉銀杏扦插生根過程中IAA/ABA、IAA/ZR、 IAA/GA 的變化

圖2 IBA 處理對金葉銀杏硬枝扦插生根過程中SOD（A）、POD(B)和PPO(C)活性及可溶性糖（D）和淀粉 (E) 含量的影響Fig.2 Effect of IBA treatment on the enzymes of SOD (A), POD (B) and PPO (C) and the contents of soluble sugar (D) and starch (E) in Ginkgo biloba ‘Golden-leaf ’ cuttings

從圖4A 中可以看出在整個扦插期內(nèi)，IBA 處理組和對照組的IAA/ABA 變化趨勢大致相同，均表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢，而且都是在插后的第40 天（愈傷組織形成期）IAA/ABA 比值達到谷底，然后開始上升，到100 d 達到最高（不定根形成和伸長期）。不同的是整個扦插期內(nèi)各時間節(jié)點的處理組IAA/ABA 比值均顯著高于對照，說明高IAA/ABA 值可促進根原基的誘導和不定根的形成。

從IAA/GA 的變化趨勢（圖4 B）來看，在插后40 d 內(nèi)處理組的IAA/GA 比值呈緩慢上升趨勢，而40 ～60 d 內(nèi)呈快速上升趨勢，在60 ～80 d 內(nèi)維持20 d 后又開始大幅下降，第100 天其比值接近對照水平。與處理組相比，對照組的IAA/GA比值在插后60 d 內(nèi)變化不大，在第80 天出現(xiàn)小高峰之后在第100 天根的伸長期開始緩慢下降。

IAA/ZR 值變化出現(xiàn)波動變化，在扦插初期愈傷組織形成階段，其比值呈下降趨勢，處理組在第40 天降至最低值（谷底），到第60 天急劇上升到峰值，然后又開始下降，至100 d 其比值甚至低于對照。對照組插穗的IAA/ZR 值在插后60 d 內(nèi)降低到谷底之后又快速恢復到初期值 （圖4C）。

3 討論與結論

目前，銀杏扦插繁殖有2 種方式，嫩枝扦插和硬枝扦插[4-6]，扦插成活率大多在60%～98.4%之間。從研究中可以看出，金葉銀杏扦插生根過程可分為4 個階段：愈傷組織誘導期、愈傷組織形成期、不定根發(fā)生期和不定根形成期。生根類型包括愈傷組織和皮部生根2 種類型，為混合性，這與紅纓海棠扦插生根類型相似[11]。從扦插結果來看，IBA 的處理效果要比NAA 的效果好，最高生根率達64.4%，NAA 和IBA 混合處理能提高不定根數(shù)，但生根率比單獨的IBA（800 mg·L-1）處理的低，姜宗慶等[12]、王永格等[5]的研究也有相似的結果。因此金葉銀杏扦插繁殖采用800 mg·L-1處理1 h，可以獲得較高的生根率和能較早地生根。

圖3 IBA 處理對金葉銀杏硬枝扦插生根過程中IAA（A）、ZR（B）、GA（C）和ABA（D）含量的影響Fig.3 Effect of IBA treatment on the contents of IAA(A), ZR(B), GA(C)and ABA(D) in Ginkgo biloba cuttings

圖4 IBA 處理對金葉銀杏硬枝扦插生根過程中IAA/ABA (A) 、IAA/GA (B)、 IAA/ZR (C)比值的影響Fig.4 Effect of IBA treatment on the ratios of IAA/ABA(A), IAA/GA(B) and IAA/ZR(C) in Ginkgo biloba‘Goldern-leaf’ cuttings

IBA處理顯著提高插穗生根率是個普遍現(xiàn)象，如100 mg/kg IBA 處理大馬士革玫瑰枝條生根率最高達78.3%[13]，其原因可能與IBA 激活了插穗體內(nèi)的SOD、POD 和PPO 酶活性，調(diào)整了可溶性糖和淀粉代謝，還與初期分泌大量的酚類物質(zhì)有 關[14-15]。金葉銀杏扦插生根過程中，基部的SOD與PPO 都出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而POD 活性除60 d 有個谷值外，其它都是上升趨勢，各酶峰值的時間有差異。3 個酶的活性變化規(guī)律與插穗生根過程形態(tài)變化相吻合，在扦插初期，由于剪切的原因使插穗受傷導致傷口和水分脅迫引起體內(nèi)自由基含量上升，體內(nèi)產(chǎn)生應激反應，保護酶SOD活性上升。而POD 和PPO 活性升高，可能是由于剪切作用刺激傷口處分泌酚類物質(zhì)，促進了兩個酶活性，有利于愈傷組織和不定根的形成。歐陽芳群等[16]也發(fā)現(xiàn)歐洲云杉插穗在扦插初期多酚類物質(zhì)含量高，后期含量低有利于不定根的形成。扦插后POD 活性的升高還可能與生長素代謝和細胞壁的木質(zhì)化有關[17-18]；而PPO 能夠催化酚類物質(zhì)與IAA 形成一種“IAA-酚酸復合物”的生根輔助因子，對離體插穗生根有積極的誘導作用[19]。 這些結果在山木通、凹葉厚樸、降香黃檀、四倍體刺槐等都有相類似的報道，說明這兩種酶是插穗愈傷組織和不定根發(fā)生的關鍵酶[20-23]。

除此之外，糖代謝與愈傷組織形成和不定根發(fā)生關系密切。張恩亮等[24]在楸樹扦插不定根發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)，隨著楸樹不定根的發(fā)育，參與糖酵解代謝的基因數(shù)減少而參與酚類物質(zhì)合成的基因數(shù)量在持續(xù)增加。本研究中也發(fā)現(xiàn)可溶性糖在初期增加，后期減少與其轉(zhuǎn)錄組分析結果相吻合，說明在扦插初期愈傷組織形成過程中，存在著糖類的基因表達減弱而酚類物質(zhì)的基因表達增強，由糖代謝逐漸向酚類代謝轉(zhuǎn)變的過程。

生長素是扦插生根過程中起關鍵作用的激素，本研究發(fā)現(xiàn)，金葉銀杏高的扦插生根率需要外源激素的添加，IBA 處理能夠提高金葉銀杏插穗IAA的含量，并呈現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，在第一個峰值（20 d） 時，可能是外源IBA 的輔助作用，刺激內(nèi)源生長素含量增加，激活形成層細胞而誘導愈傷組織的形成。IAA 的第二高峰（60 d）與根原基出現(xiàn)相吻合，可能是在IAA 信號的傳導過程中，激活了根原基形成層位點細胞的基因表達，誘導不定根的形成[25-27]。根原基出現(xiàn)與IAA 含量高峰相吻合的現(xiàn)象在白樺、北美香柏扦插研究中也有相似的結果[28-29]。

本研究中，ABA 含量在扦插初期略有上升，之后ABA 一直處于下降狀態(tài)，其原因可能是由于切口的創(chuàng)傷刺激了ABA 的合成，調(diào)整可溶性糖和淀粉的比例，調(diào)整庫強度，有利于不定根的形成。 吳文浩等[30]認為扦插過程中ABA 含量的下降，有利于插穗內(nèi)的淀粉水解轉(zhuǎn)化為糖，另外ABA是插穗切口受傷響應和有機物運輸庫強度的主要因素。從IAA/ABA 的比值來看，在插后的20 d （愈傷組織誘導期）和60 d（不定根形成）都處于高水平，可見金葉銀杏插穗在生根的過程中，愈傷組織誘導和根誘導形成都需要較高的IAA/ABA 比值。這與野生長蕊杜鵑和北美香柏、糙葉杜鵑、楓楊、核桃、美國薄荷扦插過程中高含量的IAA 與高的IAA/ABA 比值有利于插穗根原基分化和生根結果一致[31-34]。程水源等[35]在銀杏插穗生根的研究中也認為高比值的IAA/ABA 是不定根發(fā)生和生長的重要內(nèi)部條件。

研究證明，赤霉素和細胞分裂素有抑制根原基的細胞分裂、分化和形成的作用[27]。本研究中，IBA 處理組的插穗 ZR 含量在40 d 出現(xiàn)峰值，后期一直處于較低的水平，而GA 含量在80 d 內(nèi)處于下降狀態(tài)，80 d 后開始回升，但整個時期含量都比對照低。另外在愈傷組織形成期（40 d），IAA/ZR 比值降低，不定根形成期（60 d），IAA/ZR 值又顯著增大，說明高比值IAA/ZR 有利于不定根的形成，這是生長素和細胞分裂素含量彼此消長變化的結果，插穗基部形成高生長素，低細胞分裂素的生理狀態(tài)，有利于根原基的形成[16,36]。

綜上所述，金葉銀杏扦插最佳的處理是 800 mg·L-1IBA 處理插穗1 h，NAA 及NAA+IBA處理也提高了金葉銀杏的生根率，但效果不及IBA 好。IBA 處理改善了插穗基部糖代謝和酚類物質(zhì)水平、激活氧化酶和調(diào)控內(nèi)源激素的合成及比值關系。在插穗愈傷組織形成過程（20 ～40 d）需要的高SOD 和POD 酶活性，高的IAA、ZR 含量，低的GA 水平，低的IAA/ABA、IAA/ZR、IAA/GA 比值；而不定根形成過程中（60 ～80 d），需要高的PPO 和POD 活性，高的IAA 含量，低的GA、ZR、ABA 水平及高的IAA/ABA、IAA/ZR、 IAA/GA 比值。IAA 和ABA 的彼此消長是金葉銀杏插穗生根的主要因素，ZR 與GA 起輔助作用，40 d 是愈傷組織向不定根轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)折點。