梁晨，李維，陳怡，農(nóng)曉琳

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，南寧530021

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一。DN早期不易察覺，病變后期發(fā)展迅速，是終末期腎病最常見的誘因，因此早期診治尤為重要。DN的發(fā)生是由炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、自噬等多種機制介導(dǎo)的。自噬是一種溶酶體降解途徑，在維持機體平衡中起重要作用。研究顯示，在STZ誘導(dǎo)的早期DN大鼠中，自噬作用被抑制。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，自噬活性增強有助于轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、Smad2降解，從而抑制腎臟纖維化[1]。因此，通過調(diào)節(jié)腎臟內(nèi)自噬水平，抑制腎臟內(nèi)纖維化改變，可能成為治療DN的新策略。青蒿琥酯(ART)是青蒿素的衍生物，是公認(rèn)安全有效的抗瘧藥[2]。因此，通過調(diào)節(jié)腎臟內(nèi)自噬水平，抑制腎臟內(nèi)纖維化改變，可能成為治療DN的新策略。近年的研究發(fā)現(xiàn)，青蒿及其衍生物對延緩腎臟疾病的發(fā)展具有重要作用[3～5]。2018年5～7月，我們觀察了ART對糖尿病大鼠腎組織纖維化及自噬相關(guān)蛋白AMPK、LC3Ⅱ的影響，探討ART保護(hù)腎臟的作用機制，為ART治療DN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，符合廣西醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會要求。將大鼠分籠喂養(yǎng)，室溫18～25 ℃，定時通風(fēng)光照，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲食飲水。青蒿琥酯購于桂林南藥有限公司，鏈脲佐菌素(STZ)購于美國Sigma公司，兔抗多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，山羊抗兔IgG二抗購于北京中杉金橋公司。DAB顯色劑購于北京中杉金橋公司，MASSON、PAS試劑盒購于南京建成公司。光學(xué)顯微鏡為日本奧林巴斯產(chǎn)品。

1.2 動物分組與造模 將大鼠隨機分為正常對照組10只和模型組30只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后禁食6 h，模型組一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg(將STZ避光溶解于0.1 mol/L pH 4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，配制成1% STZ溶液)；正常對照組腹腔一次性注射等體積0.1 mol/L pH 4.4檸檬酸鈉緩沖液。72 h后，禁食尾靜脈采血，以空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。

1.3 藥物干預(yù) 造模成功后，將模型組隨機分為模型對照組、ART低劑量組和ART高劑量組。ART低劑量組、ART高劑量組分別給予50、100 mg/kg ART灌胃，模型對照組給予0.9%氯化鈉灌胃，1次/d，共干預(yù)3周。

1.4 腎功能指標(biāo)檢測 干預(yù)3周后，將大鼠置于代謝籠中收集24 h尿液。戊巴比妥鈉過量麻醉處死大鼠，收集腹主動脈全血，低溫保存，用于檢測尿素氮(SUN)、血肌酐(SCr)。

1.5 腎臟指數(shù)(KI)測算 干預(yù)3周后，稱取大鼠體質(zhì)量。處死大鼠后取出雙側(cè)腎臟，去除包膜，使用精量天平稱重。根據(jù)公式KI=雙側(cè)腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量，計算KI。

1.6 腎組織病理檢查 取大鼠右側(cè)腎臟，矢狀切開，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。取固定后的腎臟組織脫水、浸蠟、石蠟包埋、5 μm厚切片，行HE染色、PAS染色，鏡下觀察腎組織病理學(xué)改變。

1.7 腎組織纖維化觀察 取5 μm厚的腎臟組織切片，采用Masson染色法，觀察腎組織纖維化情況。

1.8 腎組織TGF-β1、Samd2、AMPK、LC3Ⅱ蛋白檢測 采用免疫組織化學(xué)法。取腎臟組織，加入4%多聚甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，切片。高溫高壓抗原修復(fù)，H2O2溶液孵育15 min，PBS沖洗3次。分別加入TGF-β1、Samd2、AMPK、LC3Ⅱ(稀釋比例1∶800)，4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次，滴加山羊抗兔IgG抗體為二抗，PBS沖洗3次。DAB染色液顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。觀察5個不同視野，采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算TGF-β1、Samd2、AMPK、LC3Ⅱ陽性表達(dá)的平均光密度值。

2 結(jié)果

2.1 各組血清SUN、SCr比較 與正常對照組相比，模型對照組血清SUN、Scr均升高(P均<0.05)；與模型對照組比較，ART低劑量組血清SUN、SCr降低(P均<0.05)，ART高劑量組SCr降低(P<0.05)，SUN無明顯變化。見表1。

表1 各組血清SUN、SCr比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05。

2.2 各組KI比較 肉眼觀察各組腎臟組織形態(tài)，正常對照組腎臟質(zhì)地中等，呈暗紅色；模型對照組腎臟較正常對照組偏大，顏色蒼白，質(zhì)地較硬；與模型對照組相比較，ART不同劑量組腎臟組織未見明顯代償性肥大，腎臟顏色接近正常。正常對照組、模型對照組、ART低劑量組、ART高劑量組的KI分別為7.12±1.40、12.35±4.02、13.25±1.50、10.68±2.98，模型對照組KI較正常對照組升高(P<0.05)，ART低劑量組、ART高劑量組KI較模型對照組有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

2.3 各組腎組織病理變化比較 正常對照組腎臟結(jié)構(gòu)清晰，腎小球大小正常，基質(zhì)系膜區(qū)未見增生；模型對照組可見腎小球肥大，結(jié)構(gòu)不清，系膜細(xì)胞增多，周圍可見炎細(xì)胞浸潤，系膜基質(zhì)擴張增生，腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)可見空泡性變，管腔內(nèi)可見透明管型；ART不同劑量組未見硬化腎小球，腎小球系膜組織增生癥狀減輕，空泡性變，間質(zhì)內(nèi)可見少量炎性細(xì)胞浸潤，透明管型減少，較模型對照組病變程度減輕，且ART低劑量組改善更為明顯。

2.4 各組腎組織纖維化情況比較 Masson染色后膠原纖維呈藍(lán)色。正常對照組膠原纖維排列整齊，未見明顯藍(lán)染區(qū)域。與正常對照組相比，模型對照組膠原纖維排列紊亂，腎小球周圍及腎間質(zhì)內(nèi)可見大量藍(lán)染區(qū)域。ART不同劑量組藍(lán)染程度變淺，提示腎臟纖維化減輕，其中ART低劑量組改善更為明顯。

2.5 各組腎組織TGF-β1、Samd2、AMPK、LC3Ⅱ表達(dá)水平比較 與正常對照組比較，模型對照組腎組織TGF-β1、Smad2表達(dá)升高，AMPK、LC3Ⅱ表達(dá)降低(P均<0.05)；與模型對照組比較，ART低、高劑量組TGF-β1、Samd2表達(dá)均減低，AMPK、LC3Ⅱ表達(dá)均升高(P均<0.05)；ART低劑量組TGF-β1表達(dá)較高劑量組減少，AMPK、LC3Ⅱ表達(dá)較高劑量組增加(P均<0.05)。見表2。

表2 各組腎組織TGF-β1、Smad2、AMPK、LC3Ⅱ表達(dá)水平比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05。

3 討論

DN是糖尿病進(jìn)展過程中最常見的并發(fā)癥之一，是終末期腎病發(fā)生的主要危險因素之一。DN的早期病理改變?yōu)樽慵?xì)胞損傷、腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化等以及間質(zhì)系膜增生。臨床表現(xiàn)可見腎小球微血管通透性增加，腎小球濾過率下降，進(jìn)行性蛋白尿，后期可發(fā)展為終末期腎病、腎功能衰竭，危及患者生命。DN發(fā)病機制復(fù)雜，除了受高血糖誘導(dǎo)的血管功能障礙影響，還包括代謝、血流動力學(xué)、生長因子、炎癥因子、氧化應(yīng)激等因素。自噬是細(xì)胞對外界刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng)，可阻止有害應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[6]。自噬作用通過回收營養(yǎng)物質(zhì)，去除受損的細(xì)胞器和代謝產(chǎn)物，消除入侵的病原體，維持機體穩(wěn)態(tài)。正常細(xì)胞中，自噬反應(yīng)可以促進(jìn)細(xì)胞對抗各種壓力，包括缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或氧化應(yīng)激等；在肥胖癥或糖尿病進(jìn)程中，自噬作用可受到抑制[7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬可能對腎臟具有保護(hù)作用，成為腎臟疾病新的治療靶點[8]。

ART是含有氧化基團(tuán)倍半萜內(nèi)酯的水溶性的青蒿素衍生物。我們的前期研究已證實，ART具有抗炎、抗腫瘤、抑制瘢痕等多種生物活性[9～11]。近年研究發(fā)現(xiàn)，ART還有一定的腎臟保護(hù)作用。ART能夠改善DN大鼠的腎小球炎癥反應(yīng)，抑制TLR4/NF-κB表達(dá)[12]，調(diào)節(jié)TGF-β1誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化反應(yīng)，降低蛋白尿排出。本研究結(jié)果顯示，與模型對照組相比較，ART低、高劑量組SCr、SUN、KI降低，組織病理學(xué)染色結(jié)果可見腎小球硬化、腎小管上皮細(xì)胞肥大癥狀緩解，腎間質(zhì)纖維化程度減輕，腎臟內(nèi)少見空泡性變及透明管型，提示ART能夠減輕糖尿病大鼠的腎臟損傷和腎纖維化，對腎小球、腎小管具有保護(hù)作用。

糖尿病大鼠腎臟病變早期即可出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化的改變，腎纖維化改變是腎衰竭發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)。TGF-β1是調(diào)節(jié)腎間質(zhì)纖維化的重要因子[13]。Smad2蛋白是TGF-β1信號傳導(dǎo)的下游蛋白，TGF-β1可以通過調(diào)節(jié)Smad2影響組織內(nèi)細(xì)胞的生長、分化和凋亡。TGF-β1/Smad2信號通路在DN腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生中起重要作用。Smad2表達(dá)受阻，可促進(jìn)腎間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，細(xì)胞外基質(zhì)大量聚集，從而促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[14]。AMPK是自噬調(diào)節(jié)的重要因子，參與腎臟代謝過程，如脂質(zhì)代謝、糖原合成和腎小管中葡萄糖的重吸收。AMPK發(fā)揮作用是通過其磷酸化實現(xiàn)的，AMPK蛋白通過自身磷酸化形成p-AMPK，進(jìn)而導(dǎo)致自身結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，調(diào)節(jié)ATP產(chǎn)生及利用速率，以促進(jìn)能量代謝[15]。隨著DN進(jìn)展，AMPK活性降低，自噬反應(yīng)被抑制，引起腎小球、腎小管內(nèi)病理改變[16]。既往研究指出，LC3Ⅱ是自噬體表面重要的標(biāo)志蛋白。AMPK、LC3Ⅱ的表達(dá)水平可反映機體的自噬活性，AMPK激活后，可通過抑制高糖環(huán)境介導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡實現(xiàn)對DN的調(diào)節(jié)[17]。因此可以通過檢測AMPK、LC3Ⅱ的表達(dá)水平來反映機體的自噬活性。Lin等[18]報道，AMPK可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)TGF-β信號通路，可能通過降低Smad2/3磷酸化進(jìn)而抑制TGF-β1表達(dá)，減輕腎臟上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制膠原纖維產(chǎn)生。因此，激活腎臟細(xì)胞AMPK信號通路，誘導(dǎo)LC3增強腎臟細(xì)胞的自噬活性，能夠減輕高糖對腎臟的損傷作用，延緩DN的進(jìn)展[19]。本研究結(jié)果表明，模型對照組AMPK和LC3Ⅱ表達(dá)下調(diào)、TGF-β1和Smad2表達(dá)上調(diào)，Masson染色可見腎間質(zhì)內(nèi)膠原排列紊亂，水腫變性。ART可以逆轉(zhuǎn)此變化，ART干預(yù)后AMPK和LC3Ⅱ表達(dá)上調(diào)、TGF-β1和Smad2表達(dá)下調(diào)，Masson染色示腎間質(zhì)纖維化癥狀緩解。表明ART通過激活大鼠腎臟內(nèi)自噬反應(yīng)，抑制腎間質(zhì)纖維化途徑，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

綜上所述，ART可提高糖尿病大鼠腎臟自噬水平、抑制腎臟纖維化的發(fā)生，其機制可能是通過上調(diào)AMPK表達(dá)、抑制TGF-β1/Smad2通路，發(fā)揮對腎臟纖維化的抑制作用。本研究為ART防治DN提供了理論依據(jù)。