楊俊譽(yù) 魏世杰 蘇代發(fā) 陳杉艷 羅志偉 沈雪梅 ArslanJamil 童江云 崔曉龍

摘要：【目的】利用核糖體DNA（nrDNA）ITS序列和葉綠體DNA（cpDNA）psbA-trnH序列對云南不同地理區(qū)域的黃毛草莓進(jìn)行分子鑒定，并分析不同地理居群間的分子進(jìn)化及地理分布特征，為黃毛草莓種質(zhì)鑒定、保護(hù)及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。【方法】以云南省12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群樣品為材料，PCR擴(kuò)增其ITS和psbA-trnH序列，并進(jìn)行雙向測序及序列合并，分別基于ITS和psbA-trnH序列及二者合并序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。最后利用DnaSP 5.10對ITS和psbA-trnH序列進(jìn)行核苷酸多樣性（π）及單倍型數(shù)目、類型和多樣性（Hd）分析，并對黃毛草莓居群進(jìn)行中性檢驗及分子進(jìn)化特征分析?！窘Y(jié)果】基于ITS和psbA-trnH序列的聚類分析結(jié)果均顯示，12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群樣品均與GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的黃毛草莓聚在一個分支上，分支自展值均大于閾值（75%），表明這兩種序列均可用于黃毛草莓種質(zhì)的分子鑒定?；诙吆喜⑿蛄械木垲惙治鼋Y(jié)果與上述結(jié)果基本一致，但分支自展值達(dá)99%，表明該聚類分析結(jié)果更可靠。不同地理區(qū)域的黃毛草莓ITS序列間的遺傳距離為0～0.014，排序為迪慶州>昆明市>文山州，psbA-trnH序列間的遺傳距離為0～0.025，排序為昆明市>迪慶州>文山州，推測ITS和psbA-trnH序列均能顯示黃毛草莓居群遺傳分化與地理分布格局的相關(guān)性。ITS序列長度為668 bp，變異位點百分率為1.8%，共有8種單倍型，Hd和π分別為0.894±0.078和0.006，以昆明市黃毛草莓樣品的單倍型最多，為4種;psbA-trnH序列有203 bp，變異位點百分率為2.5%，psbA-trnH序列共有5種單倍型，Hd和π分別為0.788±0.090和0.009，以昆明市黃毛草莓樣品單倍型最多，為3種，表明兩種序列的單倍型均呈現(xiàn)地理分布格局。黃毛草莓ITS和psbA-trnH序列的中性檢驗Tajimas D值分別為-0.673和0.227（P>0.1），表明云南省12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群保持穩(wěn)定狀態(tài)，在截至目前的歷史時間內(nèi)不存在擴(kuò)張?！窘Y(jié)論】從云南不同地理區(qū)域采集的樣品均為黃毛草莓。ITS序列和psbA-trnH序列均可作為黃毛草莓的DNA條形碼，二者的合并序列更能準(zhǔn)確鑒定黃毛草莓種，適用于黃毛草莓分子譜系地理學(xué)研究。

關(guān)鍵詞： 黃毛草莓;ITS序列;psbA-trnH序列;分子鑒定;進(jìn)化特征

Abstract：【Objective】The molecular identification of Fragaria nilgerrensis samples in different geographical regions of Yunnan was performed by using ribosomal DNA（nrDNA） ITS sequences and chloroplast DNA（cpDNA） psbA-trnH sequences. At the same time，the characteristics of molecular evolution and geographical distribution in different geographi-cal populations were analyzed，which provided with a theoretical basis on molecular identification，protection，and exploitation and utilization of F. nilgerrensis germplasm resources. 【Method】Taking samples of F. nilgerrensis populations from 12 different geographical regions in Yunnan as the research object. Subsequently， PCR was used to amplify the ITS and psbA-trnH sequences from genomic DNAs of these samples，and performed bidirectional sequencing and sequence combination. Then phylogenetic trees were constructed based on ITS and psbA-trnH sequences and their combined sequences，respectively. Finally， the DnaSP ver5.10 software was used to analyze the nucleotide diversity （π） and the number/type/diversity （Hd） of haplotype for ITS and psbA-trnH sequences. At the same time， the neutrality test and the molecular evolution characteristics of F. nilgerrensis populations were analyzed. 【Result】The clustering analysis results based on ITS and psbA-trnH sequences showed that all samples of the F. nilgerrensis populations from 12 different geographical regions were clustered on one branch with the samples from GenBank database，and bootstrap value in this branch was higher than the threshold of 75%，indicating that both sequences could be used for molecular identification of this species germplasm （resources）. The results of the cluster analysis based on the combination sequence of above DNA markers were consistent with the above results，the bootstrap value reached 99%，indicating that the cluster analysis results were more scientific and accurate. The genetic distance between ITS sequences of the F. nilgerrensis populations from different geographical regions was 0-0.014，the order of genetic distance in different regions was Diqing>Kunming>Wenshan. The genetic distance between psbA-trnH sequences was 0-0.025，the order of genetic distance in different regions was Kunming>Diqing>Wenshan. Therefore， it was speculated that both the ITS and psbA-trnH sequences could show the correlation between the genetic differentiation and geographical distribution pattern of F. nilgerrensis populations. The length of the ITS sequence was 668 bp，the mutation rate was 1.8%，the number of haplotypes was eight. Furthermore， the values of Hd and π were 0.894±0.078 and 0.006，respectively. Kunming had the most haplotypes from ITS sequences， with four haplotypes;while the psbA-trnH sequence was 203 bp，the mutation rate was 2.5%，these sequences have five haplotypes，the values of Hd and π were 0.788±0.090 and 0.009，respectively. Kunming had the most haplotypes from psbA-trnH sequences， with three haplotypes. Therefore， the results showed that the haplotypes of both ITS and psbA-trnH sequences presented a specific correlation between evolutionary characteristics and geographical distribution of F. nilgerrensis. The Tajimas D value （neutral test） of the ITS and psbA-trnH sequences were -0.673 and 0.227（P>0.1），respectively. It showed that the populations of F. nilgerrensis from 12 different geographical regions in Yunnan Province were stable and did not experience a recent population expansion event. 【Conclusion】All samples collected from different geographical regions of Yunnan are the species of F. nilgerrensis. The ITS sequence and the psbA-trnH sequence can be used as the DNA barcode，their combined sequence of these DNA barcodes can more accurately identify this species， and both of them are suitable for the molecular phylogeographic study of F. nilgerrensis.

0 引言

【研究意義】黃毛草莓（Fragaria nilgerrensis Schltdl. ex J. Gay）為薔薇科草莓屬多年生草本植物，具有清熱解毒、消炎、祛風(fēng)止咳等功效，可用于口腔破潰、痢疾、跌打損傷、毒蛇咬傷等癥，是我國自然條件下分布最廣的野生二倍體草莓（鄧明琴和雷家軍，2005;江紀(jì)武，2005;雷家軍等，2006），其中，云南省黃毛草莓種質(zhì)資源極其豐富（中國科學(xué)院昆明植物研究所，2006;趙密珍等，2010;楊雷等，2018）。目前，對草莓屬種質(zhì)鑒定主要依據(jù)植株的形態(tài)學(xué)分類，但形態(tài)學(xué)分類通常易受主觀因素影響，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確鑒定，從而影響其多樣性保護(hù)及利用（鄧明琴和雷家軍，2005;任保青和陳之端，2010;劉宇婧等，2011）。從分子水平能更加準(zhǔn)確地對黃毛草莓進(jìn)行種質(zhì)鑒定及不同地理區(qū)域的居群遺傳變異分析，對其藥用價值和種質(zhì)資源開發(fā)、利用及保護(hù)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著分子技術(shù)的發(fā)展，國際生物條形碼聯(lián)盟（CBOL）的植物工作小組建議使用葉綠體DNA（cpDNA）和核糖體DNA（nrDNA）ITS序列作為植物研究的DNA條形碼（寧淑萍等，2008;China Plant BOL Group et al.，2011），其中ITS或ITS2序列被中國DNA條形碼植物工作組確定為種子植物的核心條形碼（China Plant BOL Group et al.，2011），同時多種序列片段組合使用也被廣泛用于植物物種的鑒定（Fazekas et al.，2008;Hollingsworth et al.，2011）。2015年版的《中國藥典》將ITS2和cpDNA psbA-trnH序列作為植物類中藥材物種鑒定的DNA條形碼（林爽等，2017），已廣泛用于何首烏屬（白明明等，2012）、石斛屬（彭小鳳等，2015）和黃芩屬（呂澤良等，2017）等中藥材的分子鑒定。目前，國內(nèi)外關(guān)于黃毛草莓的研究主要集中在組織培養(yǎng)（余桂紅等，2002;王燕等，2012）、植株形態(tài)學(xué)鑒定（鄧明琴和雷家軍，2005;李洪雯等，2012）、核型分析（趙密珍等，2010;陳丙義等，2015）、植株脅迫（Na et al.，2014）、營養(yǎng)成分（李桂香等，2017）和生理生化（徐蘇婷等，2018）等方面，對其進(jìn)行分子鑒定和遺傳進(jìn)化分析的文獻(xiàn)較少。Kress等（2005）利用ITS和psbA-trnH的合并序列對有花植物進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用這2種序列可有效識別和鑒定有花植物;Njuguna（2010）使用ITS和psbA-trnH序列對野生草莓進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)psbA-trnH序列對黃毛草莓具有很好的鑒別能力（Whitaker，2011）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，鮮見利用ITS和psbA-trnH序列對云南黃毛草莓種質(zhì)進(jìn)行分子鑒定及進(jìn)化特征分析研究的相關(guān)報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以云南省不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群樣品為研究對象，PCR擴(kuò)增其ITS和psbA-trnH序列，并進(jìn)行雙向測序及序列合并，分別基于ITS和psbA-trnH序列及二者合并序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，最后對黃毛草莓居群進(jìn)行中性檢驗及分子進(jìn)化特征分析，為黃毛草莓種質(zhì)的鑒定、保護(hù)及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為云南省12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群樣品（表1）。主要試劑：E.Z.N.A.TM HP Plant DNA Kit（Omega，美國）植物基因組提取試劑盒購自昆明碩陽科技有限公司;Green Taq Mix購自昆明贊納生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：MyCycler普通PCR儀（Bio-Rad，美國）、Vortex-Genie? 2 Vortex振蕩儀（MoBio，美國）、小型高速離心機(jī)（Thermo，美國）、Syngene G：BOX全自動凝膠成像系統(tǒng)（Syngene，英國）和DYY-12型電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1. 2 樣品采集

采集樣品時，從每個地理區(qū)域隨機(jī)選取10株不同植株個體，將新鮮植株葉片裝于50 mL滅菌管中，4 ℃保存并迅速運回實驗室，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 DNA提取

利用液氮和研缽對供試材料進(jìn)行研磨，并利用E.Z.N.A.TM HP Plant DNA Kit植物基因組提取試劑盒提取其DNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 PCR擴(kuò)增

ITS序列的擴(kuò)增引物為ITS5a（5'-CCTTATCAT TTAGAGGAAGGAG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3'）（Kress et al.，2005），psbA-trnH序列的擴(kuò)增引物為psbA3'f（5'-GTTATGCATGAAC GTAATGCTC-3'）和trnHf（5'-CGCGCATGGTGGAT TCACAATCC-3'）（Hollingsworth et al.，2011）。PCR反應(yīng)體系：Green Taq Mix 25.0 μL，DNA模板10 ng，10 μmol/L正、反向引物各2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序（正、反向測通）。

1. 5 統(tǒng)計分析

使用DNAstar對測序峰圖進(jìn)行手工校對，去除兩端不可靠序列，并將正向和反向序列進(jìn)行拼接。利用MEGA 6.0對拼接好的序列進(jìn)行核苷酸組成分析，并基于K2P算法模型和GenBank中已知的野生草莓種序列，通過相鄰算法（NJ）分別構(gòu)建ITS和psbA-trnH序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并對其進(jìn)行1000次重復(fù)的自展（Bootstrap）檢驗評價（寧淑萍等，2008;姜玉素等，2019）;應(yīng)用SequenceMatrix 1.78將ITS和psbA-trnH序列進(jìn)行合并，并利用PAUP 4.0對合并序列進(jìn)行同質(zhì)性檢驗（Vaidya et al.，2011），最后利用MEGA 6.0構(gòu)建基于合并序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。此外，利用DnaSP 5.10對ITS和psbA-trnH序列進(jìn)行核苷酸多樣性（π）及單倍型（Haplotype，Hap）數(shù)目、類型和多樣性（Hd）分析，并對黃毛草莓居群進(jìn)行中性檢驗及分子進(jìn)化特點分析（Librado and Rozas，2009）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 ITS和psbA-trnH序列的聚類分析結(jié)果

2. 1. 1 基于ITS序列的聚類分析結(jié)果 對12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群樣品ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序，將ITS序列上傳NCBI獲取登錄號，并從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載已發(fā)表的10條野生草莓種的有效ITS序列進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖1所示。12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群樣品ITS序列均與GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的黃毛草莓ITS序列聚在一個分支上，該分支的自展值為90%，遠(yuǎn)大于閾值（75%），說明基于ITS序列的聚類分析結(jié)果可靠，本研究采集的樣品均為黃毛草莓，與植株形態(tài)分類的結(jié)果一致。

不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群樣品ITS序列間的遺傳距離如表2所示。T45與T17-23、T45與T17-46-2間的遺傳距離最遠(yuǎn)，均為0.014，T17與T18、T19和T20間的遺傳距離最近，均為0。采自昆明市的4個樣品ITS序列（T1、T5、T6和T7）間的遺傳距離為0.004±0.002，采自文山州的4個樣品ITS序列（T17、T18、T19和T21）間的遺傳距離為0，采自迪慶州的4個樣品ITS序列（T45、T46、T17-23和T17-46-2）間的遺傳距離為0.009±0.003，說明迪慶州黃毛草莓ITS序列間的遺傳距離高于昆明市和文山州黃毛草莓ITS序列間的遺傳距離，推測ITS序列能闡明黃毛草莓居群的遺傳分化與地理分布格局的相關(guān)性。

2. 1. 2 基于psbA-trnH序列的聚類分析結(jié)果 將psbA-trnH序列上傳NCBI獲取登錄號，并從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載已發(fā)表的10條野生草莓種的有效psbA-trnH序列（其所對應(yīng)的野生草莓種的類型和數(shù)量與選取的10條有效ITS序列一致）進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群樣品psbA-trnH序列均能與GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的黃毛草莓psbA-trnH序列聚在一個分支上，該分支的自展值為85%，遠(yuǎn)大于閾值（75%），說明基于psbA-trnH序列的聚類分析結(jié)果可靠，且基于psbA-trnH序列的聚類結(jié)果與基于ITS序列的聚類結(jié)果一致，均將采集的樣品鑒定為黃毛草莓，與植株形態(tài)分類的結(jié)果一致。

不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群樣品psbA-trnH序列間的遺傳距離如表3所示。P1與P17、P1與P19、P1與P17-23、P1與P17-46-2間的遺傳距離最遠(yuǎn)，均為0.025;而P5與P6、P46與P17-23、P46與P17-46-2、P17-23與P17-46-2間的遺傳距離最近，均為0。采自昆明市的4個樣品psbA-trnH序列（P1、P5、P6和P7）間的遺傳距離為0.010±0.005，采自文山州的4個樣品psbA-trnH序列（P17、P18、P19和P21）間的遺傳距離為0.003±0.003，采自迪慶州的4個樣品psbA-trnH序列（P45、P46、P17-23和P17-46-2）間的遺傳距離為0.005±0.004，說明不同地理區(qū)域的黃毛草莓psbA-trnH序列間遺傳距離排序為昆明市>迪慶州>文山州。與ITS序列間的遺傳距離相比，兩種序列均反映出文山州的黃毛草莓樣品間遺傳距離最小，且psbA-trnH序列也可較好地反映文山州的黃毛草莓樣品遺傳差異。因此，兩種序列共同使用能更好地解釋黃毛草莓居群的遺傳分化與地理分布格局的相關(guān)性。

2. 2 基于ITS與psbA-trnH的合并序列的聚類分析結(jié)果

利用SequenceMatrix 1.78分別將12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群樣品ITS與psbA-trnH序列及從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的10條野生草莓種的ITS與psbA-trnH序列進(jìn)行合并，利用PAUP 4.0對合并序列進(jìn)行同質(zhì)性檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合并序列的同質(zhì)性檢驗（P=0.01）滿足合并閾值，說明所有序列能進(jìn)行合并分析?；诤喜⑿蛄惺褂肕EGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示。將ITS和psbA-trnH序列合并后，12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群樣品均與GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的黃毛草莓聚在同一分支，該分支的自展值為99%，遠(yuǎn)大于閾值（75%）及基于ITS（自展值為90%）和psbA-trnH（自展值為85%）分別構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹自展值，且聚類結(jié)果與分別基于ITS和psbA-trnH序列的聚類分析結(jié)果一致。因此，今后可使用多種序列組合的DNA條形碼，并結(jié)合植株形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行草莓種質(zhì)鑒定，以保證鑒定的準(zhǔn)確性。

2. 3 ITS序列特征及單倍型分析結(jié)果

利用MEGA 6.0對所有的黃毛草莓ITS序列進(jìn)行比對，對位排列后得到668 bp的恒定序列，其中包括649個保守位點、10個變異位點、7個簡約信息位點和9處插入/缺失位點，變異位點百分率為1.80%，G+C含量為63.2%～63.8%。其中，9處插入/缺失位點分別位于ITS序列的2、5、6、8、12、13、14、20和665 bp位點。ITS序列共有8種單倍型（表4），Hd為0.894±0.078，π為0.006。8種單倍型中，Hap5分布于文山州廣南縣（T17）、文山州富寧縣（T18）、文山州硯山縣（T19）和文山州馬關(guān)縣（T21）的黃毛草莓樣品中，Hap8分布于迪慶州維西縣保和鎮(zhèn)（T17-23）和迪慶州維西縣白濟(jì)汛鄉(xiāng)（T17-46-2）的黃毛草莓樣品中，其余單倍型均為私有單倍型。Hap1只存在于昆明市嵩明縣的黃毛草莓樣品（T1）中，Hap2只分布于昆明市盤龍區(qū)的黃毛草莓樣品（T2）中，Hap3只分布于昆明市富民縣的黃毛草莓樣品（T3）中，Hap4只分布于昆明市祿勸縣的黃毛草莓樣品（T4）中，Hap6只分布于迪慶州德欽縣的黃毛草莓樣品（T45）中，Hap7只分布于迪慶州香格里拉市的黃毛草莓樣品（T46）中（表4）。綜上所述，昆明市黃毛草莓樣品存在4種單倍型（Hap1、Hap2、Hap3和Hap4），文山州黃毛草莓樣品存在1種單倍型（Hap5），迪慶州黃毛草莓樣品存在3種單倍型（Hap6、Hap7和Hap8）。

2. 4 psbA-trnH序列特征及單倍型分析結(jié)果

利用MEGA 6.0對所有的黃毛草莓psbA-trnH序列進(jìn)行比對，對位排列后得到203 bp的恒定序列，其中包括198個保守位點、5個變異位點和3個簡約信息位點，無插入/缺失位點，變異位點百分率為2.5%，G+C含量為18.7%～19.7%。psbA-trnH序列共有5種單倍型（表5），Hd為0.788±0.090，π為0.009。Hap4分布于文山州廣南縣（P17）、文山州硯山縣（P19）、迪慶州維西縣保和鎮(zhèn)（P17-23）、迪慶州香格里拉縣（P46）和迪慶州維西縣白濟(jì)汛鄉(xiāng)（P17-46-2）的黃毛草莓樣品;Hap3分布于昆明市祿勸縣（P7）、文山州富寧縣（P18）和文山州馬關(guān)縣（P21）的黃毛草莓樣品;Hap2分布于昆明市盤龍區(qū)（P5）和昆明市富民縣（P6）的黃毛草莓樣品;Hap1僅分布于昆明市嵩明縣（P1）的黃毛草莓樣品，Hap5僅分布于迪慶州德欽縣（P45）的黃毛草莓樣品（表5）。綜上所述，psbA-trnH序列的5種單倍型中，單倍型Hap4的黃毛草莓樣品數(shù)量最多，昆明市黃毛草莓樣品存在3種單倍型（Hap1、Hap2和Hap3），文山州黃毛草莓樣品存在2種單倍型（Hap3和Hap4），迪慶州黃毛草莓樣品存在2種單倍型（Hap4和Hap5）。

2. 5 ITS序列和psbA-trnH序列的進(jìn)化特征分析結(jié)果

運用DnaSP 5.10分別對黃毛草莓ITS和psbA-trnH序列進(jìn)行中性檢驗（Tajimas D），檢測不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群穩(wěn)定性，并分析序列中分離位點數(shù)目與核苷酸多樣性之間的關(guān)系。其中，黃毛草莓ITS序列的Tajimas D值為-0.673（P>0.1），表明12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群保持穩(wěn)定狀態(tài)，在截至目前的歷史時間內(nèi)不存在擴(kuò)張。黃毛草莓ITS序列的歧點分布情況如圖4-A所示。與期望值（Exp）相比，觀測值（Obs）曲線呈現(xiàn)多峰，說明居群在截至目前的歷史時間內(nèi)不存在擴(kuò)張或持續(xù)增長，與中性檢驗結(jié)論一致。

黃毛草莓psbA-trnH序列的Tajimas D值為0.227（P>0.1），推測12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群保持穩(wěn)定狀態(tài)，在截至目前的歷史時間內(nèi)不存在擴(kuò)張。黃毛草莓psbA-trnH序列的歧點分布情況如圖4-B所示。與期望值（Exp）相比，觀測值（Obs）曲線呈現(xiàn)多峰，得到的曲線呈現(xiàn)多峰，說明居群在歷史時間內(nèi)不存在擴(kuò)張或持續(xù)增長，與中性檢驗結(jié)論一致。

可見，云南省不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群保持穩(wěn)定狀態(tài)，在截至目前的歷史時間內(nèi)不存在擴(kuò)張。

3 討論

3. 1 黃毛草莓的分子鑒定及DNA分子條形碼

目前，國內(nèi)學(xué)者主要依據(jù)傳統(tǒng)植物形態(tài)學(xué)方法，從植株莖、葉、花和果等組織器官形態(tài)特征對野生草莓進(jìn)行種質(zhì)鑒定（代漢萍等，2007;趙密珍等2010）及種質(zhì)資源收集（蘇代發(fā)等，2018）。由于部分野生草莓種質(zhì)的植株具有相似的形態(tài)學(xué)特征（雷家軍等，2008）或采集時形態(tài)學(xué)指標(biāo)收集不全（德慶措姆等，2012），導(dǎo)致無法準(zhǔn)確地分類鑒定。本課題組在對云南省野生草莓進(jìn)行收集時，也發(fā)現(xiàn)大部分野生草莓植株在沒有花和果實的情況下很難通過植株形態(tài)學(xué)特征準(zhǔn)確鑒定到種的水平。近年來，隨著植物DNA分子技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)植株形態(tài)學(xué)分類的瓶頸逐漸被攻克，不僅可快捷、準(zhǔn)確地實現(xiàn)植物物種鑒定及分類，還可從分子水平探究植物的親緣關(guān)系、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化及遺傳多樣性等。國外對野生草莓分子水平的研究起步較早，已有學(xué)者利用ITS和psbA-trnH序列對草莓屬的栽培品種和野生種進(jìn)行分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究（Eriksson et al.，1998;Potter et al.，2002;Njuguna，2010）。本研究首次使用ITS和psbA-trnH序列對云南省自然分布的野生黃毛草莓種質(zhì)資源進(jìn)行分子鑒定，并將供試樣品的ITS和psbA-trnH序列進(jìn)行合并，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓樣品均與GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的黃毛草莓聚在同一分支，該分支的自展值為99%，遠(yuǎn)大于基于ITS（自展值為90%）和psbA-trnH（自展值為85%）分別構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹自展值，表明兩種序列合并可提高黃毛草莓分子鑒定結(jié)果的可信度。因此，ITS和psbA-trnH可作為黃毛草莓的DNA分子條形碼。該結(jié)果與Potter等（2000）、Njuguna（2010）的研究結(jié)論相似。雖然本研究黃毛草莓分子鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類鑒定結(jié)果一致，但分子鑒定更加快捷，不易受主觀因素影響。

3. 2 黃毛草莓ITS和psbA-trnH序列的進(jìn)化特征

韓柏明等（2012）、Meng等（2015）、徐蘇婷（2017）分別利用SSR分子標(biāo)記對草莓屬不同種之間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性進(jìn)行分析。隨著分子測序技術(shù)的完善，現(xiàn)多用nrDNA和cpDNA的序列片段進(jìn)行相關(guān)研究。本研究中12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓樣品ITS序列間遺傳距離為0～0.014，從大到小排序為迪慶州（0.009±0.003）>昆明市（0.004±0.002）>文山州（0）;12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群樣品psbA-trnH序列間的遺傳距離為0～0.025，從大到小排序為昆明市（0.010±0.005）>迪慶州（0.005±0.004）>文山州（0.003±0.003），說明不同地理區(qū)域的黃毛草莓遺傳特征存在差異，推測云南省黃毛草莓ITS和psbA-trnH序列的遺傳特性與其地理分布具有一定的相關(guān)性。白明明等（2012）、許子欣等（2018）基于ITS序列和psbA-trnH序列分別對不同地理區(qū)域的巴戟天和何首烏進(jìn)行遺傳特性分析，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)二者的遺傳變異與地理分布存在一定的相關(guān)性。

12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群樣品ITS序列共有8個單倍型，其中昆明市存在4種單倍型（Hap1、Hap2、Hap3和Hap4），文山州僅存在1種單倍型（Hap5），迪慶州存在3種單倍型（Hap6、Hap7和Hap8）;psbA-trnH序列共有5種單倍型，其中Hap4分布最廣，昆明市存在3種單倍型（Hap1、Hap2和Hap3），文山州存在2種單倍型（Hap3和Hap4），迪慶州存在2種單倍型（Hap4和Hap5）。依據(jù)本研究兩種序列的單倍型分布來看，云南省黃毛草莓區(qū)域性分布特征明顯，不同地理區(qū)域具有自己獨特的單倍型。該結(jié)果與柏國清等（2017）、林爽等（2017）和劉振等（2018）分別對秦巴山區(qū)漆樹、破布葉和湖南茶樹資源的研究結(jié)論一致。此外，本研究黃毛草莓ITS和psbA-trnH序列的歧點分布分析結(jié)果均表明，云南省12個不同地理區(qū)域的黃毛草莓居群保持穩(wěn)定狀態(tài)，在截至目前的歷史時間內(nèi)不存在擴(kuò)張。推測其原因是由于云南省不同地理區(qū)域的地形地貌復(fù)雜，海拔差異顯著、氣候和環(huán)境因子異質(zhì)性等特征為黃毛草莓提供了不同的生境條件，維持了黃毛草莓各自的遺傳特性。也正因為云南省獨特的地理氣候資源，致使不同地理區(qū)域的黃毛草莓ITS序列和psbA-trnH序列存在豐富的遺傳多樣性。Njuguna等（2013）、Qiao等（2016）分別利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)草莓屬植物可能起源于東亞地區(qū)，而本研究中使用的DNA條形碼能較好地探討黃毛草莓地理分布格局。因此，在今后的研究中，應(yīng)加大各居群采樣量，并使用多種分子標(biāo)記共同探討黃毛草莓譜系地理學(xué)的相關(guān)問題，為解釋草莓屬的分子進(jìn)化和地理分布格局提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

從云南不同地理區(qū)域采集的樣品均為黃毛草莓。ITS序列和psbA-trnH序列均可作為黃毛草莓的DNA條形碼，二者合并序列更能準(zhǔn)確鑒定黃毛草莓種，適用于黃毛草莓分子譜系地理學(xué)研究。

參考文獻(xiàn)：

白明明，孫小芹，郭建林，李密密，杭悅宇. 2012. 基于psbA-trnH分析的何首烏野生居群遺傳多樣性[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報，21（2）：36-44. [Bai M M，Sun X Q，Guo J L，Li M M，Hang Y Y. 2012. Genetic diversity of wild populations of Faliopia multiflora based on psbA-trnH analysis[J]. Journal of Plant Resources and Environment，21（2）：36-44.]

柏國清，李為民，陳昊，黎斌，李思鋒. 2017. 秦巴山區(qū)漆樹nrDNAITS和cpDNA序列分子進(jìn)化特點的分析[J]. 植物研究，37（4）：579-586. [Bai G Q，Li W M，Chen H，Li B，Li S F. 2017. Characteristics of molecular evolution of Toxicodendron vernicifluum in Qinba mountains by nrDNA ITS and cpDNA sequence[J]. Bulletin of Botanical Research，37（4）：579-586.]

陳丙義，李金鳳，霍恒志，萬春雁，章鎮(zhèn)，喬玉山，糜林. 2015. 6種野生草莓基因組大小估算[J]. 果樹學(xué)報，32（1）：51-56. [Chen B Y，Li J F，Huo H Z，Wan C Y，Zhang Z，Qiao Y S，Mi L. 2015. Estimation of genome size in six wild strawberry species[J]. Journal of Fruit Science，32（1）：51-56.]

代漢萍，雷家軍，鄧明琴. 2007. 長白山野生草莓資源的調(diào)查與分類研究[J]. 園藝學(xué)報，34（1）：63-66. [Dai H P，Lei J J，Deng M Q. 2007. Investigation and studies on classification of wild Fragaria spp. distributed in Changbai Mountains[J]. Acta Horticulturae Sinica，34（1）：63-66.]

德慶措姆，格桑，薛莉，雷家軍. 2012. 西藏野生草莓資源的地理分布初報[J]. 中國果樹，（4）：22-24. [De Q C M，Ge S，Xue L，Lei J J. 2012. Preliminary report on geographical distribution of wild strawberry resources in Tibet[J]. China Fruit，（4）：22-24.]

鄧明琴，雷家軍. 2005. 中國果樹志·草莓卷[M]. 北京：中國林業(yè)出版社. [Deng M Q，Lei J J. 2005. Chinese fruit tree records·Strawberry[M]. Beijing：China Forestry Publi-shing House.]

韓柏明，趙密珍，王靜，于紅梅. 2012. 草莓屬種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SSR標(biāo)記分析[J]. 園藝學(xué)報，39（12）：2352-2360. [Han B M，Zhao M Z，Wang J，Yu H M. 2012. Phylogenetic relationships among Fragaria germplasm by SSR markers[J]. Acta Horticulturae Sinica，39（12）：2352-2360.]

江紀(jì)武. 2005. 藥用植物辭典[M]. 天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社. [Jiang J W. 2005. Dictionary of medicinal plants[M]. Tianjin：Tianjin Science and Technology Press.]

姜玉素，李珍，王慶蓮，趙密珍，宋志忠. 2019. 草莓KEA家族基因的克隆、鑒定及表達(dá)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，35（2）：391-399. [Jiang Y S，Li Z，Wang Q L，Zhao M Z，Song Z Z. 2019. Cloning，characterization and expression analy-sis of KEA family genes in strawberry[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，35（2）：391-399.]

雷家軍，代漢萍，譚昌華，鄧明琴，趙密珍，錢亞明. 2006. 中國草莓屬（Fragaria）植物的分類研究[J]. 園藝學(xué)報，33（1）：1-5. [Lei J J，Dai H P，Tan C H，Deng M Q，Zhao M Z，Qian Y M. 2006. Studies on the taxonomy of the strawberry（Fragaria） species distributed in China[J]. Acta Horticulturae Sinica，33（1）：1-5.]

雷家軍，代漢萍，趙密珍，吳偉民. 2008. 中國分布四倍體野生草莓的調(diào)查研究[J]. 果樹學(xué)報，25（3）：358-361. [Lei J J，Dai H P，Zhao M Z，Wu W M. 2008. Study on the te-traploid Fragaria species distributed in China[J]. Journal of Fruit Science，25（3）：358-361.]

李桂香，呂建召，肖湘滇，沈發(fā)春. 2017. 云南野生黃毛草莓鮮果的營養(yǎng)成分分析[J]. 大理大學(xué)學(xué)報，2（6）：64-67. [Li G X，Lü J Z，Xiao X D，Shen F C. 2017. Analysis of nutritional compositions of Yunnan wild Fragaria nilgerrensis Schlecht fresh fruit[J]. Journal of Dali University，2（6）：64-67.]

李洪雯，劉建軍，何健，關(guān)斌，王建輝，李旭鋒，陳克玲. 2012. 四川及其周邊地區(qū)野生草莓資源調(diào)查、收集與評價[J]. 植物遺傳資源學(xué)報，13（6）：946-951. [Li H W，Liu J J，He J，Guan B，Wang J H，Li X F，Chen K L. 2012. Investigation，collection and evaluation on wild strawberry resources in Sichuan and neighboring regions[J]. Journal of Plant Genetic Resources，13（6）：946-951.]

林爽，吳海燕，張宏意，李坤平. 2017. 不同地理居群破布葉的psbA-trnH和ITS2序列及其聚類分析[J]. 中草藥，48（7）：1403-1408. [Lin S，Wu H Y，Zhang H Y，Li K P. 2017. Cluster analysis on psbA-trnH and ITS2 sequences of Microcos paniculata from different geographical populations[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，48（7）：1403-1408.]

劉宇婧，劉越，黃耀江，龍春林. 2011. 植物DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報，20（1）：74-82. [Liu Y J，Liu Y，Huang Y J，Long C L. 2011. Progress and application of DNA barcoding technique in plants[J]. Journal of Plant Resources and Environment，20（1）：74-82.]

劉振，成楊，趙洋，楊培迪，楊陽. 2018. 基于葉綠體rbcL和trnH-psbA序列的湖南茶樹資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系研究[J]. 熱帶作物學(xué)報，39（1）：40-45. [Liu Z，Cheng Y，Zhao Y，Yang P D，Yang Y. 2018. Genetic diversity and relationship study of Hunan tea germplasm resources based on chloroplast rbcL and trnH-psbA sequence[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，39（1）：40-45.]

呂澤良，張永剛，韓梅，劉翠晶. 2017. 不同產(chǎn)地黃芩ITS2和psbA-trnH條形碼序列分析[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，39（1）：42-48. [Lü Z L，Zhang Y G，Han M，Liu C J. 2017. Sequence analysis of ITS2 and psbA-trnH DNA barcode of wild populations of Scutellaria baicalensis Georgi from different producing areas[J]. Journal of Jilin Agricultural University，39（1）：42-48.]

寧淑萍，顏海飛，郝剛，葛學(xué)軍. 2008. 植物DNA條形碼研究進(jìn)展[J]. 生物多樣性，16（5）：417-425. [Ning S P，Yan H F，Hao G，Ge X J. 2008. Current advances of DNA barcoding study in plants[J]. Biodiversity Science，16（5）：417-425.]

彭小鳳，何濤，淳澤，胡亞東，萬閏蘭. 2015. 基于葉綠體psbA-trnH和核糖體5S rRNA基因間隔區(qū)序列的石斛種間和種內(nèi)鑒別[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，21（5）：887-896. [Peng X F，He T，Chun Z，Hu Y D，Wan R L. 2015. Interspecific and intraspecific identification of Dendrobium based on the psbA-trnH intergenic region sequences and the 5S rRNA gene spacer sequences[J]. Chinese Journal of Applied & Environmental Biology，21（5）：887-896.]

任保青，陳之端. 2010. 植物DNA條形碼技術(shù)[J]. 植物學(xué)報，45（1）：1-12. [Ren B Q，Chen Z D. 2010. DNA Barco-ding Plant Life[J]. Bulletin of Botany，45（1）：1-12.]

蘇代發(fā)，童江云，楊俊譽(yù)，陳杉艷，羅志偉，沈雪梅，賴泳紅，Arslan Jamil，魏世杰，崔曉龍. 2018. 中國草莓屬植物種質(zhì)資源的研究、開發(fā)與利用進(jìn)展[J]. 云南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），40（6）：1261-1276. [Su D F，Tong J Y，Yang J Y，Chen S Y，Luo Z W，Shen X M，Lai Y H，Arslan J，Wei S J，Cui X L. 2018. Advances in research，exploitation and utilization of Fragaria spp. germplasm resources in China[J]. Journal of Yunnan University（Natural Scien-ces Edition），40（6）：1261-1276.]

王燕，陳丙義，章鎮(zhèn)，高志紅，喬玉山. 2012. 黃毛草莓組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，25（1）：252-256. [Wang Y，Chen B Y，Zhang Z，Gao Z H，Qiao Y S. 2012. Study on tissue culture and rapid propagation technique of Fragaria nilgerrensis[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，25（1）：252-256.]

徐蘇婷. 2017. 不同果色五葉草莓遺傳結(jié)構(gòu)的形成及機(jī)制[D]. 上海：上海師范大學(xué). [Xu S T. 2017. Formation and mechanism of genetic structure of Fragaria pentaphylla with different fruit color[D]. Shanghai：Shanghai Normal University.]

徐蘇婷，陳露茜，李鈞敏. 2018. 二倍體與四倍體黃毛草莓的光合特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，46（5）：110-112. [Xu S T，Chen L Q，Li J M. 2018. Study on photosynthetic characteristics of diploid and tetraploid Fragarianil gerrensis[J]. Jiangsu Agricultural Sciences，46（5）：110-112.]

許子欣，冉志芳，楊小彤，郝慶秀，余意，周潔，郭蘭萍. 2018. 基于psbA-trnH和rDNA ITS序列的不同地理居群巴戟天聚類分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，49（12）：2364-2370. [Xu Z X，Ran Z F，Yang X T，Hao Q X，Yu Y，Zhou J，Guo L P. 2018. Cluster analysis of Morinda officinalis How in di-fferent geographical populations based on psbA-trnH and rDNA ITS sequences[J]. Journal of Southern Agriculture，49（12）：2364-2370.]

楊雷，李莉，董輝，季文章，楊莉. 2018. 應(yīng)用灰色關(guān)聯(lián)分析法篩選優(yōu)良草莓新品種（系）[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，30（12）：47-50. [Yang L，Li L，Dong H，Ji W Z，Yang L. 2018. Screening of excellent strawberry new varieties（strains） by using grey relevant analysis method[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，30（12）：47-50.]

余桂紅，馬鴻翔，吳偉民，李曉剛，孟憲鳳. 2002. 草莓屬野生種質(zhì)資源的離體培養(yǎng)[J]. 湖北農(nóng)學(xué)院學(xué)報，22（4）：316-318. [Yu G H，Ma H X，Wu W M，Li X G，Meng X F. 2002. The in vitro culture of wild germplasm resources of strawberries[J]. Journal of Hubei Agricultural College，22（4）：316-318.]

趙密珍，王壯偉，陶磅，錢亞明，王靜，仇明華. 2010. 滇西北野生草莓資源考察研究初報[C]//第四屆全國果樹種質(zhì)資源研究與開發(fā)利用學(xué)術(shù)研討會論文匯編. 北京：園藝學(xué)會，136-138. [Zhao M Z，Wang Z W，Tao P，Qian Y M，Wang J，Qiu M H. 2010. Preliminary study on wild strawberry resources in northwest Yunnan[C]//Collection of papers of the 4th national symposium on research，development and utilization of fruit germplasm resources. Beijing：Horticultural Society，136-138.]

中國科學(xué)院昆明植物研究所. 2006. 云南植物志[M]. 第十二卷. 北京：科學(xué)出版社. [Kunming Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences. 2006. Flora of Yunnan. Volume 12[M]. Beijing：Science Press.]

China Plant BOL Group，Li D Z，Gao L M，Li H T，Wang H，Ge X J，Liu J Q，Chen Z D，Zhou S L，Chen S L，Yang J B，F(xiàn)u C X，Zeng C X，Yan H F，Zhu Y J，Sun Y S，Chen S Y，Lei Z，Wang K，Yang T，Duan G W. 2011. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer（ITS） should be incorporated into the core barcode for seed plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，108（49）：19641-19646.

Eriksson T，Donoghue M J，Hibbs M S. 1998. Phylogenetic analysis of Potentilla using DNA sequences of nuclear ribosomal internal transcribed spacers（ITS），and implications for the classification of Rosoideae（Rosaceae）[J]. Plant Systematics and Evolution，211（3-4）：155-179.

Fazekas A J，Burgess K S，Kesanakurti P R，Graham S W，Newmaster S G，Husband B C，Percy D M，Hajibabaei M，Barrett S C. 2008. Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equa-lly well[J]. PloS One，3（7）：e2802.

Hollingsworth P M，Graham S W，Little D P. 2011. Choosing and using a plant DNA barcode[J]. PloS One，6（5）：e19254.

Kress W J，Wurdack K J，Zimmer E A，Weigt L A，Janzen D H. 2005. Use of DNA barcodes to identify flowering plants[J]. Proceedings of the National Academy of Scien-ces，102（23）：8369-8374.

Librado P，Rozas J. 2009. DnaSP v5：A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics，25（11）：1451-1452.

Meng F，Liu L，Peng M，Wang Z，Wang C，Zhao Y. 2015. Genetic diversity and population structure analysis in wild strawberry（Fragaria nubicola L.） from Motuo in Tibet Plateau based on simple sequence repeats（SSRs）[J]. Biochemical Systematics and Ecology，63：113-118.

Na Y W，Jeong H J，Lee S Y，Choi H G，Kim S H，Rho I R. 2014. Chlorophyll fluorescence as a diagnostic tool for abiotic stress tolerance in wild and cultivated strawberry species[J]. Horticulture，Environment and Biotechnology，55（4）：280-286.

Njuguna W. 2010. Development and use of molecular tools in Fragaria[D]. Corvallis：Oregon State University.

Njuguna W，Liston A，Cronn R，Ashman T L，Bassil N. 2013. Insights into phylogeny，sex function and age of Fraga-ria based on whole chloroplast genome sequencing[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，66（1）：17-29.

Potter D，Gao F，Bortiri P E，Oh S H，Baggett S. 2002. Phylogenetic relationships in Rosaceae inferred from chloroplast matK and trnL-trnF nucleotide sequence data[J]. Plant Systematics and Evolution，231（1-4）：77-89.

Potter D，Luby J J，Harrison R E. 2000. Phylogenetic relationships among species of Fragaria（Rosaceae） inferred from non-coding nuclear and chloroplast DNA sequences[J]. Systematic Botany，25（2）：337-349.

Qiao Q，Xue L，Wang Q，Sun H，Zhong Y，Huang J J，Lei J J，Zhang T C. 2016. Comparative transcriptomics of strawberries（Fragaria spp.） provides insights into evolutio-nary patterns[J]. Frontiers in Plant Science，7：1839. doi： 10.3389/fpls.2016.01839. eCollection 2016.

Vaidya G，Lohman D J，Meier R. 2011. SequenceMatrix：Concatenation software for the fast assembly of multi-gene datasets with character set and codon information[J]. Cladistics，27（2）：171-180.

Whitaker V M. 2011. Applications of molecular markers in strawberry[J]. Journal of Berry Research，1（3）：115-127.

（責(zé)任編輯 陳 燕）