盧家仕 韋紹龍 黃素梅 韋弟 李朝生 龍盛風 覃柳燕

摘要：【目的】采用ISSR分子標記對13份廣西收集引進和選育的香蕉種質資源進行遺傳多樣性分析，為廣西香蕉品種改良及枯萎病抗性育種提供參考依據?！痉椒ā繌?00條ISSR引物中篩選出多態(tài)性引物進行PCR擴增，利用PoPgen 1.32計算遺傳多樣性指數，DICE法計算遺傳相似系數。利用非加權平均距離法（UPGMA）進行聚類分析。【結果】共篩選出8條擴增產物條帶清晰、多態(tài)性好的ISSR引物，利用其從13份香蕉種質材料中擴增出234條條帶，平均每條引物擴增出29.25條條帶，其中多態(tài)性條帶229條，多態(tài)性比率97.86%，平均觀察等位基因數（Na）1.9786、有效等位基因數（Ne）1.4023、Shannon多樣性信息指數（I）0.2603、Neis基因多樣性指數（H?）0.4135。13份香蕉種質材料的遺傳相似系數為0.50～0.90，其中，巴貝多與GK1的遺傳相似系數最小，為0.50，抗枯1號與抗枯5號的遺傳相似系數最大，為0.90。在遺傳相似系數0.59處可將13份香蕉種質資源聚成四大組，其中第Ⅱ組在相似系數0.74處被分為a和b亞組。在遺傳相似系數0.90處可將13份香蕉種質材料完全區(qū)分開?！窘Y論】廣西香蕉種質資源的遺傳多樣性非常豐富。利用ISSR分子標記可將遺傳背景及形態(tài)特征不同的香蕉種質資源進行有效分類，可用于香蕉種質資源分類、親緣關系鑒定及輔助育種等研究。

關鍵詞： 香蕉;種質資源;ISSR分子標記;遺傳多樣性;親緣關系;聚類分析

Abstract：【Objective】The genetic diversity and the genetic relationship among 13 accessions of introduced and bred banana germplasm resouces in Guangxi were analyzed by using molecule marker technique of inter-simple sequence repeat（ISSR） in order to provide references for banana variety improvement and breed of fusarium wilt resistant varieties in Guangxi. 【Method】The polymorphic primers were screened from 100 ISSR primers for PCR amplification. The genetic diversity index was calculated by PoPgen 1.32 soft and the genetic similarity coefficient was calculated by DICE method. Furthermore， the cluster analysis of different banana germplasm resources was analyzed by using unweighted pair-group method with arithmetic means（UPGMA）. 【Result】Eight ISSR primers，that could amplify stable and clear bands with fine polymorphism， were screened from 100 ISSR primers.The 234 bands in total were amplified from 13 accessions of banana germplasm resources， and each primer in average could amplify 29.25 bands. Of which， 229 amplified bands were present polymorphic and the polymorphism rate was 97.86 %. Through analysis of genetic diversity， the mean observed number of alleles（Na） was 1.9786， the effective number of alleless（Ne） was 1.4023，? the Shannons Information index（I） was 0.2603 and the Neis genetic diversity index（H） was 0.4135. The genetic similar coefficient among 13 accessions ranged from 0.50 to 0.90; the genetic similarity coefficient between Barbados and GK1 was the lowest with 0.50， and that of Kangku 1 and Kangku 5 was the highest with 0.90. The 13 accessions could be classified into four groups（I，II， III and IV） at the genetic similarity coefficient of 0.59， and the II group could be divided into two subgroups（a and b） at the similarity coefficient of 0.74. Meanwhile， 13 accessions could be completely distinguished at the genetic similarity coefficient of 0.90. 【Conclusion】The banana germplasm resources in Guangxi present very rich genetic diversity. The genetic background and the morphological difference can be effectively classified by using the ISSR molecular marker technique，which would be helpful for germplasm resources classification， identification of genetic relationship and banana assisted breeding.

0 引言

【研究意義】香蕉是芭蕉科芭蕉屬多年生草本植物，是熱帶亞熱帶地區(qū)的重要水果，栽培面積大，其產量較柑橘、葡萄和蘋果高，被譽為“世界果王”（許林兵，2006）。我國南部是香蕉原產地之一。香蕉栽培品種多數為三倍體，主要由兩個野生品種尖葉蕉（A基因組）與長梗蕉（B基因組）種內或種間雜交、變異、進化而成（秦獻泉等，2007;牟海飛等，2010）。根據植株形態(tài)特征和經濟特性，我國主要食用香蕉可分為香牙蕉（AAA）、大蕉（ABB）、粉蕉（ABB）、龍牙蕉（AAB）和貢蕉（AA）等五大類（張展偉，2010）。由于植物性狀通常受環(huán)境因素和遺傳基因的影響導致品種特性發(fā)生改變，僅靠形態(tài)特征較難區(qū)分開來，不利于種質資源保護及開發(fā)利用。分子標記技術不受環(huán)境條件和植物生長發(fā)育的影響，已被廣泛用于植物種質資源的遺傳多樣性及親緣關系分析，為分子輔助育種提供技術支持。因此，利用分子標記技術開展香蕉種質資源的遺傳多樣性分析，探究其親緣關系，對香蕉種質資源開發(fā)利用及抗病品種選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，已有大量利用分子標記技術開展香蕉遺傳多樣性分析的研究報道。于曉英（2001）、譚衛(wèi)萍等（2010）利用AFLP分子標記對香蕉種質資源進行遺傳多樣性分析。陳源等（2008）利用RAPD分子標記對香蕉種質資源進行遺傳多樣性分析。李博等（2011）利用cqSSR分子標記對香蕉種質資源進行遺傳多樣性分析。謝子四等（2012）、漆艷香等（2017）分別利用SRAP分子標記對香蕉種質資源進行遺傳多樣性分析。孫嘉曼等（2016）、林丹鑾（2017）分別利用 SSR分子標記對香蕉種質資源進行遺傳多樣性分析。以上分子標記較穩(wěn)定、可靠、操作簡便，不受外部環(huán)境條件干擾，但存在一些缺點，如AFLP分子標記需要高質量的DNA模板及制膠技術，RAPD分子標記重復性較差，SSR和cqSSR分子標記的引物開發(fā)較因難，SRAP分子標記則需要分別設計其正、反向引物再兩兩配對篩選引物，實驗操作較復雜。ISSR分子標記克服了上述分子標記的缺點，具有對DNA模板質量要求低、引物設計容易、操作簡單、多態(tài)性好、可重復性高等優(yōu)點，已廣泛應用于對香蕉種質資源的遺傳多樣性分析研究，如劉紹欽等（2007）、牟海飛等（2010）分別利用ISSR分子標記對廣東選育和國外引進的香蕉種質資源進行遺傳多樣性分析?！颈狙芯壳腥朦c】目前，鮮見利用ISSR分子標記對廣西收集引進和選育的香蕉種質資源進行遺傳多樣性分析的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】以廣西收集和選育的香蕉種質資源為研究對象，采用ISSR分子標記分析其遺傳多樣性及親緣關系，為廣西香蕉枯萎病抗性育種及品種改良提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試香蕉種質名稱及來源見表1。Taq DNA Polymerase、超純水和dNTPs購自生工生物工程（上海）股份有限公司;ISSR引物、酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）、氯仿∶異戊醇（24∶1）、2% β巰酯乙醇和其他生化試劑均購自國拓生物技術有限公司。主要儀器設備：Grant GR150水浴鍋（GR150-12，英國）、Bio Photometer RNA/DNA濃度電度測定儀（Eppendorf，德國）、Biometra TProfessional PCR儀（Tprofe，德國）、MixMate PBC-11 5353混勻儀（Eppendorf，德國）、MIKRO 220R 2205冷凍離心機（HETTICH，德國）、EN 61010-1電泳儀（Bio-Rad，美國）、DYCP-31DN型電泳槽（北京市六一儀器廠）和Firereader XS D-56-26.M凝膠成像系統(tǒng)（UVI，英國）等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 采集香蕉新鮮完全未展開心葉，參考改良的CTAB法（盧家仕等，2012）提取其基因組DNA，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，紫外分光光度計檢測其濃度和純度。

1. 2. 2 ISSR引物合成及篩選 利用加拿大哥倫比亞大學設計并公布的100條ISSR引物序列，由國拓生物技術有限公司合成。同時選取抗枯萎病品系GK1和主栽的感枯萎病品種桂蕉1號進行引物初篩，從中篩選出擴增產物條帶清晰、多態(tài)性好的引物用于后續(xù)試驗。

1. 2. 3 ISSR反應體系及擴增程序 反應體系20.0 μL：10×Buffer 2.0 ?L，10 mmol/L dNTPs 0.4 ?L，5 U/?L Taq DNA Polymerase 0.2 ?L，10-5 ?mol/?L引物1.0 ?L，40 ng/?L DNA模板1.5 ?L，超純水補足至20.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 50 s，50～55 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，共進行38個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增反應在Biometra TProfessional PCR儀上完成。擴增產物加入3.5 uL含核酸染料的6×Loading Buffer充分混勻后取其10.0 ?L用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為1×TAE，電壓110 V，電泳時間50 min，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照觀察。

1. 3 統(tǒng)計分析

觀察ISSR-PCR擴增產物的電泳圖譜，同一水平線上有條帶記為1，無條帶記為0，得到[0，1]矩陣，統(tǒng)計條帶數量。將[0，1]矩陣導入PoPgen 1.32計算多態(tài)性比率、觀察等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shannon多樣性信息指數（I）和Neis基因多樣性指數（H?）等遺傳多樣性指數。最后將[0，1]矩陣導入NTsys 2.10e，利用DICE法計算遺傳相似系數，用非加權平均距離法（UPGMA）進行聚類分析，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結果與分析

黃秉智，唐小浪，許林兵，楊護，魏岳榮，邱繼水，吳潔芳. 2009. 香蕉抗枯萎病品種抗枯5號引種試驗[J]. 中國果樹，（6）：17-19. [Huang B Z，Tang X L，Xu L B，Yang H，Wei Y R，Qiu J S，Wu J F. 2009. Introduction experiment of banana Fusarium oxysporum resistant variety Kangku 5[J]. China Fruit Tree，（6）：17-19.]

黃秉智，楊護，許林兵，唐小浪，魏岳榮，邱繼水. 2005. 抗枯萎病香蕉品種新北蕉引種試驗初報[J]. 廣東農業(yè)科學，（5）：33-34. [Huang B Z，Yang H，Xu L B，Tang X L，Wei Y R，Qiu J S. 2005. Preliminary report on introduction experiment of banana variety resistant to Fusarium oxysporum[J]. Guangdong Agricultural Science，（5）：33-34.]

黃素梅，韋紹龍，龍盛風，田丹丹，覃柳燕，韋弟，李朝生，韋華芳，李小泉. 2014. 幾個香蕉品種對枯萎病的抗性與主要性狀比較[J]. 中國南方果樹，43（5）：74-77. [Huang S M，Wei S L，Long S F，Tian D D，Qin L Y，Wei D，Li C S，Wei H F，Li X Q. 2014. Comparison of resistance and main characters of several banana varieties to Fusarium wilt[J]. Fruit Trees in Southern China，43（5）：74-77.]

李博，馮慧敏，王靜毅，童和林，陳友，武耀廷. 2011. 基于cpSSR 分子標記的香蕉種質資源分類[J]. 果樹學報，28（6）：1012-1018. [Li B，Feng H M，Wang J Y，Tong H L，Chen Y，Wu Y T. 2011. The classification of Musa species using chloroplast SSR primers[J]. Journal of Fruit Science，28（6）：1012-1018.]

李建華. 2002. 臺灣香蕉栽培品種介紹[J]. 臺灣農業(yè)探索，（3）：43-44. [Li J H. 2002. Introduction to cultivated varie-ties of banana in Taiwan[J]. Exploration of Taiwans Agri-culture，（3）：43-44.]

林丹鑾. 2017. 應用SSR技術研究香蕉種質資源的遺傳多樣性[D]. 南昌：江西農業(yè)大學. [Lin D L. 2017. Study on genetic diversity of banana germplasm by using SSR[D]. Nanchang：Jiangxi Agricultural University.]

林貴美，李小泉，韋紹龍，鄒瑜，張進忠. 2012. 桂蕉1號香蕉種植試驗[J]. 中國熱帶農業(yè)，（5）：64-65. [Lin G M，Li X Q，Wei S L，Zou Y，Zhang J Z. 2012. Experiment on banana planting of Guijiao No.1[J]. China Tropical Agriculture，（5）：64-65.]

劉紹欽，黃上志，梁張慧，陳蕓蕓. 2007. ISSR分子標記技術在香蕉分類上的應用[J]. 西南大學學報（自然科學版），29（2）： 70-74. [Liu S Q，Huang S Z，Liang Z H，Chen Y Y. 2007. Application of inter-simple sequence repeat mar-kers in the classification of banana[J]. Journal of Southwest University（Natural Science Edition），29（2）：70-74.]

盧家仕，卜朝陽，呂維莉，何荊洲，蘇建睦，黃昌艷. 2012. 20份蘭科植物的ISSR遺傳多樣性分析[J]. 西南農業(yè)學報，25（6）：2252-2257. [Lu J S，Bu Z Y，Lü W L，He J Z，Su J M，Huang C Y. 2012. Analysis on the genetic diversity of 20 plants of Orchidaceae by ISSR molecular marker[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，25（6）：2252-2257.]

牟海飛，林貴美，鄒瑜，李小泉，李朝生，韋華芳，吳代東，張進忠，王趣有，潘永杰，陳忠良. 2010. 利用ISSR分子標記分析香蕉品種的遺傳多樣性[J]. 西南農業(yè)學報，23（4）：1206-1210. [Mou H F，Lin G M，Zou Y，Li X Q，Li C S，Wei H F，Wu D D，Zhang J Z，Wang Q Y，Pan Y J，Chen Z L. 2010. Genetic diversity analysis of banana（Musa spp.） based on ISSR molecular marker[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，23（4）：1206-1210.]

漆艷香，張欣，彭軍，張賀，謝藝賢. 2017. 香蕉種質資源的SRAP遺傳多樣性分析[J]. 分子植物育種，15（10）：4220-4227. [Qi Y X，Zhang X，Peng J，Zhang H，Xie Y X. 2017. Genetic diversity analysis of banana germplasms based on SRAP molecular markers[J]. Molecular Plant Breeding，15（10）：4220-4227.]

秦獻泉，彭宏祥，曹輝慶. 2007. 香蕉種植資源研究與利用進展[J]. 廣西農學報，22（6）：53-56. [Qin X Q，Peng H X，Cao H Q. 2007. Research and utilization of banana germplasm resources[J]. Journal of Guangxi Agriculture，22（6）：53-56.]

孫嘉曼，尹玲，張進忠，韋紹龍，李朝生，劉金成，盧江. 2016. 廣西香蕉種質資源的SSR分析[J]. 西南農業(yè)學報，29（8）：1952-1957. [Sun J M，Yin L，Zhang J Z，Wei S L，Li C S，Liu J C，Lu J. 2016. SSR analysis of banana cultivars/accessions in Guangxi[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，29（8）：1952-1957.]

譚衛(wèi)萍，張秋明，于曉英，曾繼吾，黃秉智，易干軍. 2010. 香蕉種質遺傳多樣性與親緣關系的 AFLP 分析[J]. 植物遺傳資源學報，11（6）：715-720. [Tan W P，Zhang Q M，Yu X Y，Zeng J W，Huang B Z，Yi G J. 2010. Studies on the genetic diversity and relationship of banana by AFLP[J]. Journal of Plant Genetic Resources，11（6）：715-720.]

王芳，夏玲，胡貝，呂順，曾莉莎，劉文清，韓秀香. 2018. 香牙蕉與枯萎病4號小種抗性相關的SCAR分子標記開發(fā)[J]. 分子植物育種，16（15）：4991-5000. [Wang F，Xia L，Hu B，Lü S，Zeng L S，Liu W Q，Han X X. 2018. Development of? SCAR molecular marker related with resistance to Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 in banana（Musa AAA cavendish）[J]. Molecular Plant Bree-ding，16（15）：4991-5000.]

謝子四，劉德兵，魏守興，陳業(yè)淵，謝建吉，魏軍亞. 2012. 29個香蕉基因型遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 西北植物學報，32（8）：1547-1552. [Xie Z S，Liu D B，Wei S X，Chen Y Y，Xie J J，Wei J Y. 2012. Analysis of genetic diversity of 29 banana genetypes by SRAP[J]. Acta Botani-ca Boreal Sinica，32（8）：1547-1552.]

許林兵. 2006. 世界香蕉產業(yè)狀況與發(fā)展趨勢[J]. 廣東農業(yè)科學，（10）：106-109. [Xu L B. 2006. Industrial situation and development trend of banana industry in the world[J]. Guangdong Agricultural Science，（10）：106-109.]

許林兵，張錫炎，李華平，陳彪，黃秉智，陳維信，馮巖，肖維強，周登博，甘東泉. 2017. 抗枯萎病香蕉新品種‘南天黃選育[J]. 熱帶作物學報，38（6）：998-1004. [Xu L B，Zhang X Y，Li H P，Chen B，Huang B Z，Chen W X，Feng Y，Xiao W Q，Zhou D B，Gan D Q. 2017. The breeding of new banana varieties ‘Nan Tian Huang for resistance to fusarium wilt[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，38（6）：998-1004.]

于曉英. 2001. AFLP技術在香牙蕉種質資源鑒別與分類研究中的應用[D]. 長沙：湖南農業(yè)大學. [Yu X Y. 2001. Studies on identification and classification of cavendish germsplasm resources with AFLP molecular markers[D]. Changsha：Hunan Agricultural University.]

張展偉. 2010. 香蕉栽培品種分類[J]. 果農之友，（4）：9. [Zhan Z W. 2010. Classification of banana cultivated varieties[J]. Friends of Fruit Farmers，（4）：9.]

（責任編輯 陳 燕）