劉又維　劉戰(zhàn)民　李聰　吳香　李超　徐寶才

摘 要：在兩步酶解的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶法制備亞鐵血紅素肽的工藝。以酶底比（E/S）、酶解時間、酶解溫度為變量因素，以血紅蛋白溶液水解度為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計并進(jìn)行分析。結(jié)果表明：響應(yīng)面法優(yōu)化得到堿性蛋白酶的最佳酶解條件為E/S 10.16 kU/g、酶解時間5.45 h、酶解溫度51.51 ℃;風(fēng)味蛋白酶的最佳酶解條件為E/S 11.13 kU/g、酶解時間4.37 h、酶解溫度48.34 ℃;通過驗證實驗證明，兩步酶解后的實際水解度為54.31%。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法;酶解;亞鐵血紅素肽;水解度

Optimization of Enzymatic Preparation of Hemopeptides by Response Surface Methodology

LIU Youwei1， LIU Zhanmin1， LI Cong2， WU Xiang2， LI Chao2， XU Baocai2，3，*

（1.School of Life Sciences， Shanghai University， Shanghai 200444， China;

2.State Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control， Jiangsu Yurun Meat Food Co. Ltd.， Nanjing 211806， China;

3.School of Food and Biological Engineering， Hefei University of Technology， Hefei 230000， China）

Abstract： The preparation of himopeptides by sequential hydrolysis with two enzymes was optimized using response surface methodology with Box-Behnken design. Enzyme-to-substrate ratio （E/S）， hydrolysis time and temperature were taken as independent variables. The response variable was the degree of hydrolysis of hemoglobin. The results showed that the optimal hydrolysis conditions for alkaline protease were as follows： E/S 10.16 kU/g， time 5.45 h， temperature 51.51 ℃. The optimal hydrolysis conditions for flavourzyme were as follows： E/S 11.13 kU/g， time 4.37 h， temperature 48.34 ℃. The validation experiments showed that the degree of hydrolysis was 54.31% under these optimized conditions.

Keywords： response surface methodology; enzymatic hydrolysis; hemopeptides; degree of hydrolysis

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200228-058

中圖分類號：TS251.93 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）04-0034-06

引文格式：

劉又維， 劉戰(zhàn)民， 李聰， 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化酶法制備亞鐵血紅素肽工藝[J]. 肉類研究， 2020， 34（4）： 34-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200228-058. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

LIU Youwei， LIU Zhanmin， LI Cong， et al. Optimization of enzymatic preparation of hemopeptides by response surface methodology[J]. Meat Research， 2020， 34（4）： 34-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200228-058. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

畜禽血液蛋白質(zhì)含量豐富[1-3]，并且含有利于人體吸收的亞鐵血紅素[4-6]。2018年我國生豬出欄量6.94 億頭，豬肉產(chǎn)量5 404 萬t，位居世界第一，具有大量的豬血資源[7]。利用豬血資源制備血紅素，可減少大量未降解豬血的排放，降低環(huán)境污染，還可以為缺鐵性貧血人群的補鐵提供有效途徑[8-9]。亞鐵血紅素肽是將畜禽血液中的血紅蛋白經(jīng)物理和化學(xué)方法處理，除去其中大部分氨基酸后得到的由長度不等的短肽段與亞鐵血紅素連接而成的混合物[10]。目前，亞鐵血紅素肽的提取方法主要有冰醋酸法[11]、酸性丙酮法[12-13]、表面活性劑法[14-16]、羧甲基纖維素鈉（carboxy methyl cellulose-Na，CMC-Na）法[17]和酶水解法[18-20]等。其中冰醋酸法、酸性丙酮法和表面活性劑法需使用有毒試劑，不可用于食用;CMC-Na法提取的產(chǎn)物純度和回收率均較低;而酶水解法可人工控制，副反應(yīng)相對較少[21-23]，且在不使用有毒試劑的情況下使亞鐵血紅素與一定量的肽段結(jié)合，提高人體吸收率[24]。

本研究以豬血為原料，利用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶兩步水解血紅蛋白，以制備亞鐵血紅素肽。在單因素試驗基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法確定最佳酶解工藝，為亞鐵血紅素肽的制備工藝及規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬血 江蘇雨潤肉食品有限公司。

堿性蛋白酶 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;風(fēng)味蛋白酶 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司;三氯乙酸、福林試劑、干酪素、L-酪氨酸、吡啶、甲醛、硼酸、濃硫酸、鹽酸、乙酸鈉（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5427R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;FA1204B電子分析天平、PHS-3C pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-M6恒溫水浴鍋 金壇市城西春蘭實驗儀器廠;JY92-2D超聲清洗機 寧波新芝生物科技有限公司;UV-1700紫外-可見分光光度計 日本島津儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血紅蛋白溶液的制備

取新鮮豬血，立即加入豬血體積1/10的3.8 g/100 mL檸檬酸三鈉抗凝，攪拌均勻后3 500 r/min離心15 min，收集下層紅血球，用生理鹽水洗滌后得到干凈紅血球;將紅血球與蒸餾水以體積比1∶3混合，使用超聲波破碎細(xì)胞，超聲條件為：溫度10 ℃、功率350 W、時間10 min;破碎后的紅細(xì)胞置于4 ℃冰箱中溶血20 h以上，得到血紅蛋白溶液。

1.3.2 高效蛋白酶的篩選

將1.3.1節(jié)得到的血紅蛋白溶液作為底物，采用兩步酶解法，第1步分別采用中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶3 種肽鏈內(nèi)切酶酶解，以血紅蛋白溶液水解度和亞鐵離子得率為指標(biāo)，選取最適內(nèi)切酶;第2步分別采用風(fēng)味蛋白酶和氨肽酶2 種肽鏈外切酶繼續(xù)酶解，以血紅蛋白溶液水解度和亞鐵離子得率為指標(biāo)，選取最適外切酶。各酶水解條件均為最適條件，如表1所示。

1.3.3 血紅蛋白溶液水解度測定

血紅蛋白溶液中總氮含量的測定采用凱氏定氮法[25]，酶解液中氨基態(tài)氮含量的測定采用甲醛滴定法[26]。血紅蛋白溶液水解度按下式計算。

1.3.4 亞鐵離子含量測定

參照HJ/T 345—2007《水質(zhì) 鐵的測定 鄰菲啰啉分光光度法》[27]中的鄰菲啰啉分光光度法，稍作改進(jìn)。

1.3.5 亞鐵血紅素含量測定

亞鐵血紅素肽的主體部分為亞鐵血紅素，因此測定亞鐵血紅素肽含量只需測定亞鐵血紅素含量即可。參考Guo Shanguang等[28]的分光光度法，并稍作修改。

1.3.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇酶底比（E/S）、酶解時間和酶解溫度為因素，血紅蛋白溶液水解度為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken中心組合試驗進(jìn)行3因素3水平試驗設(shè)計，優(yōu)化分析得到二次多項式回歸方程預(yù)測模型，考察其可信程度，研究堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的最優(yōu)酶解工藝，2 種酶的酶解工藝響應(yīng)面試驗因素水平如表2所示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計和響應(yīng)面三維圖和等高線圖繪制，采用Origin 8.6軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶酶解效果分析

由圖1可知，3 種內(nèi)切酶中，采用胰蛋白酶時的血紅蛋白溶液水解度最高，為24.65%，采用堿性蛋白酶時的血紅蛋白溶液水解度略低，為23.39%，二者無顯著差異，且均高于采用中性蛋白酶時的血紅蛋白溶液水解度。堿性蛋白酶酶解液的亞鐵離子得率為37.97%，顯著高于另外2 種內(nèi)切酶酶解液（P<0.05）。雖然采用胰蛋白酶時血紅蛋白溶液水解度最高，但其酶解液的亞鐵離子得率較低，因此選擇堿性蛋白酶作為內(nèi)切酶。

由圖2可知，無論是血紅蛋白溶液水解度還是亞鐵離子得率，風(fēng)味蛋白酶均優(yōu)于氨肽酶，因此選擇風(fēng)味蛋白酶作為外切酶。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶酶解工藝的試驗結(jié)果與分析

2.2.1 堿性蛋白酶酶解工藝的響應(yīng)面分析

堿性蛋白酶酶解工藝的響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果如表3所示。由表4可知，模型極顯著（P<0.000 1），說明該模型能夠解釋大部分實驗情況的變化，同時失擬項不顯著，進(jìn)一步說明該模型的合理性，因此，可以用此模型對實驗結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測?；貧w方程模型為：Y=-102.958 69+15.653 13A+1.878 13B+1.622 12C+0.080 63AB-0.015 38AC+0.036 63BC-0.752 94A2-0.420 44B2-0.016 17C2，回歸方程中的一次項B、二次項BC達(dá)到顯著水平（P<0.05），二次項A2、B2、C2均達(dá)到極顯著水平（P<0.01），表明各因素對血紅蛋白溶液水解度的影響不是簡單的線性關(guān)系。方差分析中因素A、B、C的F值分別為5.82、10.77、3.36，即各因素對血紅蛋白溶液水解度的影響程度大小順序為酶解時間>E/S>酶解溫度。模型擬合系數(shù)R2=0.974 2，模型校正擬合系數(shù)R2Adj=0.941 1，表明該模型能夠解釋血紅蛋白溶液水解度94.11%的變化來自于所選變量。同時變異系數(shù)為2.63%，說明模型置信度高，能夠準(zhǔn)確預(yù)測和分析3 個變量對血紅蛋白溶液水解度的影響。

2.2.2 堿性蛋白酶水解影響因素的交互作用分析

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面圖，圖形形狀與三維圖傾斜度均能反映因素間的交互作用程度。等高線為圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著;三維圖傾斜度越大，坡度越陡，說明兩因素交互作用越顯著。

僅對交互作用顯著的2 個因素（酶解溫度和酶解時間）進(jìn)行交互作用分析。由圖3可知，當(dāng)酶解時間為5 h、酶解溫度在40～50 ℃內(nèi)增加時，血紅蛋白溶液水解度逐漸上升，酶解溫度在50～60 ℃內(nèi)增加時血紅蛋白溶液水解度小幅度下降，主要原因可能是溫度50 ℃左右時堿性蛋白酶活性最高，而隨著溫度繼續(xù)升高，部分酶分子會因吸收過多熱量導(dǎo)致次級鍵解體，從而導(dǎo)致酶逐漸失活[29];酶解溫度為50 ℃、酶解時間在3～5 h內(nèi)增加時血紅蛋白溶液水解度迅速上升，酶解時間在5～7 h內(nèi)增加時血紅蛋白溶液水解度緩慢下降，原因可能是隨著反應(yīng)時間的延長，底物濃度減小的同時伴隨產(chǎn)物的積累，部分酶失活，從而導(dǎo)致反應(yīng)速率下降[30-31]。

2.2.3 堿性蛋白酶的最佳酶解工藝及驗證實驗

采用Design-Expert 8.0.6軟件對堿性蛋白酶酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳水解工藝為E/S 10.16 kU/g、酶解時間5.45 h、酶解溫度51.52 ℃，在此工藝條件下，血紅蛋白溶液水解度預(yù)測值為23.46%。在上述最佳水解工藝條件下進(jìn)行3 次平行實驗后取平均值，得到實際血紅蛋白溶液水解度為23.35%，與預(yù)測值相差0.11%，誤差率為0.47%，證明響應(yīng)面分析法對于堿性蛋白酶酶解工藝的優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶酶解工藝的試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3.1 風(fēng)味蛋白酶酶解工藝的響應(yīng)面分析

風(fēng)味蛋白酶酶解工藝的響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果如表5所示。

由表6可知，模型極顯著（P<0.000 1），說明該模型能夠解釋大部分實驗情況的變化，同時失擬項不顯著，進(jìn)一步說明該模型的合理性，因此，可以用此模型對實驗結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測?；貧w方程模型為：

Y=52.40+2.31A+2.17B-0.31C-0.88AB-1.49AC-0.10BC-2.12A2-4.60B2-3.50C2，回歸方程中的一次項A和B達(dá)到極顯著水平（P<0.01），交互項AC達(dá)到顯著水平（P<0.05），二次項A2、B2、C2均達(dá)到極顯著水平

（P<0.01），表明各因素對血紅蛋白溶液水解度的影響不是簡單的線性關(guān)系。方差分析中因素A、B、C的F值分別為29.91、26.31、0.53，即各因素對血紅蛋白溶液水解度的影響程度大小順序為E/S>酶解時間>酶解溫度。模型擬合系數(shù)R2=0.964 2，模型校正擬合系數(shù)R2adj=0.918 1，表明該模型能夠解釋血紅蛋白溶液水解度91.81%的變化來自于所選變量。同時變異系數(shù)為2.51%，說明模型置信度高，能夠準(zhǔn)確預(yù)測和分析3 個變量對血紅蛋白溶液水解度的影響。

2.3.2 風(fēng)味蛋白酶水解影響因素的交互作用分析

圖 4 E/S和酶解溫度對風(fēng)味蛋白酶水解所得血紅蛋白溶液

水解度交互作用的三維圖和等高線圖

Fig. 4 Three-dimensional response surface and contour maps showing the effect of E/S and hydrolysis temperature on ?flavourzyme hydrolysis degree

僅對交互作用顯著的2 個因素（E/S和酶解溫度）進(jìn)行交互作用分析。由圖4可知，從三維圖中可以直觀地看出，E/S和酶解溫度的交互作用較顯著。當(dāng)E/S為10 kU/g、

酶解溫度在40～50 ℃內(nèi)增加時，血紅蛋白溶液水解度迅速上升，酶解溫度在50～60 ℃內(nèi)增加時，血紅蛋白溶液水解度緩慢下降;酶解溫度為50 ℃、E/S在8～10 kU/g內(nèi)增加時血紅蛋白溶液水解度迅速上升，E/S在10～12 kU/g

內(nèi)增加時，血紅蛋白溶液水解度變化不大，分析其原因可能是酶添加量增加會加快反應(yīng)速率，但酶添加量過多會使底物和酶之間形成一種飽和狀態(tài)，飽和的酶之間會形成競爭關(guān)系，從而抑制其催化作用[32]。

2.3.3 風(fēng)味蛋白酶的最佳酶解工藝及驗證實驗

風(fēng)味蛋白酶最佳水解工藝條件為E/S 11.13 kU/g、酶解時間4.37 h、酶解溫度48.34 ℃，在此工藝條件下，血紅蛋白溶液水解度預(yù)測值為53.28%。在上述最佳水解工藝條件下進(jìn)行3 次平行實驗后取平均值，得到實際血紅蛋白溶液水解度為54.31%，與預(yù)測值相差1.03%，誤差率為1.9%，對比優(yōu)化前的水解度33.26%有明顯提升，且測得兩步酶解后酶解液中亞鐵血紅素含量為1.12 g/100 g，說明響應(yīng)面分析法對于血紅蛋白水解工藝的優(yōu)化結(jié)果可靠，可較好地預(yù)測實驗結(jié)果，應(yīng)用于實際生產(chǎn)中。

3 結(jié) 論

以血紅蛋白溶液水解度和亞鐵離子得率為指標(biāo)，篩選得到堿性蛋白酶作為最適內(nèi)切酶，風(fēng)味蛋白酶作為最適外切酶，對血紅蛋白溶液進(jìn)行兩步酶解。第1步采用堿性蛋白酶酶解血紅蛋白，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以血紅蛋白溶液水解度為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法建立E/S、酶解時間、酶解溫度3 個因素對血紅蛋白溶液水解度的二次回歸方程模型，并優(yōu)化出最優(yōu)酶解工藝為E/S 10.16 kU/g、酶解時間5.45 h、酶解溫度51.52 ℃。為了增加血紅蛋白的酶解程度，減少不溶性肽，采用風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)酶解，以第1步酶解產(chǎn)物作為第2步酶解的底物，根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果確定風(fēng)味蛋白酶的最優(yōu)酶解工藝為E/S 11.13 kU/g、酶解時間4.37 h、酶解溫度48.34 ℃，此條件下血紅蛋白溶液水解度達(dá)到54.31%，比傳統(tǒng)工藝酶解制備亞鐵血紅素肽的水解度提升約20%，說明在兩步酶解的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法能有效優(yōu)化酶法制備亞鐵血紅素肽的工藝，為亞鐵血紅素肽的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。

在單因素和響應(yīng)面法的基礎(chǔ)上優(yōu)化出兩步酶解法，制備亞鐵血紅素肽。第1步酶解最優(yōu)工藝參數(shù)為采用堿性蛋白酶，E/S 10.16 kU/g、酶解時間5.45 h、酶解溫度51.52 ℃;第2步酶解最優(yōu)工藝參數(shù)為采用風(fēng)味蛋白酶，E/S 11.13 kU/g、酶解時間4.37 h、酶解溫度48.34 ℃。在兩步酶解條件下，血紅蛋白水解度可達(dá)54.31%，對比優(yōu)化前水解度（33.26%）有顯著提升，結(jié)果誤差較小，與預(yù)測值相近，說明該方法可用于實際生產(chǎn)，同時可為亞鐵血紅素肽的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

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