李楠　吳婧　單林鮮　念吉磊　李艷敏　姜燕

摘 要：目的：研究殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑對冷鮮黃牛肉的保鮮效果。方法：通過抗氧化及抑菌實驗確定復合保鮮劑的最佳配比，并通過貯藏實驗分析該復合保鮮劑對冷鮮（（4±2）℃）黃牛肉的保鮮效果。結(jié)果：殼聚糖與三七葉黃酮粗提液體積比為1∶1的復合保鮮劑的抗氧化性和抑菌性均較好。貯藏第10天時，使用該復合保鮮劑涂膜肉樣的pH值、總揮發(fā)性鹽基氮含量和菌落總數(shù)仍在可食用范圍內(nèi)，同時感官評分也在可接受范圍內(nèi)。結(jié)論：殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑對冷鮮黃牛肉具有較好的保鮮效果，有效延長其保鮮時間。

關(guān)鍵詞：殼聚糖;三七葉;黃酮;黃牛肉;保鮮

A Chitosan-based Coating with Flavonoids Extracted from Panax notoginseng Leaves Extends the Shelf Life of Refrigerated Beef

LI Nan， WU Jing， SHAN Linxian， NIAN Jilei， LI Yanmin， JIANG Yan*

（Institute of Preventive Medicine， School of Public Health， Dali University， Dali 671000， China）

Abstract： Objective： Chitosan-based coatings with flavonoids extracted from Panax notoginseng leaves were investigated for their effects on quality and shelf life of beef stored at a refrigerated temperature of （4 ± 2） ℃. Methods： The optimal formulation was determined by antioxidant and bacteriostatic tests， and its preservative effect was analyzed by storage experiments. Results： A 1：1 （V/V） mixture of chitosan and flavonoids had excellent antioxidant and antibacterial activities. The pH value， total volatile basic content （TVB-N） content and total plate count of samples coated with the composite preservative remained in the ranges for consumption， and the sensory evaluation was also still in the acceptable range over 10 days of storage. Conclusion： The composite preservative can preserve the quality and prolong the shelf life of beef under refrigerated storage.

Keywords： chitosan; Panax notoginseng leaves; flavonoids; beef; preservation

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200220-050

中圖分類號：TS251.5 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）04-0071-06

引文格式：

李楠， 吳婧， 單林鮮， 等. 殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑對冷鮮黃牛肉的保鮮效果[J]. 肉類研究， 2020， 34（4）： 71-76. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200220-050. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

LI Nan， WU Jing， SHAN Linxian， et al. A chitosan-based coating with flavonoids extracted from Panax notoginseng leaves extends the shelf life of refrigerated beef[J]. Meat Research， 2020， 34（4）： 71-76. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200220-050. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

黃牛肉肉質(zhì)優(yōu)良，并且鉀、磷和蛋白質(zhì)含量均較高[1-2]，

較高的營養(yǎng)價值使得牛肉逐漸成為肉類市場的消費主流。但是，牛肉從屠宰到銷售的過程中容易受到微生物污染，從而發(fā)生蛋白質(zhì)分解和脂肪氧化等現(xiàn)象，最終導致貨架期縮短[3]。4 ℃冷藏條件下牛肉的貨架期為3～5 d，隨著貯藏時間的延長，牛肉的風味及食用安全性逐漸降低[4-5]。

天然涂膜保鮮劑具有較高的安全性和較強的抑菌及抗氧化能力[6-7]，如殼聚糖[8-9]、殼寡糖[10-11]、茶多酚[12-13]、天然香辛料提取物[14]和中藥材提取物[15-17]等。三七（Panax notoginseng）葉含皂苷、黃酮和多糖等成分，具有抗氧化、抗炎和抑菌等藥理活性，具有作為食品涂膜保鮮劑的應(yīng)用潛力[18-21]。相關(guān)研究表明，復合保鮮劑比單一成分保鮮劑的保鮮效果更好[22-23]。

本研究旨在利用云南省豐富的三七資源，將殼聚糖溶液與三七葉黃酮粗提液復配制備殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑，研究其抑菌性及抗氧化活性，并在冷鮮牛肉貯藏實驗中分析其對冷鮮牛肉微生物生長、蛋白質(zhì)分解和脂肪氧化程度、失水率和色澤的影響，探尋殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑在保鮮方面的應(yīng)用潛力，以期為天然保鮮劑的合理開發(fā)和利用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃牛肉購于大理市農(nóng)貿(mào)市場;三七葉 云南白藥集團股份有限公司;殼聚糖（食品級，脫乙酰度90%、1%冰乙酸溶解） 南通興成生物制品廠;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 山東拓普生物工程有限公司;槲皮素標準品（純度98.5%） 上海甄準生物科技公司;大腸埃希氏菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由大理大學公共衛(wèi)生學院微生物實驗室提供。

無水乙醇、冰乙酸、抗壞血酸、氫氧化鈉、三氯化鋁、鹽酸標準液等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-28電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;SC-3610低速離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司;

SK8210HP超聲波清洗器 上?？茖С晝x器有限

公司;T6紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;CM-700D色彩色差儀 日本柯尼卡美能達公司;ST5000實驗室pH計 奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 三七葉黃酮的提取

將三七葉置于50 ℃的電熱鼓風干燥箱內(nèi)干燥3 h，粉碎后過30 目篩，取過篩后粉末0.3 g加入60 mL體積分數(shù)50%乙醇，于頻率59 kHz、溫度50 ℃條件下超聲輔助提取60 min，將提取液于3 500 r/min離心10 min，所得上清液即為三七葉黃酮粗提液。以槲皮素為對照，采用紫外分光光度計法（274 nm）[24]測得三七葉黃酮提取率為1.81%。

1.3.2 殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑的制備

將2 g/100 mL殼聚糖溶液和70 ?g/mL三七葉黃酮粗提液（以下所述殼聚糖溶液和三七葉黃酮粗提液均為此2 種質(zhì)量濃度）分別按體積比1∶1（復合保鮮劑A）、2∶1（復合保鮮劑B）、1∶2（復合保鮮劑C）的比例混合均勻得到殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑，備用。

1.3.3 三七葉黃酮粗提液及殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除作用用體積分數(shù)50%乙醇分別配制不同質(zhì)量濃度（7、14、21、28、35、42、70 μg/mL）的VC和三七葉黃酮粗提液和不同稀釋倍數(shù)（10.0、5.0、3.3、2.5、2.0）的3 種殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑樣液，分別吸取2 份2.5 mL不同質(zhì)量濃度和稀釋倍數(shù)的樣品溶液于10 mL比色管中，1 份加入2.5 mL 20 μmol/L DPPH-乙醇溶液，另1 份加2.5 mL無水乙醇作空白對照，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度[25]。三七葉黃酮粗提液及殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑的DPPH自由基清除率按下式計算。

式中：A0為空白溶液（2.5 mL DPPH-乙醇溶液和

2.5 mL蒸餾水）吸光度;A1為對照溶液（2.5 mL DPPH-乙醇溶液和2.5 mL樣品）吸光度;A2為樣品溶液（2.5 mL無水乙醇和2.5 mL樣品）吸光度。

1.3.4 體外抑菌實驗

采用濾紙片法[26]，將直徑9 mm的濾紙片經(jīng)高壓滅菌后分別放入殼聚糖溶液和3 種復合保鮮劑中完全浸透，分別取1 mL活菌數(shù)106 CFU/mL的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌菌懸液加入培養(yǎng)基中，倒入溫度適中的營養(yǎng)瓊脂混勻。等完全凝固后將濾紙片放入培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每個培養(yǎng)基放入3 個濾紙片作對照組（此過程均為無菌操作），測定抑菌圈直徑，重復3 次取平均值。

1.3.5 貯藏實驗

1.3.5.1 肉樣處理

用無菌刀將新鮮黃牛肉切割成約6 cm×5 cm×1 cm、質(zhì)量約60 g的塊狀，分別放入2 g/100 mL殼聚糖溶液和3 種殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑溶液中浸泡3 min，取出瀝干，裝袋，標號，于（4±2）℃冰箱中貯藏。以未經(jīng)涂膜的肉樣為對照，處理組和對照組均為每2 d測1 次評價指標，直至各組感官評價得分均低于5 分時終止實驗。

1.3.5.2 感官評價

由5 位專業(yè)感官評價人員組成評價小組，觀察肉樣表面和切面的狀態(tài)，依據(jù)9 點評分法進行評分。9 分表示極好，5 分表示一般，1 分表示極差。評定標準見表1，總分在6 分以下即為不能食用[27]。

1.3.5.3 微生物及理化指標的測定

菌落總數(shù)：參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》進行;失水率：參照文獻[28]中的方法進行;pH值：參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》進行;TVB-N含量：參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》進行。

1.3.5.4 牛肉色澤的測定

用高壓滅菌濾紙吸干肉樣表面水分，在自然光源下使用色差儀測定肉樣的亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。每個樣品于不同部位分別測定3 次，結(jié)果取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 25.0對數(shù)據(jù)進行方差分析和差異顯著性分析，顯著性水平為P<0.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七葉黃酮粗提液及殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑的DPPH自由基清除作用

由圖1可知，三七葉黃酮粗提液對DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增大而增強。當質(zhì)量濃度為

70 ?g/mL時，VC水溶液的DPPH自由基清除率為97.67%，三七葉黃酮粗提液的DPPH自由基清除率為92.13%，略低于VC水溶液。

稀釋倍數(shù)指2 g/100 mL殼聚糖溶液和70 ?g/mL三七葉黃酮粗提液倍數(shù)稀釋。

由圖2可知，體積比為1∶1和1∶2的殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑A、C的DPPH自由基清除率隨稀釋倍數(shù)的增大而增強，各稀釋倍數(shù)下體積比為1∶2的殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑C的DPPH自由基清除率均為最大。當稀釋倍數(shù)為2.0時，3 種殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑的DPPH自由基清除率分別為66.05%、58.83%和86.44%，表明體積比為1∶2的殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑C的抗氧化效果最好，其余2 種殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑次之。

2.2 體外抑菌實驗

由表2可知，復合保鮮劑B對2 種致病菌的抑菌圈直徑最大，2 g/100 mL殼聚糖溶液和復合保鮮劑A的抑菌效果略低于復合保鮮劑C，對2 種致病菌也具有一定的抑制作用。這是因為殼聚糖會與細菌細胞磷脂膜發(fā)生反應(yīng)，迅速破壞細胞膜，進而使細胞膜通透性改變，胞內(nèi)物質(zhì)外滲，導致微生物生長受阻或死亡[29]。

抑菌實驗與抗氧化實驗結(jié)果結(jié)合分析可知，體積比為1∶1的殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑兼具較好的抗氧化和抑菌活性，因此選擇體積比為1∶1的殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑用于后續(xù)貯藏實驗研究。

2.3 貯藏期間冷鮮黃牛肉感官品質(zhì)的變化

由圖3可知：各組冷鮮黃牛肉的感官評分均隨著貯藏時間的延長逐漸下降，2 種涂膜處理組肉樣感官評分均高于對照組;貯藏6 d時，對照組肉樣感官評分低于6.0 分，表明肉樣已變質(zhì)，而2 組涂膜處理肉樣的感官評分均在6.0 分以上;貯藏10 d時，殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑組的感官評分為6.5 分，仍在可食用范圍內(nèi)，說明殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑有效維持了牛肉的感官接受度;當貯藏時間超過10 d后，對照組和殼聚糖溶液處理組的肉樣均已變質(zhì)，在感官上已難以接受。因此，貯藏10 d后，僅對殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑處理組肉樣進行后續(xù)指標檢測。

2.4 貯藏期間冷鮮黃牛肉失水率的變化

高品質(zhì)肉制品的保水性較好，肉質(zhì)嫩且多汁。由圖4可知：各組肉樣的失水率均隨貯藏時間的延長而增大，隨著貯藏時間的延長，牛肉中的蛋白質(zhì)變性，肌肉組織結(jié)構(gòu)疏松，保水性逐漸下降[30];由于殼聚糖溶液的成膜性使其具有一定的保水功能，因此在整個貯藏期間，2 組涂膜肉樣的失水率始終低于對照組。殼聚糖溶液處理組的失水率在貯藏4 d時明顯低于對照組，這表明貯藏初期殼聚糖溶液處理組有效延緩了牛肉中的水分流失。2 個處理組在貯藏8 d時的失水率相近，這表明在貯藏后期不同處理方式對水分流失的抑制效果沒有明顯差異。

2.5 貯藏期間冷鮮黃牛肉菌落總數(shù)的變化

由圖5可知：各組肉樣的菌落總數(shù)均隨貯藏時間的延長逐漸增加，其中2 組涂膜肉樣菌落總數(shù)明顯低于對照組，這是由于殼聚糖的抑菌作用;貯藏6～8 d時，各組菌落總數(shù)增長均較為緩慢，且殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑處理組的菌落總數(shù)明顯低于對照組;貯藏10 d時，殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑處理組的菌落總數(shù)低于國家規(guī)定的衛(wèi)生標準（菌落總數(shù)應(yīng)≤106 CFU/g）[31]，其感官評分也在可接受范圍內(nèi)，即殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑有效抑制了細菌的繁殖，延長了其貨架期。

2.6 貯藏期間冷鮮黃牛肉pH值的變化

肉的pH值有助于判定其新鮮度，肉腐敗變質(zhì)后的pH值大于6.7[32]。由圖6可知：各組肉樣的pH值貯藏期間呈波動變化，但在貯藏后期均呈上升趨勢，這是由于蛋白質(zhì)在酶和細菌作用下被分解產(chǎn)生了堿性物質(zhì)導致pH值升高;對照組肉樣pH值在貯藏6～8 d的上升幅度明顯，而處理組pH值變化較為平穩(wěn)，這說明涂膜保鮮劑可以有效抑制細菌分解蛋白質(zhì)，從而延緩pH值的升高。殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑處理組肉樣的pH值在貯藏12 d時雖處于可食用范圍內(nèi)，但感官可接受度已較低。

2.7 貯藏期間冷鮮黃牛肉TVB-N含量的變化

TVB-N是動物性食品中細菌與酶相互作用導致蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的一種揮發(fā)性物質(zhì)，它可以有效反映動物性食品的腐敗程度，其含量越低表示肉品越新鮮。

GB 2707—2016《食品安全國家標準 鮮（凍）畜、禽產(chǎn)品》中規(guī)定鮮（凍）畜產(chǎn)品的TVB-N含量應(yīng)≤15 mg/100 g。

由圖7可知：隨著貯藏時間的延長，對照組肉樣的TVB-N含量呈上升趨勢，處理組肉樣的TVB-N含量在貯藏初期較為平穩(wěn)，而后逐漸上升。處理組肉樣的TVB-N含量在貯藏期間始終低于對照組;貯藏8 d，處理組肉樣的TVB-N含量均低于15 mg/100 g，明顯低于對照組，說明涂膜處理能夠顯著抑制TVB-N含量的增加。單一成分的殼聚糖涂膜和殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑涂膜處理后，貯藏10 d時2 組肉樣的TVB-N含量仍符合國家標準，但殼聚糖涂膜處理肉樣的感官評分表明其已變質(zhì)，因此，殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑的效果更佳。

2.8 貯藏期間冷鮮黃牛肉色澤的變化

L*、a*和b*的變化主要與氧氣的接觸程度和時間有關(guān)，直接影響消費者對肉類的感官反應(yīng)和接受程度。由圖8A可知，在貯藏初期，殼聚糖溶液處理組肉樣的L*明顯高于殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑處理組和對照組，這可能是由于殼聚糖膜阻止了氧氣與牛肉接觸，從而抑制了氧化肌紅蛋白的形成和維持了肉的亮度。殼聚糖溶液處理組和殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑處理組肉樣在貯藏8 d時的L*仍高于對照組，表明殼聚糖溶液和殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑均能有效改善肉樣亮度。由圖8B可知，貯藏期間處理組肉樣的a*呈先下降后升高趨勢，處理組肉樣在貯藏8 d時的a*均高于對照組。直到貯藏12 d時，殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑處理組肉樣的a*與初始值仍相差不大，這說明殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑能有效抑制脂肪氧化和高鐵肌紅蛋白的形成，對維持牛肉紅色度具有明顯效果。由圖8C可知，3 組肉樣的b*波動均較小，殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑處理組肉樣在貯藏12 d時的b*為13.89，略低于初始值15.23。

3 結(jié) 論

在貯藏初期，單一成分的殼聚糖溶液在護色和抑制肉樣水分流失方面效果明顯。使用殼聚糖溶液（2 g/100 mL）與三七葉黃酮粗提液（70 ?g/mL）按1∶1體積比混合制成的殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑具有良好的抗氧化性和抑菌性，貯藏第10天時殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑處理組肉樣的感官評分、pH值、TVB-N含量和菌落總數(shù)均在可食用范圍內(nèi)。殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑有效減緩了冷鮮黃牛肉的變質(zhì)速率，維持了肉樣新鮮度，延長冷鮮黃牛肉的保鮮期至10 d。本研究從三七葉中提取黃酮作為天然保鮮劑的抗氧化成分，結(jié)合殼聚糖優(yōu)異的抑菌作用制備殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑并將其用于冷鮮黃牛肉保鮮。當今人們對綠色食品倍加推崇，開發(fā)天然、安全、經(jīng)濟的保鮮方法被日益重視，殼聚糖-三七葉黃酮復合保鮮劑有望應(yīng)用于其他肉類（如牦牛肉）或肉類產(chǎn)品（如牛排等）的冷藏保鮮中。

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收稿日期：2020-02-20

基金項目：大理大學大學生科研基金項目（KYSX2019014）

第一作者簡介：李楠（1996—）（ORCID： 0000-0001-8073-6752），女，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物提取及慢性病的精準營養(yǎng)。E-mail： 421612708@qq.com

通信作者簡介：姜燕（1981—）（ORCID： 0000-0002-3574-3539），女，副教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物活性成分提取及功效分析。E-mail： jiang_ya@126.com