慶杉，趙巖，馮萃敏，段鵬鑫，王婷，張欣蕊，丁梓沁

(1.北京建筑大學(xué) 北京未來城市設(shè)計高精尖創(chuàng)新中心，北京 100044；2.北京建筑大學(xué) 水環(huán)境國家級實驗教學(xué)示范中心，北京 100044；3.北京外交人員服務(wù)局，北京 100010；4.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050061；5.北京市市政工程設(shè)計研究總院有限公司，北京 100082)

為解決飲用水消毒過程中產(chǎn)生的多種對人體有毒有害的消毒副產(chǎn)物問題[1-3]，采用表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epicatechin gallate，EGCG，茶多酚中起抑菌作用的主要成分[4-12])替代傳統(tǒng)消毒劑，但其穩(wěn)定性較差。在初始濃度大、pH高、光照條件下易發(fā)生氧化聚合反應(yīng)[13]，降低抑菌能力[14]。

為增強EGCG的化學(xué)穩(wěn)定性及殺菌能力，選用Cu2+為中心離子[15]，EGCG為配體，采用水熱法進行絡(luò)合[16]。選用飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)微生物指標(biāo)中最具有代表性的細菌——大腸桿菌，探索絡(luò)合物EGCG-Cu的抑菌性，以及初始投加量和反應(yīng)時間對消毒效果的影響，為茶多酚及EGCG在飲用水消毒領(lǐng)域的應(yīng)用拓展出一條新的道路。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(編號10004)，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG為南京廣潤生物制品有限公司產(chǎn)品(編號GR0799)；氯化鈉、硫酸銅、碳酸氫鈉、乙醇均為分析純；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，均為人工配制。

BCN-1360型生物操作臺；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱；滅菌鍋(日本，三洋，75 L)；78HW-1恒溫磁力攪拌器；臺式恒溫搖床(杭州得聚儀器設(shè)備有限公司)；酶標(biāo)儀(ThermoFisher，Multiskan FC)。

1.2 溶液配制

1.2.1 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 3.6 g肉湯培養(yǎng)基(試劑)溶于200 mL蒸餾水，用電爐加熱至沸騰，再入高壓滅菌鍋滅菌備用。

1.2.2 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 6.6 g營養(yǎng)瓊脂，200 mL蒸餾水，步驟同營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2.3 無菌生理鹽水 1.7 g氯化鈉，用去離子水定容于200 mL，121 ℃滅菌30 min。選用蒸餾水作為配制菌液、溶解藥劑等實驗用水。

1.3 實驗方法

1.3.1 EGCG-Cu絡(luò)合物的制備 采用水熱法合成所需絡(luò)合物。稱取EGCG 0.5 mmol，用30 mL的蒸餾水溶解，并將1 mmol的硫酸銅配制成溶液后逐滴加入，待混勻后用1 mol/L的碳酸氫鈉將pH調(diào)節(jié)至7，在40 ℃溫度下用恒溫磁力攪拌器攪拌1 h使其充分絡(luò)合，后用1∶1的乙醇-水溶液多次洗滌沉淀，真空冷凍干燥后得EGCG-Cu。絡(luò)合反應(yīng)見圖1。

圖1 EGCG與Cu2+的絡(luò)合反應(yīng)Fig.1 Complexation reaction between EGCG and Cu2+

1.3.2 菌懸液的制備 用接種環(huán)從含有大腸桿菌的瓊脂斜面刮取一環(huán)，溶于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：溫度(37±2) ℃，220 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)，時間為(8±1) h。此時的菌數(shù)約為103～109 CFU/mL。若需稀釋，用滅菌的移液槍吸取1 mL原始菌液加入到無菌生理鹽水中作梯度稀釋，并用平板計數(shù)法記錄細菌數(shù)，直至實驗所需細菌濃度。

1.3.3 最小抑菌濃度(MIC)測定 采用平皿計數(shù)法，通過對比EGCG的菌落的生長狀況來判斷EGCG-Cu是否具有抑菌效果。用生理鹽水將大腸桿菌菌懸液稀釋至104數(shù)量級，取EGCG-Cu絡(luò)合物溶液的濃度為0,12.5,25,50,100,200,400 mg/L，EGCG溶液的濃度為0,125,250,500,1 000,2 000,4 000 mg/L，對大腸桿菌進行接觸時間為24 h，培養(yǎng)溫度為37 ℃的抑菌實驗，觀察菌落的生長情況。

1.3.4 抑菌性能影響因素分析 探究EGCG-Cu投加量和反應(yīng)時間對其抑菌效果的影響。設(shè)置EGCG-Cu的投加量為0,25,50,75,100,150,200,250,400,600,800,1 000 mg/L，將大腸桿菌菌懸液稀釋至103數(shù)量級，加入EGCG-Cu絡(luò)合物的溶液，反應(yīng)時間2 h，溫度為37 ℃。選取EGCG-Cu的投加量為25,50,75,100 mg/L，觀察其在反應(yīng)時間為15,30 min,1,6,12,24 h時的抑菌效果。為得到比較直觀的實驗結(jié)果，選用EGCG做對比實驗，EGCG的投加量選為200,400,600,800 mg/L。

1.3.5 EGCG-Cu誘導(dǎo)大腸桿菌胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧簇(ROS) 采用活性氧酶聯(lián)免疫分析試劑盒進行檢測，將大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)期，按說明書用緩沖液稀釋后，取0.1 mL加入反應(yīng)孔中，4 ℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液清洗3次。將稀釋過的待檢樣品0.05 mL加入已包被單抗微孔中，置37 ℃孵育1 h，然后洗滌(同時做空白對照孔)。在各孔中加入現(xiàn)配的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃孵育20 min后，加入2 mol/L硫酸0.05 mL終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀450 nm波長下測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測試樣品中的活性氧簇含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 EGCG-Cu和EGCG 的最小抑菌濃度(MIC)

最小抑菌濃度MIC是將制備的一系列藥劑稀釋液加入到有試驗菌的固體或液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在一段時間的培養(yǎng)后，觀察實驗菌是否有生長，可完全抑制實驗菌生長的最低藥物濃度即為最小抑菌濃度，用于定量測定藥劑的抗菌活性[17]。按上述實驗方法配制一系列濃度的EGCG和EGCG-Cu溶液進行MIC實驗。

實驗表明，EGCG-Cu在濃度為200 mg/L時無菌落長出，EGCG在濃度為1 000 mg/L時無菌落長出，EGCG-Cu的最小抑菌濃度遠小于EGCG。由此可知，EGCG-Cu絡(luò)合物不僅具有抑菌能力，而且明顯優(yōu)于EGCG。EGCG-Cu優(yōu)異的抑菌能力可能是因為革蘭氏陰性菌大腸桿菌的細胞表面有帶負電的脂多糖，而在生理pH下，EGCG不帶電，EGCG-Cu絡(luò)合物卻帶正電荷。大腸桿菌表面的負電荷可能會吸引EGCG-Cu，導(dǎo)致EGCG更易于破壞大腸桿菌的生物膜[18]，從而提高了抑菌效率。這與Sun等的研究一致[16]。也可能由于EGCG-Cu絡(luò)合物游離出的Cu2+氧化成Cu+，促進了氧化聚合反應(yīng)的鏈引發(fā)階段的發(fā)生，從而使殺菌效果有所提升。這與馮萃敏等學(xué)者建立的EGCG氧化聚合反應(yīng)衰減模型相吻合[14]。

2.2 EGCG-Cu和EGCG 投加量對其抑菌性能的影響

EGCG-Cu和EGCG對大腸桿菌均有明顯抑菌作用，并且EGCG-Cu的抑菌效果較EGCG更優(yōu)。由圖2可進一步得知，當(dāng)EGCG-Cu初始濃度達到150 mg/L時，細菌完全殺滅，抑菌率達到100%。初始濃度在100 mg/L時，抑菌率為95%。即使初始濃度在50 mg/L時，其對大腸桿菌的殺滅效果也很明顯，抑菌率也達到60%。對比EGCG不同濃度下的抑菌率可以看出，EGCG-Cu在較低的濃度下就可有效殺滅大腸桿菌，達到較好的抑菌效果。

圖2 EGCG-Cu絡(luò)合物和EGCG的濃度與抑菌率關(guān)系Fig.2 The disinfection performance of EGCG-Cu and EGCG

2.3 反應(yīng)時間對EGCG-Cu和EGCG抑菌性能的影響

EGCG-Cu和EGCG在初始24 h的抑菌率見圖3和圖4。

由圖3可知，在0～6 h內(nèi)，EGCG-Cu的消毒效果受接觸時間的影響顯著，在12 h左右達到最大值并且趨于平穩(wěn)。低初始濃度的EGCG-Cu的抑菌能力受反應(yīng)時間的影響較大，如初始濃度在25 mg/L時，15 min至6 h內(nèi)，其抑菌率增加了60%。而隨著EGCG-Cu的初始濃度的提高，如100 mg/L時，由于EGCG-Cu在15 min時就達到了84%的抑菌率，所以在15 min至6 h內(nèi)其抑菌率僅增加了9%。綜上所論，EGCG-Cu在初始濃度為100 mg/L時，在較短時間(15 min)就能到達較好的抑菌效果。在較低初始濃度25 mg/L時，雖短時間(15 min)的抑菌率僅為14%，但隨著反應(yīng)時間的增長，在6 h時能達到74%的抑菌效果并趨于穩(wěn)定。對比EGCG的抑菌過程，由圖4可知，EGCG-Cu和EGCG均是在6 h左右達到較穩(wěn)定的抑菌效果，而且在達到較好的抑菌率的同時，EGCG-Cu的投加量遠小于EGCG的投加量。

圖3 EGCG-Cu在初始24 h的消毒效果Fig.3 Bacteriostatic rate of EGCG-Cu in the initial 24 h

圖4 EGCG在初始24 h的消毒效果Fig.4 Bacteriostatic rate of EGCG in the initial 24 h

2.4 EGCG與EGCG-Cu誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧簇情況的比較

圖5 EGCG和EGCG-Cu誘導(dǎo)大腸桿菌產(chǎn)生活性氧簇量Fig.5 EGCG and EGCG-Cu induce E.coli to produce ROS

3 結(jié)論

以大腸桿菌作為細菌滅活效果的指示菌，探究了EGCG-Cu和EGCG的消毒效果，并對初始投加量、反應(yīng)時間等影響因素進行了研究，并對EGCG-Cu消毒效果優(yōu)于EGCG的成因進行了初探，所得結(jié)論如下：

(1)實驗表明EGCG-Cu的最小抑菌濃度小于EGCG，抑菌性優(yōu)于EGCG。

(2)EGCG-Cu和EGCG的消毒效果均與其初始投加量呈正相關(guān)。在抑菌過程中，EGCG-Cu和EGCG均是在反應(yīng)6 h時達到較穩(wěn)定的抑菌效果。

(3)相同的消毒效果所需EGCG-Cu或EGCG的投加量不同，EGCG-Cu的投加量遠小于EGCG。

(4)對EGCG-Cu和EGCG的抑菌機理分析表明，EGCG-Cu與EGCG相比，在消毒過程中可持續(xù)引起大腸桿菌胞內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧簇，使菌體的抗氧化系統(tǒng)崩潰，造成菌體死亡。這個過程開始階段主要是EGCG-Cu釋放出的Cu2+發(fā)生類芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生的超氧化物。Cu2+降低后促進發(fā)生鏈反應(yīng)起主要作用，發(fā)生氧化反應(yīng)生成EGCG醌和·O2-，持續(xù)使大腸桿菌體內(nèi)產(chǎn)生活性氧簇，從而產(chǎn)生更強的殺菌效果。

綜上表明，與金屬離子絡(luò)合是改進EGCG消毒效果的有效途徑，EGCG-Cu在用量少和消毒效果好方面均體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。