謝榮 張和平 劉曉惠 劉佳麗 李沁蕓

637000 南充，川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科(謝榮，張和平，劉曉惠，劉佳麗，李沁蕓)；637100 南充，川北醫(yī)學院(謝榮)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最重要的并發(fā)癥之一，是多種因素共同參與作用的結果。其中，腎間質纖維化在糖尿病腎損傷中作為一個獨立因素，可導致腎功能惡化，主要病理特點表現(xiàn)為腎間質成纖維細胞增生，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度聚集。整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)是胞漿內(nèi)的轉導蛋白，它作為多蛋白體中的支架，通過不同的信號轉導導致細胞多種生物活性改變。國內(nèi)外研究證實ILK參與了糖尿病腎小球早期硬化、系膜細胞增生、ECM聚集、氧化應激、足細胞損傷、血管內(nèi)皮細胞增殖等多種信號通路，在糖尿病患者的腎臟損傷中發(fā)揮了重要作用[1]。PINCH-1(particulary interesting new cysteine-histicline rich protein-1)蛋白是ILK的專屬伴侶，在蛋白水平上可以調節(jié)ILK的活性，PINCH-1、ILK形成的PINCH-ILK-α-Parvin復合物在整合素信號的傳導中，介導細胞增生、黏附、ECM聚集[2-3]，是腎小管上皮間充質轉化過程中的關鍵調節(jié)點。但目前關于PINCH-1蛋白在DN的研究尚未見報道。本研究觀察高糖刺激對大鼠腎臟成纖維細胞PINCH-1、ILK表達的影響，以及腎間質成纖維細胞表型轉化、ECM相關蛋白分泌的影響，探索PINCH-1蛋白在DN發(fā)生發(fā)展中的作用及可能機制。

材料與方法

一、材料與試劑

正常大鼠腎間質成纖維細胞株(NRK49F)購自上海通派生物科技有限公司。H-DMEM、L-DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；兔抗大鼠PINCH-1多克隆抗體、兔抗大鼠ILK多克隆抗體、兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體購自Abcom公司；SP-免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司；PINCH-1引物、ILK引物、β-Actin引物、α-SMA引物、逆轉錄試劑盒、Taq聚合酶購自大連寶生物公司；大鼠FN、Col I ELISA試劑盒購自R&D公司。

二、方法

1.細胞培養(yǎng) 用含10%滅活胎牛血清L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)NRK 49F細胞。置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱孵育，每2～3 d換液1次，3～5 d傳代1次。

2.實驗分組與處理 實驗前24 h將培養(yǎng)液換成L-DMEM無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，使細胞同步化。(1)高糖組用10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時作低糖組，分別取0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h的標本(每組設3個復孔)進行實驗。(2)用含10%FBS的不同濃度葡萄糖(5.5 mmol/L、15.0 mmol/L、25.0 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基，分成三組(每組設3個復孔)培養(yǎng)48 h后，進行實驗。

3.RT-qPCR檢測PINCH-1、ILK mRNA的表達 TRIZOL提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄獲得cDNA，以cDNA為模板進行RT-PCR，檢測PINCH-1 mRNA、ILK、α-SMA mRNA表達水平。引物序列為：PINCH-1上游引物5′-TGGACATCGCCATTATGAGAGG-3′，下游引物5′-CAAGTGGAACAGGCAAAGCAG-3′，目的片段長度162 bp；ILK上游引物5′-TACAAACAGACGCTCAGCAGACA-3′，下游引物5′-TGGTGGGATAGTAGGCCGAAG-3′，目的片段長度145 bp；α-SMA上游引物5′-GAAGAGTTACGAGTTGCCTGATG-3′，下游引物5′ -ATGATGCTGTTGTAGGTGGTTTC-3′，目的片段長度138 bp；β-Actin上游引物5′-ACGGTCAGGTCATCACTATCG-3′，下游引物5′-GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3′，目的片段長度155 bp。real-time RT-PCR按照RocheFastStart Universal SYBR Green Master(ROX)說明書進行，相對基因表達采用2-ΔΔCT法計算。

4.免疫細胞化學法檢測PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的表達 將處于對數(shù)生長期的細胞，用胰酶消化后，以1.0×105個/mL的密度接種到爬片上進行培養(yǎng)。細胞化學染色時吸出培養(yǎng)液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min，PBS清洗2 min×3次；0.3% Triton X-100浸泡5 min細胞破膜，PBS漂洗2 min×3次；3% H2O2封閉過氧化物酶10 min，PBS漂洗2 min×3次；正常山羊血清封閉20 min(室溫)；吸除多余的血清，分別滴加一抗，包括兔抗大鼠PINCH-1多克隆抗體(1∶200)、兔抗大鼠ILK多克隆抗體(1∶200)、兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體(1∶100)，放于濕盒中4 ℃冰箱過夜；常溫下復溫，PBS漂洗2 min×3次，吸除爬片上多余的液體，滴加生物素化山羊抗兔/小鼠IgG二抗，37 ℃，避光孵育20 min，PBS漂洗2 min×3次；吸除爬片上多余的液體，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，孵育20 min；DAB鏡下顯色3～5 min，自來水充分沖洗；蘇木素復染細胞核約15 s，自來水沖洗；梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下拍照記錄并進行蛋白半定量分析。

5.ELISA法檢測FN、Col I蛋白的表達 取出細胞爬片之前，收集各組細胞上清液，3 000 r/min 離心，按照ELISA試劑盒說明書操作，于波長450 nm的全光譜分光光度計上讀取各孔的A值，檢測FN、Col I的蛋白含量。每組設6個復孔，以其均值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、高糖刺激成纖維細胞不同的時間對PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA表達的影響

高糖刺激成纖維細胞6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后，分別以0 h作對照，低糖組PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA在各時間點的表達無明顯差異(P>0.05)。高糖組PINCH-1、ILK mRNA表達均在6 h后顯著增加，與低糖組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高糖組α-SMA mRNA表達呈時間依賴性增加，在72 h達高峰(P<0.05)。(圖1、圖2、圖3)

圖1 高糖組和低糖組不同作用時間PINCH-1 mRNA的相對表達量

圖2 高糖組和低糖組不同作用時間ILK mRNA的相對表達量

圖3 高糖組和低糖組不同作用時間α-SMA mRNA的相對表達量

二、不同濃度的葡萄糖刺激成纖維細胞48 h后，PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA的表達情況

不同濃度葡萄糖(5.5 mmol/L、15.0 mmol/L、25.0 mmol/L)刺激成纖維細胞48 h后，PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA的表達呈濃度依賴性增加，高糖組(25.0 mmol/L)PINCH-1 mRNA表達量是低糖組(5.5 mmol/L)的(1.98±0.09)倍，高糖組ILK mRNA表達量是低糖組的(2.34±0.16)倍，高糖組α-SMA mRNA表達量是低糖組的(5.86±0.84)倍，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。(圖4)

注：與5.5 mmol/L葡萄糖濃度組比較，aP<0.01圖4 不同濃度葡萄糖刺激成纖維細胞48 h后PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA的相對表達量比較

三、高糖刺激成纖維細胞不同的時間PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的表達情況

免疫細胞化學染色顯示正常大鼠腎臟成纖維細胞胞漿中PINCH-1、ILK蛋白呈低水平表達，α-SMA蛋白幾乎無表達。高糖刺激能明顯增加PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白表達，并隨著時間延長，呈一定遞增趨勢，高糖刺激成纖維細胞48 h時，PINCH-1蛋白水平達最高峰，刺激24 h時ILK蛋白水平達最高峰，刺激72 h時α-SMA蛋白水平達最高峰，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(表1)

四、不同濃度的葡萄糖刺激成纖維細胞48 h后PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的表達情況

不同濃度葡萄糖(5.5 mmol/L、15 mmol/L、25 mmol/L)刺激成纖維細胞48 h后，PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的表達均呈濃度依賴性增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(表2)

表2 不同濃度葡萄糖刺激NRK49F細胞48 h后PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的相對表達量比較

注：與5.5 mmol/L葡萄糖組比較，aP<0.05，bP<0.01

五、高糖刺激成纖維細胞不同的時間FN、Col I的表達情況

ELISA法測定結果顯示高糖刺激能明顯增加ECM主要成分FN、Col I蛋白的表達。高糖刺激成纖維細胞6 h后，F(xiàn)N蛋白的表達呈時間依賴性增加；高糖刺激成纖維細胞12 h后，Col I蛋白表達呈明顯遞增趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(表3)

討 論

DN是糖尿病患者最主要的致死因素，是終末期腎臟病的常見病因。在糖尿病腎間質纖維化過程中，腎臟固有細胞發(fā)生功能和表型改變，轉變?yōu)榭杀磉_α-SMA的肌成纖維細胞，合成ECM能力顯著增強，α-SMA目前被認為是預測腎間質纖維化預后的最好指標[4-5]。早期延緩甚至逆轉腎間質纖維化對DN的防治具有重大的意義。轉化生長因子-β1(tansforming growth factor beta-1，TGF-β1)是成纖維細胞活化和腎間質纖維化的重要啟動和促進因子。高糖刺激能夠促進TGF-β1高表達，體外研究證實，在系膜細胞中，TGF-β1誘導的PINCH-1、ILK、α-parvin的表達增加，PINCH-1、ILK、α-parvin形成的PIP復合體增加，F(xiàn)N和ECM沉積明顯增加[6-7]。Kim等人[8]進一步研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1誘導的早期，PINCH-1、ILK在系膜細胞的表達明顯增加，之后開始下降，同時細胞周期抑制蛋白p27 Kip1的定位和Akt、p38磷酸化發(fā)生改變，推測TGF-β1通過調節(jié)PINCH-1、ILK的表達，參與調節(jié)系膜細胞增殖和肥大。用TGF-β1刺激足細胞，PINCH-1、ILK形成的復合體下調，細胞凋亡蛋白酶-3活性增強，證實PINCH-1抑制足細胞凋亡[9]。Li等[10]證實，用外源性PINCH-1刺激腎小管上皮細胞，E-鈣黏蛋白表達下降，F(xiàn)N的表達明顯升高，PINCH-1在腎小管上皮細胞間充質轉化中發(fā)揮了重要的作用。在原發(fā)性腎小球腎炎腎組織中，PINCH-1的表達隨著腎間質纖維化程度加重而進行性增加，范圍增大[11]。這些研究表明PINCH-1在TGF-β1調控下，與ILK相互作用參與腎間質纖維化的發(fā)生發(fā)展，在不同類型的腎臟細胞中產(chǎn)生不同的效應，影響細胞行為。

表1 高糖刺激NRK49F細胞不同時間PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的相對表達量比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與高糖組12 h比較，bP>0.05；與高糖組24 h比較，cP>0.05

表3 高糖刺激NRK49F細胞不同時間FN、Col I蛋白的表達量比較(μg/L)

注：與對照組比較，aP<0.05

本研究發(fā)現(xiàn)，在低糖環(huán)境下，PINCH-1在NRK49F細胞中少量表達，α-SMA幾乎無表達，ECM主要成分FN、Col I呈低水平表達，在高糖刺激下，PINCH-1蛋白的表達較低糖組明顯增加，纖維化相關蛋白α-SMA、FN、Col I的表達持續(xù)增加，呈一定時間依賴性和濃度依賴性，說明高糖能夠促進PINCH-1的表達，高糖刺激促進腎臟成纖維細胞表型轉化，分泌大量的ECM成分。本研究進一步證實PINCH-1參與早期高糖誘導的腎間質纖維化。本研究結果發(fā)現(xiàn)，在高糖刺激下，PINCH-1在NRK49F細胞中的表達達到峰值后有所下降，但其機制尚不清楚。這一現(xiàn)象可能與PINCH-1在高糖刺激的NRK細胞中不同時期發(fā)揮的主要效應不同有關，表現(xiàn)為抑制細胞凋亡、促進細胞存活[9]。下一步的實驗，將重點對此進行深入研究。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，ILK在高糖誘導的大鼠腎臟成纖維細胞的表達，與PINCH-1的表達具有協(xié)同作用。ILK在高糖刺激下，呈一定時間依賴性增加，達到一定的峰值后，表達有所下降，而在不同葡萄糖濃度下，呈濃度依賴性增加。有研究證實，ILK和α-SMA在高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞和鏈脲霉素誘導的大鼠腎臟組織中，表達明顯增加[12]，抑制ILK的表達，F(xiàn)N、α-SMA的表達均明顯下降，從而延緩高糖誘導的腎小管上皮細胞間充質轉化[13]。我們的研究結果與ILK在其它腎臟固有細胞的研究結果相符合，證實了ILK在DKD整個發(fā)生發(fā)展過程中的重要地位。本實驗中PINCH-1與ILK表達的一致性得到證實，為PINCH-1參與DKD的發(fā)病提供了更充分的依據(jù)。

結合近些年的研究，本課題組推測，在高糖刺激下，PINCH-1、ILK可能通過TGF-β1的調節(jié)表達上調，形成的PIP復合體促進腎間質成纖維細胞活化，ECM大量聚積，參與DN患者腎間質纖維化的發(fā)展。因此，PINCH-1可能成為未來治療DN的新靶點。