龔建光 詹慧芳 金娟 趙黎 李一文 何強(qiáng)

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院/杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院腎臟病科(龔建光，金娟，趙黎，李一文，何強(qiáng))；310058 杭州，浙江大學(xué)校醫(yī)院紫金港校區(qū)(詹慧芳)

足細(xì)胞是腎小球主要的固有細(xì)胞之一，起到維持腎小球基底膜的正常結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)腎小球?yàn)V過(guò)的作用。既往認(rèn)為，多種以蛋白尿?yàn)橹饕憩F(xiàn)的腎小球疾病包括腎小球微小病變、局灶節(jié)段腎小球硬化癥、膜性腎病、糖尿病腎病等與足細(xì)胞的損傷密切相關(guān)[1]。盡管很多學(xué)者試圖尋求足細(xì)胞和腎單元再生的技術(shù)和方法[2-3]，但如何保護(hù)足細(xì)胞，減少凋亡和丟失仍是眾多腎小球疾病的重要治療策略。黃芪甲苷(astragaloside IV，AS-IV)是黃芪的主要活性成分之一，現(xiàn)代藥理研究證明，黃芪甲苷具有抗氧化、抑制心肌細(xì)胞凋亡或免疫調(diào)節(jié)等多重藥理學(xué)作用，是目前國(guó)內(nèi)外熱點(diǎn)研究的免疫調(diào)節(jié)藥，被廣泛使用于心臟及腎臟疾病的治療。研究表明黃芪甲苷可通過(guò)下調(diào)(transient receptor potential channel 6，TRPC6)來(lái)抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡[4]，改善腎臟功能。黃芪甲苷還可通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路抑制腎小管間質(zhì)纖維化[5]。最近的研究顯示，黃芪甲苷可以通過(guò)抑制活性氧的產(chǎn)生來(lái)保護(hù)棕櫚酸誘導(dǎo)的近端腎小管上皮細(xì)胞的凋亡[6]。然而，黃芪甲苷對(duì)足細(xì)胞損傷的影響研究甚少，特別是缺乏關(guān)于以腎病綜合征為主要表現(xiàn)的原發(fā)性腎小球腎炎足細(xì)胞損傷研究。因此，本研究利用經(jīng)典的嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside，PAN)誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型，探討黃芪甲苷對(duì)其的影響及可能的機(jī)制，為黃芪甲苷治療足細(xì)胞凋亡相關(guān)的腎小球疾病提供理論依據(jù)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料和試劑

黃芪甲苷(No.A111275)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；永生化小鼠足細(xì)胞MPC5購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基(No.SH30027.01)購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；10% FBS(No.10437-028)購(gòu)自Gibco公司；CCK8(20150520)試劑盒購(gòu)于上海七海復(fù)泰生物科技有限公司；Annexin V-APC Apoptosis Detection Kit試劑盒購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司；抗nephrin(No.DF7159)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)(No.AF6281)、p-VEGFR2(No.AF8022)、GIV(No.P51970)、p-GIV(No.GP5801)、Akt(No.AF6259)、p-Akt(No.AF0016)以及β-actin(No.BF0198)抗體均購(gòu)于Affnity公司；抗podocin(No.ab50339)抗體購(gòu)于Abcam公司；抗caspase-3和cleaved caspase-3(No.66470-2-Ig)抗體購(gòu)于Proteintech公司；Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(No.BA1032)購(gòu)于Boster公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)和分組 MPC5細(xì)胞于33 ℃擴(kuò)增性培養(yǎng)：用含γ-IFN的10% FBS RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，傳代比例1∶4。足細(xì)胞37 ℃成熟性培養(yǎng)：傳代前在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)鋪Ⅳ型膠原1.5 mL/25 cm2，培養(yǎng)箱中孵育1 h后用PBS 3 mL/25 cm2洗瓶底后吸出，正常傳代細(xì)胞，傳代比例1∶2。在37 ℃培養(yǎng)10天足細(xì)胞分化成熟后，對(duì)MPC5進(jìn)行同步處理24 h(無(wú)血清RPMI-1640 培養(yǎng)24 h)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分組和操作。細(xì)胞根據(jù)不同處理分成：Control組、PAN組(50 μg/mL嘌呤霉素氨基核苷處理24 h)、AS-IV組(分別用5 μg/mL、15 μg/mL、30 μg/mL黃芪甲苷處理24 h)、AS-IV+PAN組(先用黃芪甲苷預(yù)處理30 min，再行50 μg/mL嘌呤霉素氨基核苷處理24 h)。

2.CCK-8檢測(cè)足細(xì)胞生長(zhǎng)活力 實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MPC5細(xì)胞，胰蛋白酶消化，稀釋細(xì)胞使其濃度為1～5×105個(gè)細(xì)胞/mL，分別取100 μL至96孔板，33 ℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)分別接種，待細(xì)胞貼壁后，分組處理，按1∶10體積比混合Cell Counting Kit-8和無(wú)血清的RPMI1640，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度(optical delnsity，OD)。以MPC5細(xì)胞OD值為參考，計(jì)算各組的OD值/ODMPC5×100%的均值為各組的細(xì)胞相對(duì)存活率。

3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 足細(xì)胞凋亡采用annexin V-APC凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集，1 500 r/min離心5 min，棄去上清，收集細(xì)胞；用預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞2次，1 500 r/min離心5 min，洗滌細(xì)胞；加入300 μL的binding buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μL的annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min；再加入10 μL的PI染色，輕輕混勻細(xì)胞，于避光條件下室溫孵育10 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

4.免疫熒光法檢測(cè)足細(xì)胞標(biāo)記蛋白 足細(xì)胞用4%多聚甲醛(ProSciTech，No.C004)室溫固定15 min，用PBS洗2遍。細(xì)胞用50 mM NH4Cl處理10 min，再用含0.3% Triton X-100(Sigma no.T8787)的PBS處理細(xì)胞15 min，然后用固定液(含0.2%牛血清白蛋白、0.2%魚(yú)皮明膠、0.1% Triton X-100)固定細(xì)胞。細(xì)胞加入nephrin(1∶500)、podocin(1∶1000)抗體的固定液，4 ℃共同孵育過(guò)夜。接著，樣品用PBS沖洗5分鐘×2次。然后用Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L)二抗(1∶1000)室溫孵育2 h。細(xì)胞爬片用PBS沖洗后封片。最后用熒光顯微鏡進(jìn)行圖像的采集。采用image j(v 1.8.0)軟件分析熒光強(qiáng)度。

5.Western blot檢測(cè)VEGFR2/GIV通路及凋亡蛋白 收集各組細(xì)胞，PBS洗凈，加含PMSF的裂解液(碧云天公司，P0013B)，于冰上裂解30 min，充分裂解、離心后取上清，收集蛋白。40 μg蛋白樣品和Marker加入SDS-PAGE凝膠上樣孔內(nèi)，先恒壓80 V電泳后恒壓120 V，用時(shí)1.5 h。使用Tanon VE-186轉(zhuǎn)移電泳槽進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。加caspase-3(1∶2000)、cleaved caspase-3(1∶2000)、VEGFR2(1∶1000)、p-VEGFR2(1∶1000)、GIV(1∶1000)、p-GIV(1∶1000)、Akt(1：1000)、p-AKT(1∶1000)、β-actin(1∶1000)一抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBST充分洗滌，HRP標(biāo)記二抗(1∶3000)37 ℃搖床孵育1 h，TBST充分洗滌。將ECL試劑中增強(qiáng)液與穩(wěn)定的過(guò)氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，滴加工作液于PVDF膜上，凝膠成像儀掃描成像。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組足細(xì)胞存活率比較

采用CCK-8法檢測(cè)各組小鼠腎足細(xì)胞藥物處理24 h后的存活情況見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示與Control組比較，PAN組的細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.05)；與PAN組比較，AS-IV(5 μg/mL)+PAN組的細(xì)胞存活率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.162)；而AS-IV(15 μg/mL)+PAN組、AS-IV(30 μg/mL)+PAN組的足細(xì)胞存活率均顯著高于PAN組(P<0.05)。說(shuō)明細(xì)胞的存活率隨著黃芪甲苷濃度的增加呈增加趨勢(shì)。但AS-IV(15 μg/mL)+PAN組與AS-IV(30 μg/mL)+PAN組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.074)。因此，我們后續(xù)的實(shí)驗(yàn)采用15 μg/mL黃芪甲苷進(jìn)行預(yù)處理。

注：與Control組比較，aP<0.05；與PAN組比較，bP<0.05圖1 CCK8法檢測(cè)各組足細(xì)胞相對(duì)存活率的情況

二、各組足細(xì)胞凋亡情況比較

我們采用annexin V/PI雙染法檢測(cè)各組小鼠足細(xì)胞凋亡情況，Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白caspase-3及cleaved caspase-3變化。流式細(xì)胞術(shù)的分析結(jié)果顯示，與Control組比較，PAN組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與PAN組比較，AS-IV組以及AS-IV+PAN組的足細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；AS-IV+PAN組的足細(xì)胞凋亡率顯著高于AS-IV組(P<0.05)。在不同的處理組間，足細(xì)胞早期凋亡略高于晚期凋亡，詳見(jiàn)圖2A和圖2B。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，PAN組的cleaved caspase-3蛋白水平顯著增加；與PAN組比較，AS-IV組以及AS-IV+PAN組的cleaved caspase-3蛋白水平明顯下降(P<0.05)，詳見(jiàn)圖2C和圖2D。

三、各組足細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)情況比較

我們采用免疫熒光染色的方法觀察各組間足細(xì)胞標(biāo)記物nephrin和podocin的表達(dá)情況。nephrin和podocin染色的結(jié)果均顯示，PAN組的熒光強(qiáng)度顯著低于Control組(P<0.05)；經(jīng)黃芪甲苷預(yù)處理以后，再行嘌呤霉素氨基核苷處理24 h，nephrin和podocin的熒光強(qiáng)度均出現(xiàn)明顯的增強(qiáng)(P<0.05)。而AS-IV組與Control組的nephrin和podocin的熒光強(qiáng)度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見(jiàn)圖3。

四、各組VEGFR2/GIV信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況比較

Western blot檢測(cè)不同處理組VEGFR2/GIV信號(hào)通路蛋白及AKT蛋白水平的變化，結(jié)果如圖4所示。PAN處理MPC5細(xì)胞24 h后，VEGFR2及GIV蛋白的磷酸化水平有所升高，AKT蛋白的磷酸化水平被抑制；與PAN組比較，PAN+AS-IV組VEGFR2及GIV蛋白的磷酸化水平進(jìn)一步上調(diào)，而p-AKT水平顯著升高；AS-IV組與Control組比較，VEGFR2、GIV及AKT的蛋白水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討 論

足細(xì)胞是一種高度分化的上皮細(xì)胞，一旦丟失很難再生。除了作為腎小球?yàn)V過(guò)屏障和機(jī)械屏障的重要組成部分，足細(xì)胞還可以合成并分泌Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等，在維持腎小球基底膜功能和結(jié)構(gòu)平衡中發(fā)揮重要作用[7]。對(duì)足細(xì)胞損傷機(jī)制及保護(hù)措施的深入探討，有利于推動(dòng)腎小球疾病特別是表現(xiàn)為腎病綜合征的腎臟疾病的防治和研究。我們的研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以抑制PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，減少足細(xì)胞標(biāo)記物丟失，具有保護(hù)足細(xì)胞損傷的作用。

注：與Control組比較，aP<0.05；與PAN組比較，bP<0.05；與AS-IV組比較，cP<0.05圖2 流式細(xì)胞術(shù)及Western blot法檢測(cè)各組足細(xì)胞的凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況；B.各組細(xì)胞正常細(xì)胞及不同階段凋亡細(xì)胞比較；C.Western blot檢測(cè)各組caspase-3和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)情況；D.各組caspase-3和cleaved caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與Control組比較，aP<0.05；與PAN組比較，bP<0.05；與AS-IV組比較，cP<0.05圖3 免疫熒光法檢測(cè)各組足細(xì)胞nephrin和podocin表達(dá)情況 A.免疫熒光染色法測(cè)定各組nephrin表達(dá)(Bar=50 μm)；B.各組nephrin熒光強(qiáng)度比較；C.免疫熒光染色法測(cè)定各組podocin表達(dá)(Bar=50 μm)；D.各組podocin熒光強(qiáng)度比較

注：與Control組比較，aP<0.05；與PAN組比較，bP<0.05；與AS-IV組比較，cP<0.05圖4 Western blot檢測(cè)各組VEGFR2/GIV信號(hào)通路蛋白及AKT的蛋白水平 A.Western blot檢測(cè)各組通路蛋白的表達(dá)情況；B.各組p-VEGFR2蛋白表達(dá)相對(duì)量比較；C.各組VEGFR2蛋白表達(dá)相對(duì)量比較；D.各組p-GIV蛋白表達(dá)相對(duì)量比較；E.各組GIV蛋白表達(dá)相對(duì)量比較；F.各組p-AKT蛋白表達(dá)相對(duì)量比較；G.各組AKT蛋白表達(dá)相對(duì)量比較

黃芪甲苷是中草藥黃芪的主要成分，具有改善心肌缺血、抗炎、抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞以及免疫調(diào)節(jié)等多種功效。近年來(lái)大量的研究表明，黃芪甲苷在保護(hù)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷方面起到了重要的作用。黃芪甲苷可以通過(guò)緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、恢復(fù)自噬活性、抗氧化等途徑減輕足細(xì)胞的損傷[8-9]。我們發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷預(yù)處理可以顯著減少PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡數(shù)量，并且抑制caspase-3的剪切。caspase是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中程序性死亡的介導(dǎo)者和執(zhí)行者，caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，處于凋亡連級(jí)反應(yīng)的下游，被上游成員激活并水解為cleaved caspase-3，介導(dǎo)信號(hào)傳遞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PAN可促進(jìn)caspase-3的活化，而黃芪甲苷雖然沒(méi)有減少caspase-3的表達(dá)，但可以顯著抑制cleaved caspase-3的產(chǎn)生，從而抑制凋亡進(jìn)程。

nephrin和podocin是腎小球足細(xì)胞上的重要分子，分別由NPHS1和NPHS2基因編碼，nephrin是1 241個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白，podocin位于足突細(xì)胞的足突膜表面與nephrin分子的胞漿區(qū)結(jié)合，共同維持足細(xì)胞裂孔隔膜的結(jié)構(gòu)完整性[11]。在多種腎臟疾病中nephrin和podocin分子表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)。PAN誘導(dǎo)的腎病綜合征模型具有與人類腎病相似的特點(diǎn)，故廣泛應(yīng)用于腎病綜合征的研究。研究證實(shí)PAN可以引起足突的融合、局部的細(xì)胞剝離、破壞腎小球?yàn)V過(guò)膜的電荷屏障并下調(diào)nephrin和podocin分子表達(dá)，造成大量蛋白尿的形成[12-13]。目前關(guān)于黃芪甲苷對(duì)足細(xì)胞損傷后nephrin和podocin蛋白的影響鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷預(yù)處理可以顯著對(duì)抗PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞nephrin和podocin蛋白的低表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了黃芪甲苷對(duì)PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

VEGF具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，新生血管形成的作用。GIV(又名Girdin)是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，能與PI3K及AKT蛋白結(jié)合，在多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞自分泌的VEGF可通過(guò)受體VEGFR2活化PI3K/AKT通路抑制足細(xì)胞凋亡[15]。Wang等[16]研究證實(shí)，在嘌呤霉素氨基核苷腎病中，VEGF可通過(guò)激活VEGFR2/GIV/Gi3信號(hào)復(fù)合體以及PI3K/Akt通路來(lái)保護(hù)足細(xì)胞。本研究結(jié)果表明，足細(xì)胞被PAN處理24 h后，AKT的活化受到了抑制，VEGFR2和GIV的磷酸化水平有所升高；經(jīng)黃芪甲苷預(yù)處理的足細(xì)胞，VEGFR2和GIV被進(jìn)一步激活，并且AKT也被明顯的活化。結(jié)果提示在PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中，黃芪甲苷可能通過(guò)活化VEGFR2/GIV通路，然后進(jìn)一步活化AKT通路，以實(shí)現(xiàn)足細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。本研究還發(fā)現(xiàn)，PAN處理的足細(xì)胞中，VEGFR2和GIV蛋白被活化，而AKT的活化卻被抑制了，這可能是由于代償性作用的結(jié)果，由于作用時(shí)間不長(zhǎng)，還不足以活化AKT通路。這還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以有效抑制嘌呤霉素氨基核苷誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡、保護(hù)足細(xì)胞免受損傷，這種保護(hù)作用可能與激活VEGFR2/GIV信號(hào)通路、繼而活化AKT通路有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為黃芪甲苷治療慢性腎臟病提供理論支持，也有助于傳統(tǒng)中醫(yī)藥的臨床研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用。但本研究?jī)H限于體外實(shí)驗(yàn)；而且在觀察信號(hào)蛋白的變化時(shí)，未經(jīng)阻斷或上調(diào)信號(hào)蛋白以進(jìn)一步驗(yàn)證其差異，所以本研究結(jié)果仍有待更多、更深入的研究來(lái)明確。