曾麟雅，賴 爽，曾英杰，肖 力

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院口腔科，四川 成都 610072)

牙再生是口腔科學(xué)中的研究熱點(diǎn)，其中牙周膜再生作為牙再生中的難點(diǎn)和重點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。大量研究表明[1，2]，保持或者重新獲得牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cells，PDLCs)的活性，是牙周膜成功再生的關(guān)鍵?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)是一類具有趨化作用的小分子蛋白，對(duì)BMSCs和PDLSCs都有趨化作用[3]。最新研究發(fā)現(xiàn)[4]，堿性成纖維細(xì)胞因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)可以促進(jìn)再植牙形成新的牙周膜纖維，并在防止再植牙骨性粘連和牙根吸收方面有一定作用。2018年6月至2019年5月本實(shí)驗(yàn)采用MTT法，初步研究SDF-1和bFGF對(duì)比格犬BMSCs增殖的影響，探討兩種因子對(duì)比格犬BMSCs增殖影響的最佳濃度，并利用RT-PCR檢測成骨、成纖維相關(guān)因子以及趨化相關(guān)基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究利用BMSCs促進(jìn)牙周膜再生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone，USA)；胎牛血清(Hyclone，USA)；MTT溶液(Sigma，USA)；CO2恒溫孵箱(MCO-15AC型，Sanyo electric，Japan)；倒置相差顯微鏡及照像系統(tǒng)(IX70-S8F2型，Olympus optical，Japan)；全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀(Varioskanflash3001-1275，Thermo，USA；BestarTM qPCR RT kit(DBI Bioscience，China)。

1.2 方法

1.2.1比格犬BMSCs的分離培養(yǎng)、鑒定和分化原代培養(yǎng)及純化 選取18～24個(gè)月齡雄性體健比格犬，全麻下行骨髓穿刺，獲得比格犬髂骨骨髓，并以差別貼壁法加以純化；傳代培養(yǎng)待原代P0細(xì)胞貼壁融合達(dá)80%～90%時(shí)，以1∶2的比例傳代培養(yǎng)得到第一代(P1)細(xì)胞。用P2～P4細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。消化收集P2～P4比格犬BMSCs，制成5×106/ml的單細(xì)胞懸液，分為100 μl每管，加入抗犬CD29、CD34、CD44、CD45抗體并充分混勻，鑒定流式細(xì)胞學(xué)檢測表面抗原標(biāo)志物CD34、CD29 、CD44及CD45的表達(dá)。同時(shí)，消化收集P2～P4比格犬骨髓干細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為6×104/ml，用微量加樣槍小心滴加細(xì)胞懸液于6孔板上，每孔接種500 μl，分為成骨誘導(dǎo)組，成脂誘導(dǎo)組和對(duì)照組；接種24 h后，成骨誘導(dǎo)組每孔加入2 ml成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對(duì)照組仍加完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵箱培養(yǎng)，誘導(dǎo)20 d后茜素紅染液，倒置相差顯微鏡下觀察并采圖。成脂誘導(dǎo)為接種72 h后加入2 ml成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對(duì)照組仍加完全培養(yǎng)基，誘導(dǎo)14天后油紅O染色，倒置相差顯微鏡下觀察并采圖。

1.2.2MTT檢測不同濃度SDF-1和bFGF分別對(duì)BMSCs的增殖作用 收集P2～P4比格犬BMSCs，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/ml，滴加細(xì)胞懸液于96孔板上，每孔接種2 μl，于CO2孵箱培養(yǎng)，分別加入不同濃度的SDF-1 (100、200、300 ng/ml)與bFGF(20、50、100 ng/ml)進(jìn)行干預(yù)。于培養(yǎng)的1、3、5、7 d，每天同一時(shí)間收集樣本(n=10)進(jìn)行MTT比色實(shí)驗(yàn)。選570 nm波長，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收(OD)值。以時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.3MTT檢測最佳濃度時(shí)SDF-1和bFGF對(duì)BMSCs增殖作用 實(shí)驗(yàn)步驟同上，實(shí)驗(yàn)分組為空白對(duì)照組(未加入任何細(xì)胞因子)和實(shí)驗(yàn)組(加入最佳濃度的SDF-1和bFGF)。

1.2.4RT-PCR檢測成骨、成纖維相關(guān)因子以及趨化相關(guān)基因的表達(dá) 取生長狀態(tài)良好的P2～P4代比格犬BMSCs，將細(xì)胞分為三組，即空白對(duì)照組、SDF-1組(培養(yǎng)基中加入最佳濃度SDF-1)和bFGF組(培養(yǎng)基中加入最佳濃度bFGF)，培養(yǎng)5天后，提取細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，檢測堿性磷酸酶(ALP)、I型膠原、Ⅲ型膠原蛋白、C-X-C家族趨化因子受體4(CXCR4)以及S100A4等基因表達(dá)的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察原代培養(yǎng)24小時(shí)后可見貼壁細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞成集落樣生長，部分細(xì)胞貼壁呈多角形或類圓形。5天以后，細(xì)胞成片生長并相互融合。見圖1。

圖1 BMSCs形態(tài)(×40) a：1天后；b：5天后

2.2 細(xì)胞表型鑒定流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的P3代比格犬BMSCs表面抗原表達(dá)CD29(+)(84.33%)，CD44(+)(57.11%)，CD34(-)(2.87%)，CD45(-)(0.96%)，見圖2。

圖2 比格犬BMSCs表面標(biāo)記流式鑒定圖 a：CD29抗原；b：CD44抗原；c：CD34抗原；d：CD45抗原

2.3 成骨成脂誘導(dǎo)染色成骨誘導(dǎo)20 d后，顯微鏡下觀察，可見誘導(dǎo)組的貼壁細(xì)胞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，生長密集，局部細(xì)胞放射狀聚集成團(tuán)，形成多個(gè)大小不等的圓形礦化結(jié)節(jié)。茜素紅染色后，見礦化結(jié)節(jié)呈紅色，不透明，部分礦化結(jié)節(jié)之間相互融合成片。成脂誘導(dǎo)10 d后便可發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞變得肥大且胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴，為折光度較強(qiáng)的圓形小泡。14 d時(shí)，大部分細(xì)胞變形，內(nèi)含脂滴。油紅O染色可見，脂滴紅染。見圖3。

圖3 BMSCs成骨成脂誘導(dǎo)染色結(jié)果(×100) a：茜素紅染色；b：油紅O染色

2.4 不同濃度SDF-1和bFGF分別對(duì)BMSC的增殖作用bFGF在20、50、100 ng/ml時(shí)對(duì)BMSCs均有促進(jìn)作用，在50 ng/ml時(shí)，達(dá)到峰值，在100 ng/ml時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用降低。所以我們選擇50 ng/ml作為最佳濃度。100、200、300 ng/ml的SDF-1對(duì)BMSCs均有促進(jìn)作用，且200、300 ng/ml的效果更為顯著，達(dá)一定濃度后，SDF-1濃度的增加對(duì)于細(xì)胞的增殖不具有顯著效果。因此，選擇200 ng/ml作為最佳濃度。見圖4、圖5。

圖4 不同濃度bFGF對(duì)BMSCs的增殖作用 *P < 0.5，**P < 0.01，***P < 0.001)

圖5 不同濃度SDF-1對(duì)BMSCs的增殖作用 *P < 0.5，**P < 0.01，***P < 0.001)

2.5 最佳濃度時(shí)SDF-1和bFGF對(duì)BMSCs增殖作用在加入了最佳濃度SDF-1和bFGF的組別中，相對(duì)于空白對(duì)照組來說，細(xì)胞增殖明顯，但是細(xì)胞的生長周期類似。見圖6。

圖6 SDF-1和bFGF最佳濃度時(shí)對(duì)BMSCs增殖作用

2.6 SDF-1和bFGF對(duì)目的基因表達(dá)的影響SDF-1和bFGF都可以顯著增加Ⅰ型膠原的表達(dá)；而對(duì)于Ⅲ型膠原來說，bFGF對(duì)其的表達(dá)上升比SDF-1的作用更為明顯；bFGF可以抑制ALP的表達(dá)，而SDF-1對(duì)ALP的表達(dá)沒有影響；SDF-1和bFGF都可以增加S100A4的表達(dá)，但bFGF對(duì)其的影響更為顯著；SDF-能夠增加CXCR4的表達(dá)，但是bFGF對(duì)其沒有作用。見圖7。

圖7 SDF-1和bFGF對(duì)目的基因表達(dá)的影響 a：Ⅰ型膠原；b：Ⅲ型膠原；c：S100A4；d：ALP；e：CXCR4 *P < 0.5，**P < 0.01，***P < 0.001)

3 討論

牙齒再生是口腔科學(xué)中的研究熱點(diǎn)，大量研究表明，牙周膜被破壞后極易喪失抗感染以及自我修復(fù)和更新的能力，這也是牙周膜再生異常困難的重要原因。近年來，牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)修復(fù)牙周缺損的作用已被證實(shí)[5]，但距離真正的臨床推廣應(yīng)用仍有一定差距，其主要原因是PDLSCs的獲取相對(duì)困難，難以滿足臨床治療需求；而BMSCs的獲得相對(duì)更加便捷，培養(yǎng)方法也簡單成熟。近年來，關(guān)于BMSCs的研究越發(fā)成熟，大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明[6，7]，部分細(xì)胞因子可以通過影響B(tài)MSCs移植的微環(huán)境，進(jìn)一步影響B(tài)MSCs的動(dòng)員、遷移及分化。近期研究發(fā)現(xiàn)[8，9]，通過局部直接注射、動(dòng)靜脈移植等途徑植入同種異體或異種MSCs后，受者體內(nèi)并未發(fā)生免疫排斥，這一結(jié)果提示BMSCs可能具有特殊的免疫學(xué)特征。

SDF-1是一類對(duì)細(xì)胞有趨化作用的小分子蛋白質(zhì)，可促進(jìn)細(xì)胞Ⅰ型膠原基因表達(dá)上調(diào)，刺激BMSCs的增殖。此外，Kim的團(tuán)隊(duì)利用SDF-1的趨化作用，在未植入種子細(xì)胞的小鼠牙槽窩內(nèi)，植入了具有牙齒外形并復(fù)合SDF-1的生物材料，結(jié)果顯示有類似牙齒的結(jié)構(gòu)再生[10]。bFGF是一種應(yīng)用廣泛、功能多樣的細(xì)胞因子，對(duì)細(xì)胞生長、增殖、分化等都有著重要的調(diào)節(jié)作用。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為[11]，bFGF作用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化增殖的早期，促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分裂增殖，增加細(xì)胞數(shù)量，此外，bFGF能在提高BMSCs增殖速度和壽命的同時(shí)，保持其多分化潛能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在一定濃度內(nèi)，SDF-1和bFGF濃度的增加有助于細(xì)胞的增殖，但到達(dá)一定濃度后，其濃度的增加對(duì)于細(xì)胞的增殖無顯著效果，這一現(xiàn)象可能與受體減少或細(xì)胞轉(zhuǎn)化通道的阻滯有關(guān)[12]。

一系列研究顯示，存在的一些蛋白分子包括S100A4、以及Ⅲ型膠原等生物活性物質(zhì)均具有抑制礦化的作用，可能參與維持牙周膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定[13]。CXCR4是SDF-1唯一作用的趨化受體，如果表達(dá)增加，那么SDF-1對(duì)該細(xì)胞的趨化作用增強(qiáng)。從結(jié)果看來，SDF-1和bFGF能夠不同程度的刺激Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和S100A4的表達(dá)。我們知道，Ⅰ型膠原是牙周膜纖維中最主要的成分之一，而Ⅲ型膠原與S100A4能阻止礦化基質(zhì)的沉積，可能對(duì)維持正常牙周膜間隙不被礦化有一定的作用，因此體外實(shí)驗(yàn)可以證明BMSCs在SDF-1和bFGF的刺激下，可能朝著牙周膜纖維細(xì)胞方向分化并且使相關(guān)的抑制礦化的基因和蛋白表達(dá)增加，這就為我們下一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中使用SDF-1和bFGF來促進(jìn)BMSCs向牙周膜成纖維細(xì)胞分化、從而促進(jìn)牙周再生提供了一個(gè)有力的支持和證據(jù)。綜上所述，我們推測，SDF-1和bFGF將會(huì)對(duì)BMSCs介導(dǎo)的牙周膜組織再生工程產(chǎn)生積極作用，而對(duì)于兩種因子作用下分子機(jī)制的研究還需要更深入細(xì)致的探討。