葛全興,劉志軍,郭雙磊,陳小兵,霍俊峰

河南大學(xué) 淮河醫(yī)院,河南 開封475000

腦膠質(zhì)瘤是人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腦腫瘤,其中多數(shù)為惡性。盡管目前在診斷技術(shù)、外科治療和化療方面發(fā)展迅速,但是,惡性腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后5年生存率不足5%[1]。對人民健康造成極大威脅。隨著對腫瘤分子機制和相關(guān)信號通路了解的逐步深入,為腦膠質(zhì)瘤的治療提供一些新的靶點,促進了腫瘤藥物治療的發(fā)展。本研究通過在河南大學(xué)淮河醫(yī)院病理科收集多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)組織,進行分離、培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染,采用流式細胞儀、免疫組化檢、免疫熒光染色等進行檢測,并進行小鼠成瘤實驗等方法,以研究血管內(nèi)皮生長因子(VEGFR2)以及代表功能活化的磷酸化受p-VEGFR2和增殖標(biāo)記蛋白Neuropilin-1(細胞膜表面跨膜糖蛋白,是一種VEGFR高親和力的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體)等在惡性腦膠質(zhì)瘤病灶和周圍正常組織的差異表達,初步探討VEGF2在腦膠質(zhì)瘤細胞增殖和生長作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和人神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤異種移植物樣本

19例多形性膠質(zhì)母細胞瘤組織樣本(T1～T17)為手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織,從河南大學(xué)淮河醫(yī)院新近診斷或復(fù)發(fā)腫瘤切除的患者中獲得(通過河南大學(xué)淮河醫(yī)院倫理委員會審查并批準(zhǔn))。4份人神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤異種移植物樣本(T556,T1966,T4121,T3691)為人神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤組織樣本通過BALB/c(nu/nu)小鼠成瘤實驗獲得。

1.2 實驗動物

24只BALB/c(nu/nu)雄性小鼠(8～10周齡),購于南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,許可證號：SYXK(粵)2016-0167。

1.3 腫瘤組織分離、細胞培養(yǎng)和流式細胞儀分析、分類

將腫瘤組織切碎,在平衡鹽溶液中清洗,用木瓜蛋白酶(南京建成生物科技有公司)消化,并通過70 μm細胞過濾器過濾。為恢復(fù)細胞表面抗原,在細胞分類前,將分離的腦膠質(zhì)瘤細胞接種于添加B27、表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子的Neurobasal A培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜。然后分別添加人特異性抗體VEGFR2-Alexa Fluor 647(Bio Legend,美國)；CD34-Alexa Fluor 488,CD105-Alexa Fluor 488,CD144-Alexa Fluor 488(Miltenyi Biotec,美國)；CD31-Alexa Fluor 488/CD31-PE(Bio Legend,美國)；CD133/2-PE(Miltenyi Biotec,美國)進行結(jié)合。然后用流式細胞儀(Fluorescence Activated Cell Sorting,FACS Calibur BD)分析,獲得的數(shù)據(jù)通過FlowJo 軟件進行處理。用MoFlo XDP流式細胞儀(Beckman Coulter)對VEGFR2+(VEGFR2H)和VEGFR2+(VEGFR2L)細胞組分進行分類：(1)低表達(L),與IgGA F647對照相比,GBM細胞與表面VEGFR2結(jié)合的比率低于10%；(2)高表達(H),GBM細胞表面VEGFR2信號值高于IgG-AF647對照。

1.4 石蠟切片免疫組化分析

將手術(shù)切除的人GBM(n=15)腫瘤組織標(biāo)本和人腦正常組織(n=5),用福爾馬林固定、石蠟包埋并進行免疫染色,檢查腫瘤細胞中VEGFR2陽性的細胞膜和細胞漿的百分比,每張切片計數(shù)單個顯微鏡視野下400個GBM細胞染色陽性數(shù)目,共計10個視野。每張切片由一位經(jīng)驗豐富的病理學(xué)專家進行評分。

1.5 免疫印跡分析和免疫沉淀

用7%SDS-PAGE分離VEGFR2的全細胞提取物或免疫沉淀復(fù)合物,并使用iBlot系統(tǒng)(Invitrogen,美國)將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜。用5%(wt/vol)干牛奶在PBS-Tween-20(0.5%)中阻斷膜,用抗VEFR2、磷酸化VEGFR2、NRP1、EEA1作為對照。根據(jù)產(chǎn)品說明書使用ECL檢測系統(tǒng)。

1.6 生物素標(biāo)記/再循環(huán)試驗和膜蛋白分離

為了測量細胞膜表面和細胞漿內(nèi)VEGFR2的相對比例,根據(jù)說明書,使用細胞表面蛋白分離試劑(Thermo Fisher Scientific)進行細胞表面蛋白生物素標(biāo)記。免疫沉淀蛋白用于加載SD-SPAGE免疫印跡分析VEGFR2,NRP1。

1.7 表面和總VEGFR2的FACS分析

對表面與總VEGFR2進行FACS分析參考Ostrowski等的方法[2]。

1.8 慢病毒sh RNA質(zhì)粒制備和細胞轉(zhuǎn)染

慢病毒sh RNA質(zhì)粒(Sigma Aldrich,美國)制備參考Stewart等[3,4,5]。用ELISA p24(Takara Bio Inc.)對病毒滴度進行了檢測,對VEGFR2轉(zhuǎn)染細胞采用了相同的滴度。感染后2d,用嘌呤霉素篩選細胞48 h,用于細胞增殖能力和體內(nèi)腫瘤形成的評估。

1.9 體內(nèi)成瘤實驗

體內(nèi)成瘤實驗參照Bao等[6,7]的方法。經(jīng)河南大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),將100、1 000、5 000或10 000個細胞移植到BALB/c(nu/nu)小鼠紋狀體(每組4～6只)中。對于VEGFR2shRNA的研究,如上所述,注射10 000個活的嘌呤霉素選擇細胞。

1.10 統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 軟件(Graph Pad Software,Inc.),通過或單向方差分析和獨立樣本t檢驗,P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 VEGFR2在人GSC中富集

實驗對17例新分離的人GBM標(biāo)本進行了流式細胞分析,發(fā)現(xiàn)CD133+細胞表面VEGFR2的表達與CD133-相比富集(CD133+陽性率19.6%而CD133-的陽性率為4.7%；P＜0.001 7)；表面VEGFR2陽性的腫瘤細胞比例不同,從1.4%到25.9%(平均13.8%±8.3%)不等。如圖1(A)。

本研究對石蠟包埋GBM標(biāo)本進行免疫組化分析,結(jié)果在GBM細胞表面及胞漿均可見VEGFR2,而在VEGFR2在正常人腦血管內(nèi)皮及組織中可見少量聚集。如圖1(B)。

為明確VEGFR2在GBM細胞的分布情況,本研究對4例GBM標(biāo)本采取2個獨立實驗,結(jié)果：VEGFR2在GBM細胞膜的比例分別為T12,2.4%；T16,5.5%；T18,5.5%；T19,17.4%,胞漿VEGFR2比例 分別為T12,10.5%；T16,6.3%；T18,22%；T19,27%；總 VEGFR2比例分別為T12,12.9%；T16,11.8%,T18,27.7%；T19,44.4%。如圖1(C)。這說明VEGFR2在細胞膜和細胞漿內(nèi)均可表達,而胞漿VEGFR2的較為顯著,這與免疫組化分析結(jié)果一致。

為了證實CD133+細胞同時含有表面和胞漿VEGFR2,我們對新鮮分離的標(biāo)本(T4121和T3691)表面VEGFR2/CD133進行雙染色,然后對總VEGFR2進行固定、滲透和附加染色。結(jié)果,VEGFR2在CD133+細胞的分布表現(xiàn)為3種形式：表面(T4121,4.58%；T3691,2.09%)、表面和胞漿(T4121,12.3%；T3691,10.7%)和僅胞漿(T4121,27%,T3691,40.5%)。如圖1(D)所示,胞漿VEGFR2較為顯著,這一結(jié)果部分與獨立實驗結(jié)果一致。

圖1 人GSC表面富集的VEGFR2

2.2 VEGFR2+GBM在體內(nèi)血管周圍富集

本研究對人GBM活檢冰凍切片的免疫熒光染色證實靠近血管結(jié)構(gòu)存在VEGFR2細胞群,如圖2(A)。

在本研究中,將GBM細胞表面表達的VEGFR2(易通過活細胞FACS分類分離表面VEGFR2)標(biāo)記為VEGFR2H細胞。結(jié)果表明原位注射GFP-慢病毒標(biāo)記VEGFR2H/CD31-GBM細胞參與了小鼠腦實質(zhì)腫瘤血管的形成,如圖2(B)所示。

2.3 VEGF、VEGFR2與NRP1的相互作用

本研究對GBM冷凍切片進行免疫熒光檢測結(jié)果可觀察到磷酸化Neuropilin-1(NRP1)和總VEGFR2在GBM標(biāo)本冷凍切片免疫熒光定位,如圖3(A)。

圖2 VEGFR2 H GBM細胞在體內(nèi)定位于血管周微環(huán)境

圖3 活化的VEGFR2定位于GBM細胞的胞漿并進行內(nèi)吞和再循環(huán)

為了進一步研究NRP1在VEGF-VEGFR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的潛在作用,我們比較了未經(jīng)治療的GBM細胞提取物中VEGFR2和NRP1的免疫共沉淀,結(jié)果如圖3(B),這說明VEGFR2信號在GSC中表達可能依賴于VEGF配體,其升高的水平可能進一步增強激活的VEGFR2自磷酸化,通過與NRP1共受體的相互作用而增強。

此外,sh RNA介導(dǎo)的NRP1基因敲除導(dǎo)致VEGFR2蛋白水平顯著降低,表明NRP1在VEGFR2蛋白穩(wěn)定性中起著重要的作用,如圖3(C)?？俈EGFR2和活性Tyr1054磷酸化的VEGFR2的很大一部分被定位在胞漿中,如圖3(D)。我們用細胞表面蛋白生物素化實驗,然后在不同時間點剝離表面暴露的生物素,證實VEGFR2、活化的VEGFR2和NRP1的再循環(huán),如圖3(E)。最后,免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡成像證實VEGFR2-NRP1的胞漿與早期/循環(huán)內(nèi)細胞核共定位,標(biāo)記為早期細胞核抗原1(EAA1)；如圖3(F)。

綜上結(jié)果說明VEGFR2優(yōu)先表達于CD133人膠質(zhì)瘤干細胞(GSC)的細胞表面及惡性腦膠質(zhì)瘤病灶小血管周圍,其活力、自我更新和致瘤性,可能依賴VEGFR2、NRP1協(xié)同作用,VEGF-VEGFR2-NRP1軸的信號傳遞,可能在GBM發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。

2.4 VEGFR2增強GSC生長、增殖和成瘤能力

我們用FACS對VEGFR2 H和VEGFR2L細胞進行了分類,并評估了它們的腫瘤形成能力。結(jié)果表明,VEGFR2 H細胞比VEGFR2L細胞具有更高的增殖能力,如圖4(A)。對于T556和T1966,P＜0.001,這與對這些分類細胞進行的平行活力測試有關(guān),如圖4(B)。

圖4 VEGFR2的表達促進了GSC的增殖和活力

對異種移植GBM標(biāo)本(T556和T4121)中VEGFR2L和VEGFR2H細胞的匹配數(shù)量進行了腫瘤形成(A)和(T556和T1966)活力(B)的測定。(A)數(shù)據(jù)為兩個獨立實驗的均值±SD(n=3；P＜0.001)。(B)GSCs的活力。數(shù)據(jù)為兩個獨立實驗的均值±SD(n=3；P＜0.001)。

這些結(jié)果表明,VEGFR2的存在確定了GBM細胞具有增強的增殖傾向和瘤體形成。

3 討論

尋找方便的分子標(biāo)記物和GSC的關(guān)鍵功能特征是近十年來癌癥研究的重點。由于膠質(zhì)瘤的高度異質(zhì)性,很難使用單一標(biāo)記識別單個膠質(zhì)瘤患者的GSC。目前盡管在該領(lǐng)域取得了重大進展,但以CD133為GSC富集候選標(biāo)記,已取得較多研究成果,然而對其功能意義和對癌癥治療的相關(guān)性尚不完全明確[9]。我們的研究以CD133+作為GSC的標(biāo)記,對VEGFR2進行研究,發(fā)現(xiàn)VEGFR2在GSC表面富集,提示VEGFR2在GBM的發(fā)生、發(fā)展過程中可能具有重要作用。NRP1是一種高親和力的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體,存在于多種細胞中,如神經(jīng)元和內(nèi)皮細胞[8,10,11],目前對于GSC鮮有報道。雖然NRP1似乎不能單獨誘導(dǎo)細胞內(nèi)信號,但已知它通過促進VEGF165和VEGFR2之間的相互作用來增強血管生成,從而導(dǎo)致內(nèi)皮細胞中VEGF-VEGFR2信號的增加[12]。VEGFR2介導(dǎo)的信號可能以自分泌的VEGF配體依賴的方式啟動,這一途徑可能包括VEGFR2與NRP1對VEGF依賴性相互作用,我們結(jié)果表明,GSC相關(guān)的VEGF-VEGFR2-NRP1通路在GBM發(fā)生、發(fā)展中受到調(diào)節(jié),包括VEGF的自分泌(VEGFR2H細胞較高)和VEGFR2蛋白穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)。我們目前的結(jié)果為GBM研究的這一領(lǐng)域提供了新的見解：VEGF-VEGFR2-NRP1相互作用是惡性膠質(zhì)瘤治療的一個新的和有吸引力的靶點。

總之,VEGFR2優(yōu)先表達于CD133人腦膠質(zhì)瘤干細胞的表面及惡性腦膠質(zhì)瘤灶小血管周圍,其增殖、生長能力和致瘤性,可能部分依賴于通過VEGFR2-NRP1的信號傳遞,可能在GBM的增殖和生長過程中發(fā)揮一定作用。但本研究樣本量小,研究方法較為單一,未來大樣本量及多種方法、多角度的研究則尤為必要。