相思宇，薛書江，張 影，關(guān)立增

（1. 延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2. 臨沂大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276005）

豬附紅細(xì)胞體（Mycoplasma suis，M.suis）是一種寄生在豬紅細(xì)胞表面和骨髓中，能夠引起豬貧血、黃疸、發(fā)熱等癥狀[1]。豬附紅細(xì)胞體?。≒orcine eperythrozoonosis，PE）是一種人畜共患病，在1932 年首次發(fā)現(xiàn)，并在世界范圍內(nèi)廣泛報道，該病隱性感染率高。巴西[2]、德國[3]檢測到豬感染PE 的感染率分別為18.2%和13.9%，中國上海已經(jīng)有人感染該病原的相關(guān)報道[4]。目前，已經(jīng)有30 多個國家檢測出了動物感染PE。該病正嚴(yán)重危害著社會公共衛(wèi)生安全[5]。

α-烯醇化酶（α-enolase，ENO）是一種多功能蛋白，是原核和真核細(xì)胞胞質(zhì)中的關(guān)鍵糖酵解酶，是許多生物中表達(dá)最豐富的胞漿蛋白之一[6]。經(jīng)鑒定，豬附紅細(xì)胞體的ENO 不僅是一種表面蛋白，也是結(jié)合纖維蛋白溶酶原的表面蛋白，對宿主的侵襲和黏附具有重要作用。ENO 已被證實具有良好的抗原性[7]，是一種理想的血清學(xué)診斷和免疫學(xué)檢測靶標(biāo)。迄今為止，豬附紅細(xì)胞體仍無較理想的能體外連續(xù)培養(yǎng)的方法，只能在動物體內(nèi)生長和繁殖，這就使豬附紅細(xì)胞體病的臨床診斷受到限制。目前，針對豬附紅細(xì)胞體的檢測以常規(guī)PCR 方法為主，而在臨床樣本的大量檢測中常規(guī)PCR 檢測方法耗時耗力，增加了實驗人員的工作量，并不適用于豬附紅細(xì)胞體臨床樣本的大量檢測。常規(guī)ELISA 檢測方法往往是以菌體蛋白為包被抗原，這樣需要提純大量豬附紅細(xì)胞體，難度較大；而豬附紅細(xì)胞體寄生于紅細(xì)胞表面，菌體蛋白難免受血液成分的影響而導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確?；诖?，本實驗將ENO 基因克隆至原核表達(dá)載體pGEX-4T-1 中并經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定、初步建立以ENO 為包被抗原的豬附紅細(xì)胞體間接ELISA 檢測方法，旨在為豬附紅細(xì)胞體病的防控提供技術(shù)儲備。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 原核表達(dá)載體pGEX-4T-1、大腸桿菌BL21 及DH5α感受態(tài)細(xì)胞由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室提供；克隆載體pMD18-T Simple、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶、DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶、HRP 標(biāo)記的兔抗豬IgG 等購自TaKaRa 公司；血液基因組DNA 提取試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA 生物技術(shù)公司；Protein Pure GST Resin 購自上海英俊生物科技有限公司；實驗用豬血清樣品以及豬附紅細(xì)胞體陽性抗凝血均采自吉林省延邊州某養(yǎng)豬場，豬附紅細(xì)胞體陽性及陰性標(biāo)準(zhǔn)血清均由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室制備，分裝并于-20 ℃保存；豬弓形蟲、豬大腸桿菌、豬肺炎支原體、豬鏈球菌等陽性血清均由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室提供。

1.2 引物設(shè)計與合成 應(yīng)用Oligo 6.31 和Primer Premier 5.0 軟件，根據(jù)GenBank 中登錄的豬附紅細(xì)胞體全基因組序列（NC-015153.1），設(shè)計擴增ENO 基因的1 對特異性引物，上、下游引物5'端分別加入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點（下劃線部分），并由上海生工生物工程有限公司合成。

P1：5'-CGGGATCCGCCACCATGGCTTTTAGTATA GAAAATCTT-3'；

P2：5'-CCGCTCGAGTTAGATAATGCATGACCATC CAGCTTTCT-3'。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 以血液基因組DNA 提取試劑盒提取的豬附紅細(xì)胞體陽性抗凝血的總DNA 為模板，利用1.2 中的P1/P2 引物PCR 擴增ENO 基因。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化回收后克隆至pMD-18T simple 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-18T-ENO，將PCR和雙酶切鑒定均為陽性的重組質(zhì)粒由上海英俊生物技術(shù)公司測序鑒定。

用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切pMD-18T-ENO 質(zhì)粒獲得ENO 基因片段后克隆至pGEX-4T-1 載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-ENO/BL21。經(jīng)PCR、雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒由上海英俊生物技術(shù)公司測序鑒定。

1.4 豬附紅細(xì)胞體ENO 重組蛋白的表達(dá)及檢測將鑒定為陽性的重組菌pGEX-4T-ENO/BL21 培養(yǎng)至OD600nm=0.6 后加入IPTG（終濃度為1 mmol/L），分別在誘導(dǎo)后2 h～6 h 取2 mL 培養(yǎng)物，離心后收集沉淀。以同樣處理的pGEX-4T-1/BL21 空載體菌離心后收集沉淀，作為對照。將上述各沉淀超聲裂解后，經(jīng)SDS-PAGE 檢測重組蛋白的表達(dá)與可溶性。以豬附紅細(xì)胞體陽性標(biāo)準(zhǔn)血清（1∶100）為一抗，以兔抗豬HRP-IgG（1∶4 000）為二抗，Western blot 檢測重組蛋白的反應(yīng)原性。

1.5 豬附紅細(xì)胞體ENO 基因間接ELISA 檢測方法的建立

1.5.1 間接ELISA檢測方法反應(yīng)條件優(yōu)化 采用方陣滴定法優(yōu)化該間接ELISA 方法的反應(yīng)條件：用包被液將純化的重組蛋白抗原2 倍倍比稀釋（82 μg/mL～0.64 μg/mL），100 μL/孔，置于4 ℃過夜包被；PBST洗凈包被液，加封閉液（1%BSA、3%脫脂奶粉）200 μL/孔，37 ℃封閉（30 min、1 h、2 h）。洗凈封閉液，用PBS（PH 7.4）將豬附紅細(xì)胞體陰陽性血清2 倍倍比稀釋（1∶20～1∶320），置于37 ℃作用2 h。PBST 洗滌，用PBS（PH 7.4）加入兔抗豬HRP-IgG（1∶1 000、1∶2 000、1∶400）100 μL 孔，置于37 ℃反應(yīng)（0.5 h、1 h、1.5 h、2 h）。PBST 洗滌，加底物OPD 顯色液，100 μl/孔，室溫避光顯色15 min。加終止液50 μL/孔，用酶標(biāo)儀檢測并記錄OD492nm值。選擇陽性O(shè)D492nm值在1.0 左右，同時陽性/陰性比值最大的一組作為最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.5.2 臨界值的確定 用上述優(yōu)化的間接ELISA 方法檢測30 份豬附紅細(xì)胞體陰性血清，測定其OD492nm值，并對其進行統(tǒng)計學(xué)分析。計算平均值（-x）及標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理，OD492nm≥-x+3SD 判定為陽性，OD492nm≤-x+2SD 判定為陰性，OD492nm值介于兩者之間判定為可疑。

1.5.3 特異性試驗 以豬弓形蟲病、豬大腸桿菌病、豬鏈球菌、豬肺炎支原體的陽性血清為反應(yīng)血清，以豬附紅細(xì)胞體陽性血清作對照，利用已經(jīng)確定的最佳反應(yīng)條件進行間接ELISA 檢測，以評估該方法的特異性。

1.5.4 敏感性試驗 將豬附紅細(xì)胞體陽性血清按1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280稀釋，利用已經(jīng)優(yōu)化的間接ELISA 方法檢測，根據(jù)檢測結(jié)果判定陽性血清的最大稀釋倍數(shù)，評價本實驗建立的間接ELISA 方法的敏感性。

1.5.5 重復(fù)性試驗 取同一批次的重組蛋白包被的酶標(biāo)板檢測7 份陽性血清，每份血清3 個重復(fù)，評價所建立間接ELISA 檢測方法的批內(nèi)重復(fù)性；取3個不同批次重組蛋白包被的酶標(biāo)板檢測該7 份陽性血清，每份血清3 個重復(fù)，評價所建立間接ELISA方法的批間重復(fù)性。根據(jù)公式CV%=SD/-x，進行數(shù)值統(tǒng)計并計算重復(fù)性試驗的變異系數(shù)。

1.5.6 臨床樣品檢測 應(yīng)用已經(jīng)建立的間接ELISA檢測方法與朱紹輝建立的間接免疫熒光檢測方法（IFA）[8]平行檢測50 份采自延邊地區(qū)某豬場的豬血清樣本，比較兩種方法的檢測結(jié)果，并計算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pGEX-4T-ENO/BL21 的構(gòu)建與鑒定利用P1/P2 引物以豬附紅細(xì)胞體陽性血液的基因組DNA 為模板，進行PCR 擴增。結(jié)果顯示，獲得約為1 200 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。將該基因克隆至pMD18-T 載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-18TENO，經(jīng)PCR 及BamH I 和Xho I 酶切鑒定，結(jié)果顯示得到約1 200 bp 片段，測序結(jié)果顯示獲得的豬附紅細(xì)胞體ENO 基因長為1 200 bp，編碼393 個氨基酸，與GenBank 登錄的基因序列（NC-015153.1）同源性為100%。將該基因克隆至pGEX-4T-1 中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-ENO。經(jīng)PCR 及雙酶切鑒定，結(jié)果顯示得到約1 200 bp 片段（圖2），表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-4T-ENO。

2.2 重組蛋白的表達(dá)與檢測 IPTG 誘導(dǎo)pGEXENO/BL21 2 h 后，經(jīng)SDS-PAGE 電泳檢測。結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白為69 ku，而空載體對照組沒有相應(yīng)條帶（圖3）。表明ENO 重組蛋白正確表達(dá)。Western blot 結(jié)果顯示，獲得大小為69 ku 的特異性條帶（圖4），表明原核表達(dá)的重組蛋白具有較好的反應(yīng)原性。

圖1 豬附紅細(xì)胞ENO 基因的PCR 擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of ENO gene of Mycoplasma suis

圖2 pGEX-ENO 重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR 及雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of pGEX-ENO/recombinant expression plasmid by PCR and double-digestion

圖3 重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE 檢測Fig.3 Detection of recombinant protein expression by SDS-PAGE

圖4 重組蛋白純化的SDS-PAGE 檢測及western blot 鑒定Fig.4 SDS-PAGE and western blot identification of recombinant protein

2.3 間接ELISA 條件的確定

2.3.1 間接ELISA 檢測方法反應(yīng)條件優(yōu)化 采用方陣滴定法優(yōu)化該ELISA 方法的反應(yīng)條件（表1）。結(jié)果顯示，抗原的最佳包被濃度為20.5 μg/mL，血清的最佳稀釋度為1∶80。最佳封閉條件為3%的脫脂乳，37 ℃封閉2 h。酶標(biāo)二抗HRP-兔抗豬IgG 最佳稀釋倍數(shù)為1∶1 000。

2.3.2 臨界值的確定 應(yīng)用已經(jīng)建立的ELISA 方法檢測30 份豬附紅細(xì)胞體陰性血清，并測定其OD492nm值。30 份陰性血清的OD492nm平均值為0.1719±0.0481，根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析軟件計算：OD492nm平均值-x=0.1719，標(biāo)準(zhǔn)偏差SD=0.0481，30 份豬附紅細(xì)胞體陰性血清樣本OD492nm值呈正態(tài)分布（圖5）。按照公式：確定陽性血清的臨界值為-x+3SD=0.1719+3×0.0481=0.316，將-x+2SD=0.1719+2×0.0481=0.2681 定為可疑界限。因此，將OD492nm≥0.32 判定為陽性，OD492nm≤0.27 判 定 為 陰 性，OD492nm值 介 于0.27～0.32 之 間 判 定為可疑區(qū)間，需要對該樣本重新檢測。

表1 間接ELISA 方法反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions of the indirect ELISA

圖5 陰性樣品結(jié)果正態(tài)分布圖Fig.5 Normal distribution diagram of negative samples

2.3.3 特異性試驗 利用已建立的ELISA 方法檢測豬弓形蟲、豬大腸桿菌、豬肺炎支原體、豬鏈球菌的陽性血清，結(jié)果顯示OD492nm值均小于0.32，重組蛋白ENO 不與上述血清發(fā)生交叉反應(yīng)（表2）。表明該方法具有較強的特異性。

2.3.4 敏感性試驗 用本試驗建立的間接ELISA 方法對不同稀釋倍數(shù)下的豬附紅細(xì)胞體陽性血清進行檢測，當(dāng)陽性血清稀釋320 倍，OD492nm值仍大于0.32（表3），結(jié)果表明，該方法的敏感性較高，能夠檢測到豬附紅細(xì)胞體陽性血清的最大稀釋倍數(shù)為1∶320 倍。

2.3.5 重復(fù)性試驗 使用同一批次重組蛋白包被的酶標(biāo)板檢測7 份陽性血清，每份血清3 個重復(fù)，同一批次相同樣品間的變異系數(shù)均小于5%；使用3 個不同批次重組蛋白包被的的ELISA 板，分別對該7份豬附紅細(xì)胞體陽性血清進行ELISA 檢測，每個樣品不同批次間的變異系數(shù)均小于5%（表4），表明該間接ELISA 檢測方法具有較好的重復(fù)性。

表2 間接ELISA 的特異性試驗結(jié)果Table 2 The specificity test of the indirect ELISA

表3 間接ELISA 敏感性試驗Table 3 The sensitivity test of the indirect ELISA

表4 間接ELISA 重復(fù)性試驗結(jié)果（n=7）Table 4 The repeatability test of the indirect ELISA(n=7)

2.3.6 臨床樣品檢測 利用所建立的間接ELISA 和IFA 方法對吉林省琿春市50 份豬血清樣品進行檢測，結(jié)果顯示，間接ELISA 方法檢測的陽性率為30%，比IFA方法檢測的陽性率高10%。而且IFA方法檢測出陽性的樣品，間接ELISA 法同樣檢測為陽性（表5）。經(jīng)計算兩種方法的總符合率為90%。表明，該方法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性較高，可以用于臨床樣品的檢測。

表5 臨床血清樣品的檢測Table 5 Detection of clinical serum samples by the indirect ELISA and IFA

3 討 論

豬附紅細(xì)胞體是一種粘附于大多數(shù)脊椎動物血液紅細(xì)胞中的嗜血性支原體[9-14]。豬附紅細(xì)胞體病隱性感染率高，是一種對養(yǎng)豬業(yè)和社會公共衛(wèi)生安全威脅較大的人畜共患病[15-16]。目前，對豬附紅細(xì)胞體病的控制和預(yù)防沒有行之有效的疫苗，臨床上該病也缺少商品化的檢測體系[17]。因此，建立一種經(jīng)濟、高效的豬附紅細(xì)胞體檢測方法對該病的防制至關(guān)重要。

目前，豬附紅細(xì)胞體具有診斷意義的蛋白有HspA1、MSG1 以及ENO，其中ENO 是目前發(fā)現(xiàn)的豬附紅細(xì)胞體第三種黏附蛋白[18-21]。ENO 普遍存在于多種細(xì)菌表面，并且能夠加強細(xì)菌對宿主的黏附能力，被認(rèn)為是具有很好免疫原性的蛋白[6]。本實驗選用豬附紅細(xì)胞體ENO 基因片段的長度為1 200 bp，編碼393 個氨基酸，編碼的氨基酸序列與其它支原體該基因編碼的氨基酸序列的同源性為59.6%～65.1%，比其它支原體該基因編碼的氨基酸序列多出了90 個氨基酸的C 末端片段，這些多出的氨基酸片段的作用還需要進一步的研究。因為ENO 具有粘附于豬紅細(xì)胞上的作用，所以有的科學(xué)家預(yù)測，這些多出的片段很有可能與豬附紅細(xì)胞體的粘附作用有關(guān)。本實驗將表達(dá)出的ENO 重組蛋白經(jīng)western blot 鑒定，表明該重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。利用用已建立的ELISA 方法檢測豬弓形蟲、豬大腸桿菌、豬肺炎支原體、豬鏈球菌的陽性血清，結(jié)果顯示其OD492nm值均小于0.32，表明重組蛋白不與上述血清發(fā)生交叉反應(yīng)，該方法特異性較強。

豬附紅細(xì)胞體病血清學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展受限于豬附紅細(xì)胞體缺乏成熟的體外培養(yǎng)系統(tǒng)[22]。目前，豬附紅細(xì)胞體血清學(xué)檢測方法有雙抗體夾心ELISA[23]、辣根過氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌A 蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗（PPA-ELISA）[24]、Dot-ELISA[25]，但是這些檢測方法使用的均是豬附紅細(xì)胞體全抗原，需要分離提純大量的豬附紅細(xì)胞體，而豬附紅細(xì)胞體目前不能進行體外的增殖培養(yǎng)，若制備大量的豬附紅細(xì)胞體，則整個制備過程耗費時間較長，工作量較大。本實驗選用豬附紅細(xì)胞體ENO 基因進行克隆及原核表達(dá)，得到大量的重組ENO 蛋白，用于間接ELISA方法的包被抗原，建立豬附紅細(xì)胞體的間接ELISA檢測方法，降低了檢測成本并簡化了操作步驟。特異性、敏感性及重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，本實驗建立的間接ELISA 方法特異、敏感、穩(wěn)定，可用于臨床檢測豬附紅細(xì)胞體病的流行情況。

利用原核表達(dá)純化的豬附紅細(xì)胞體重組ENO 蛋白為包被抗原，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了豬附紅細(xì)胞體抗體的間接ELISA 檢測方法。該方法具有較好的特異性、敏感性和重復(fù)性，適用于臨床血清樣品豬附紅細(xì)胞體抗體檢測和豬附紅細(xì)胞體感染的血清流行病學(xué)調(diào)查。