王永智，葉華躍，聶利芳，雷高新，李磊，彭福中，喬正

(1.泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)疫苗工程中心，泰州 225300；2.江蘇大同盟制藥有限公司，泰州 225300)

單克隆抗體藥物因其具有特異性強、療效好、副作用少等優(yōu)點逐步成為腫瘤、自身免疫疾病、心血管等疾病的理想治療藥物[1-4]，已成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的最熱門方向[5]。而單克隆抗體作為復(fù)雜的蛋白大分子藥物，不但相對分子質(zhì)量大，而且還存在蛋白翻譯后修飾，因此藥物的質(zhì)量控制是其研發(fā)和生產(chǎn)過程中不容忽視的環(huán)節(jié)[6]，也成為全球藥品監(jiān)管機構(gòu)關(guān)注的熱點[5]。其中，單克隆抗體藥物的含量測定是其質(zhì)量控制中一個重要參數(shù)，準(zhǔn)確的含量測定對單克隆抗體藥物殘留雜質(zhì)的限量控制、比活性的計算及產(chǎn)品的分裝等環(huán)節(jié)均具有重要意義[7]。表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR) 是一種物理光學(xué)現(xiàn)象[8-9]，由Wood在1902年首次發(fā)現(xiàn)[10]，近年來逐步成為生化分析領(lǐng)域重要的分析手段和研究工具[11]。SPR法可檢測出幾乎所有的生物大分子物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和藥物研發(fā)等領(lǐng)域的研究[12]。

Protein A(Staphylo coccal Protein A)來源于金黃色葡萄球菌，可以與IgG的Fc片段發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)[13]。因此，本研究采用Protein A芯片，利用Protein A可以與IgG的Fc片段發(fā)生結(jié)合的特性，基于SPR技術(shù)建立一種高通量的快速、簡便、準(zhǔn)確的測定單克隆抗體含量的方法。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 生物分子相互作用分析儀(BIAcore T200，GE公司)；S系列Protein A芯片(GE公司，批號：10268296)；10×HBS緩沖液(GE公司，批號BCBV7063)；Surfactant P20(GE公司，批號：8072939)；10 mmol·L-1pH值1.5鹽酸甘氨酸緩沖液(GE公司，批號：10259550)；人IgG1對照品(Abcam公司，批號：GR3218380-4)；RPMI1640無血清培養(yǎng)基(Gibco公司，批號：1991640)；單抗Mab1(江蘇某制藥公司，批號：B20180912)。

1.2方法建立與優(yōu)化 將儀器溫度設(shè)置為25 ℃，待儀器溫度穩(wěn)定后，將樣品以10 μL·min-1的流速注入儀器，樣品與Protein A芯片結(jié)合時間設(shè)為30 s，讀取Ru值。上樣結(jié)束后，以pH值1.5、濃度10 mmol·L-1鹽酸甘氨酸溶液以30 μL·min-1的流速再生30 s。

1.3方法驗證

1.3.1專屬性考察 本研究考察了空白輔料溶液、RPMI1640無血清培養(yǎng)基及上樣緩沖液(1×HBS緩沖液)對抗體測定是否有影響。將單抗Mab1溶液、人IgG1對照品以1×HBS緩沖液分別稀釋至1 000 ng·mL-1，空白輔料溶液、RPMI1640無血清培養(yǎng)基、上樣緩沖液(1×HBS緩沖液)按同樣條件進(jìn)行稀釋，按照建立的方法進(jìn)行檢測分析，考察空白輔料溶液、RPMI1640無血清培養(yǎng)基及上樣緩沖液是否對抗體檢測有干擾，確定方法的專屬性。

1.3.2線性范圍 取人IgG1對照品，以1×HBS緩沖液依次稀釋至20 000，10 000，5000，2000，1000，500，200，100，50，20 ng·mL-1按照建立的方法進(jìn)行檢測分析，每個濃度測試3次，以人IgG對照品濃度為橫坐標(biāo)，以響應(yīng)值(RU)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍。

1.3.3檢測限及定量限 以0濃度的抗體樣品對應(yīng)的平均Ru值作為儀器噪音，以信噪比3：1對應(yīng)的抗體濃度作為該方法的檢測限，以信噪比10：1對應(yīng)的抗體濃度作為該方法的定量限。

1.3.4準(zhǔn)確度 取人IgG1對照品，以空白輔料緩沖液分別稀釋至高、中、低(5000，500，50 ng·mL-1) 濃度，每個濃度平行制成3份，按照建立的方法進(jìn)行檢測分析，計算每個準(zhǔn)確度溶液濃度及回收率。

取IgG對照品，以RPMI1640無血清培養(yǎng)基分別稀釋至高、中、低(5000，500，50 ng·mL-1) 濃度，每個濃度平行制成3份，按照建立的方法進(jìn)行檢測分析，計算每個準(zhǔn)確度溶液濃度及回收率。

1.3.5重復(fù)性實驗 取單抗Mab1溶液以1×HBS緩沖液稀釋至高、中、低(5000，500，50 ng·mL-1) 濃度，每個濃度平行制成3份，按照建立的方法進(jìn)行檢測分析，計算樣品的平均濃度及RSD值。

1.3.6中間精密度實驗 由兩名不同實驗人員A、B各自獨立操作，分別取單抗Mab1溶液稀釋至1000 ng·mL-1，按照建立的方法進(jìn)行檢測分析，各重復(fù)檢測6次，計算樣品的平均濃度及變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)。

1.3.7耐用性 取單抗Mab1溶液稀釋至1000 ng·mL-1，通過計算流速改變(8，10，12 μL·min-1)，結(jié)合時間改變(25，30，35 s)以及樣品處理后室溫放置不同時間(0，2，4，6，8 h)后進(jìn)行檢測，計算得出樣品平均濃度及RSD值。

2 結(jié)果

2.1方法建立與優(yōu)化 在建立基于SPR技術(shù)的抗體濃度測定方法時，需要考慮的參數(shù)主要有上樣速度、結(jié)合時間及再生條件。上樣速度及結(jié)合時間兩個參數(shù)共同影響建立的方法檢測抗體濃度的線性范圍。適宜的再生條件則需滿足每次再生將Protein A結(jié)合的抗體分析物全部洗脫下來并不影響芯片表面Protein A結(jié)合抗體Fc端的活性。經(jīng)過摸索，建立的檢測方法條件如下：儀器溫度設(shè)置為25 ℃，上樣速度為10 μL·min-1，結(jié)合時間為30 s，芯片再生條件為以pH值1.5濃度為10 mmol·L-1的鹽酸甘氨酸溶液以30 μL·min-1的流速再生30 s。

2.2專屬性考察 見圖1，IgG1對照品、Mab1抗體溶液均與Protein A芯片產(chǎn)生結(jié)合信號，空白輔料溶液、RPMI1640無血清培養(yǎng)基、上樣緩沖液均無結(jié)合信號。結(jié)果表明空白輔料溶液、RPMI1640無血清培養(yǎng)基均與Protein A芯片無非特異性結(jié)合，對抗體檢出無干擾，該方法專屬性強。

2.3線性范圍 以人IgG1對照品濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)單位(Ru)為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，抗體濃度在20～20 000 ng·mL-1的范圍內(nèi)，響應(yīng)單位(RU)與IgG1濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2為1，見圖2。

2.4檢測限及定量限 經(jīng)實驗，0濃度抗體樣品平均Ru值為0.14，以0.14作為儀器的噪音。以儀器3倍噪音對應(yīng)的抗體濃度作為此方法的檢測限，以儀器10倍噪音作為此方法的定量限。經(jīng)計算，該方法的檢測限為2.07 ng·mL-1，定量限為11.16 ng·mL-1。

2.5準(zhǔn)確度 以空白輔料溶液稀釋人IgG1對照品，按照建立的方法進(jìn)行檢測分析的結(jié)果見表1。經(jīng)計算，人IgG1對照品5000，500，50 ng·mL-1高中低3個濃度在空白輔料中回收率分別為102.68%，102.68%，99.26%，9份樣品平均回收率為101.54%，RSD值2.23%。以RPMI1640無血清培養(yǎng)基溶液稀釋人IgG1對照品，按照建立的方法進(jìn)行檢測分析的結(jié)果見表2。

圖1 專屬性考察結(jié)果

圖2 方法線性范圍考察結(jié)果

Fig.2Theanalysisresultsoflinearrangeofthemethod

表1 空白輔料加標(biāo)回收率

Tab.1TherecoveryrateofIgG1standardinblankexcipient

空白輔料加標(biāo)濃度實測濃度( ng·mL-1)回收率平均回收率%50005172.46103.45102.685089.78101.805139.26102.79500510.42102.08102.68512.49102.50517.36103.475049.2798.5499.2648.3696.7251.26102.52

經(jīng)計算，5000，500，50 ng·mL-1人IgG1對照品在RPMI1640無血清培養(yǎng)基中的回收率分別為105.07%，100.88%，96.22%，9份樣品平均回收率為100.72%，RSD值4.23%。上述結(jié)果表明，該方法加標(biāo)回收率好，準(zhǔn)確度高。

表2 RPMI1640無血清培養(yǎng)基加標(biāo)回收率

Tab.2TherecoveryrateofIgG1standardinRPMI1640medium(serumfree)

RPMI1640無血清培養(yǎng)基加標(biāo)濃度實測濃度( ng·mL-1)回收率平均回收率%50005232.36104.65105.075219.27104.395309.13106.18500488.9097.78100.88514.35102.87509.96101.995046.9293.8496.2249.2498.4848.1796.34

2.6重復(fù)性實驗 取單抗Mab1溶液以1×HBS緩沖液稀釋至高、中、低(5000，500，50 ng·mL-1)濃度，每個濃度平行檢測3次，經(jīng)計算，5000，500，50 ng·mL-1單抗Mab1樣品重復(fù)性所得RSD分別為2.04%，2.37%，2.27%(表3)。表明該方法重復(fù)性好。

2.7中間精密度 兩名不同實驗人員各重復(fù)檢測6次，結(jié)果見表4，經(jīng)計算，變異系數(shù)為0.49%。表明該方法中間精密度高。

表3 重復(fù)性實驗結(jié)果

Tab.3Theanalysisresultsofrepeatabilitytest

樣品濃度實測濃度(ng·mL-1)RSD/%50005092.532.045219.225303.71500523.792.37526.64504.075048.722.2747.9750.16

表4 中間精密度實驗結(jié)果

Tab.4Theanalysisresultsofintermediateprecisionng·mL-1

實驗人員123456A1043.631041.771038.071040.851038.071039.92B1038.241035.281039.461052.421034.361032.68

2.8耐用性 本研究考察了流速(8，10，12 μL·min-1)，結(jié)合時間(25，30，35 s)以及樣品處理后室溫放置不同時間(0，2，4，6，8 h)等條件的微小改變對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果顯示：流速改變檢測結(jié)果平均值為1005.01 ng·mL-1，RSD值為4.39%；結(jié)合時間改變檢測結(jié)果平均值為993.40 ng·mL-1，RSD值為6.03%；樣品處理后室溫放置0～8h之內(nèi)，檢測結(jié)果平均值為1017.12 ng·mL-1，RSD值為2.64%(表5)。結(jié)果表明，該方法耐用性好，實驗條件微小改變對檢測結(jié)果無影響，抗體Mab1溶液在8h之內(nèi)保持穩(wěn)定。

3 討論

抗體藥物作為一種大分子藥物，由于其結(jié)構(gòu)的高度復(fù)雜性，對其產(chǎn)品的質(zhì)量控制和管理更加嚴(yán)格?？贵w含量測定為抗體藥物質(zhì)量控制及抗體表達(dá)株篩選、評價的一個重要參數(shù)。目前，常用的單抗藥物含量測定方法有消光系數(shù)法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法等，但是這些方法尚存在一些不足，如易受樣品基質(zhì)干擾、樣品前處理復(fù)雜、方法靈敏度低、重復(fù)性差、定量范圍窄等。不能滿足抗體藥物質(zhì)量控制的高要求[6，14]。近年來，一些新的檢測方法也被用于抗體含量的測定。鄧春平等[15]建立了一種均相時間分辨熒光法(HTRF)用于單克隆抗體含量的測定，該方法抗體含量測定范圍為25～1000 ng·mL-1，線性相關(guān)系數(shù)在0.99以上，平均回收率為98.9%。該方法將熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)與時間分辨熒光技術(shù)(time-resolved fluorescence，TRF)兩者的優(yōu)點結(jié)合起來，建立了一種高靈敏度、高通量的抗體含量測定方法。但該方法需要對抗原進(jìn)行標(biāo)記，樣品前處理復(fù)雜，同時需要用到鑭系元素(如Eu)標(biāo)記的抗人IgG(Fc)的抗體，限制了該技術(shù)的應(yīng)用。曾秀引等[6]建立了一種采用生物膜干涉技術(shù)(bio-layer interferometry，BLI)的高通量抗體濃度快速檢測方法，線性范圍0.781～400 μg·mL-1，準(zhǔn)確度范圍94.46%～114.00%。但該方法線性范圍窄、定量限較高(1 μg·mL-1)，不能用于低濃度抗體樣品的濃度測定，限制了該檢測技術(shù)的應(yīng)用范圍，不適用于表達(dá)量較低單克隆抗體細(xì)胞株前期篩選工作。本研究利用表面等離子共振技術(shù)建立的單克隆抗體藥物濃度測定方法，專屬性好，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，耐用性強并且檢測線性范圍較寬。該方法在空白輔料及RPMI1640無血清培養(yǎng)基中3個濃度水平平均回收率較高，方法不易受到樣品基質(zhì)影響，對樣品基質(zhì)要求較低。因此，相比較于傳統(tǒng)的消光系數(shù)法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法等，本法具有以下優(yōu)勢：樣品處理簡單，僅需要經(jīng)過濾過、稀釋、離心等步驟即可直接上機檢測，簡化實驗流程，提高實驗效率。同時該方法線性范圍寬(20～20 000 ng·mL-1)，檢測限(2.07 ng·mL-1)及定量限低(11.16 ng·mL-1)，既適用于單克隆抗體藥物制劑、中間品樣品的含量測定又適用于單克隆抗體發(fā)酵上清等樣品中抗體濃度測定。另外，BIAcore T200支持96和384孔板，可實現(xiàn)抗體濃度的高通量測試，因此也特別適合單克隆抗體細(xì)胞株篩選階段大批量抗體樣品濃度的檢測及評估。

表5 耐用性考察結(jié)果