劉鑫,王偉,姜玉聲,馮思雨,何雨航,曹林泉,陳雪

(大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023)

單細(xì)胞蛋白(single cell protein，SCP)是指細(xì)菌、真菌、微藻等單細(xì)胞微生物所產(chǎn)生的胞內(nèi)蛋白質(zhì)，又稱微生物蛋白或生物菌體蛋白，其蛋白含量通常在40%～80%，還含有脂肪、碳水化合物、核酸、維生素、無機(jī)鹽等，可謂營養(yǎng)豐富[1]。近年來，隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，生物活性藥物及原料的規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)已日漸成熟[2]。其中，維生素C(VC)二步混菌發(fā)酵是中國首創(chuàng)且唯一應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的生物制藥方法[3]，然而，相關(guān)研究中對于微生物發(fā)酵后所產(chǎn)生發(fā)酵廢液的無害化處理報(bào)道較少，尚缺乏規(guī)范化的方案。生產(chǎn)過程中如何處理這些含有豐富單細(xì)胞蛋白的發(fā)酵廢液，在減少污染的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)其資源化利用成了新的課題[4]。

水產(chǎn)品作為人類優(yōu)質(zhì)蛋白供給的重要來源，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的可持續(xù)性很大程度上依賴于魚粉替代品的獲得[5]。輪蟲等浮游動(dòng)物食物鏈等級(jí)低、增殖迅速、培養(yǎng)工藝簡單，已成為水產(chǎn)苗種培育中廣泛使用的重要生物餌料[6]。規(guī)模化生產(chǎn)中，一般采用小球藻Chlorellaspp.、微擬球藻Nannochloropsisspp.等微藻類或酵母、細(xì)菌等餌料培養(yǎng)輪蟲，其中普遍認(rèn)為，微藻培養(yǎng)的輪蟲質(zhì)量與使用效果較好[7-8]。然而，培養(yǎng)微藻要求人力物力投入，成本較高，而藻類生長還受環(huán)境條件影響，其生產(chǎn)不穩(wěn)定性與營養(yǎng)單一等問題也使其應(yīng)用具有局限性[9]。另外，相關(guān)研究中也有使用雞糞和發(fā)酵菜籽粕培養(yǎng)輪蟲的報(bào)道[10-11]，但使用雞糞會(huì)增加病原生物引入及抗生素、重金屬等有害物質(zhì)殘留的風(fēng)險(xiǎn)，而其他原料又會(huì)增加一些生產(chǎn)成本。因此，開發(fā)更加適合輪蟲攝食生長而又成本低廉的新型餌料具有重要的應(yīng)用價(jià)值[11-14]。

本試驗(yàn)中選擇藥廠制備維生素C(VC)所產(chǎn)生的發(fā)酵廢液、微擬球藻Nannochloropsisspp.、裂殖壺藻Thraustochytriumspp.及其不同的餌料組合，投喂海水培養(yǎng)的褶皺臂尾輪蟲Brachionusplicatilis，測定種群密度變化，以及水體氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽和pH等指標(biāo)，探討了發(fā)酵廢液用于培養(yǎng)輪蟲的可行性與合適的投喂方案，旨在為生物制藥發(fā)酵廢液的資源化利用，以及微生物單細(xì)胞蛋白應(yīng)用于水產(chǎn)生物餌料培養(yǎng)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)酵廢液為某商業(yè)化藥廠制備維生素C(VC)的過程產(chǎn)物冷藏貯運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后于-20 ℃下冷凍備用。發(fā)酵廢液固型物的分離采用5000 r/min離心，去上清液后，冷凍保存。經(jīng)測定，其中含水分、粗蛋白質(zhì)、粗灰分、粗脂肪、粗纖維、鈣、總磷含量分別為12.9%、49.1%、6.7%、3.3%、0.8%、3.2%、0.76%。

冷凍微擬球藻膏由盤錦光合蟹業(yè)有限公司提供，細(xì)胞密度為(400±50)×108cells/g，使用前稱取，置于純凈水中解凍、稀釋。裂殖壺藻由大連理工大學(xué)微藻課題組保種，本實(shí)驗(yàn)室自行培養(yǎng)，冷凍保存。L-型褶皺臂尾輪蟲由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，培養(yǎng)于鹽度為23.0±1.1的過濾海水中，試驗(yàn)前投喂微擬球藻暫養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組與投喂 試驗(yàn)設(shè)置微擬球藻(A)、發(fā)酵廢液(B)、裂殖壺藻(C)、微擬球藻+發(fā)酵廢液(D)、微擬球藻+裂殖壺藻(E)、微擬球藻+發(fā)酵廢液+裂殖壺藻(F)、微擬球藻+發(fā)酵廢液固型物(G)7種餌料投喂處理組，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行。養(yǎng)殖容器為15 L的玻璃缸，其中，加入鹽度為23.0±1.1的海水10 L。用水族箱加熱器控制溫度為(29.0±1.4)℃。輪蟲接種時(shí)，用150目篩絹網(wǎng)過濾收集，接種密度為20 ind./mL，全程不間斷微充氣培養(yǎng)。每日8:00進(jìn)行吸污、換水，換水量為水體的1/3。每日投喂4次，發(fā)酵廢液與裂殖壺藻的投喂量參考酵母培養(yǎng)輪蟲的操作[12-13]，為1.5 g/(106ind.·d)(以干質(zhì)量計(jì))。微擬球藻投喂密度為50×104cells/mL。各混合組的投喂量按餌料種類數(shù)，以各組分相同質(zhì)量平均配比。

1.2.2 水質(zhì)指標(biāo)測定 將輪蟲培養(yǎng)缸中的水虹吸至200 mL燒杯中，用0.22m孔徑的濾膜過濾水樣。采用納氏試劑法、重氮-偶氮光度法和鋅-鎘還原法分別測定總氨氮(TAN)、亞硝酸鹽和硝酸鹽含量，采用便攜式pH計(jì)(PHB-3，上海)測量pH值。

1.2.3 輪蟲密度測定 每日15:00時(shí)取樣，將輪蟲在缸內(nèi)均勻分散，在缸中不同位置各取1 mL水樣至玻璃凹面皿上，然后置于生物解剖鏡下觀察計(jì)數(shù)，以3次計(jì)數(shù)的平均值為最終記錄數(shù)據(jù)。各生長指標(biāo)計(jì)算公式為

輪蟲抱卵率=抱卵輪蟲數(shù)/輪蟲總數(shù)×100%，

增長倍數(shù)=結(jié)束時(shí)輪蟲數(shù)量/輪蟲接種數(shù)量，

日增長量=Nt-Nt-1，

日均增長量=(Nt-N0)/t，

日均增長率=(lnNt-lnN0)/t×100%。

其中:N0和Nt分別為試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)輪蟲種群密度(ind./mL)；t為試驗(yàn)時(shí)間(d)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

水質(zhì)指標(biāo)、輪蟲種群密度等試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 20.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Tukey多重比較，以0.05作為差異顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 投喂不同餌料對輪蟲密度的影響

投喂不同餌料的各組輪蟲接種密度均為20 ind./mL，連續(xù)培養(yǎng)7 d。從表1可見：D、E、F、G各組間輪蟲抱卵率均無顯著性差異(P>0.05)，但均顯著高于A、B、C組(P<0.05)；B和C組間輪蟲的日均增長量無顯著性差異(P>0.05)，但均顯著低于其他組 (P<0.05)；A、B、C組輪蟲的日均增長率顯著低于其他組(P<0.05)；G組輪蟲抱卵率全程最高，日均增長量為27.3 ind./(mL·d)，日均增長率為33.5%/d，增長倍數(shù)達(dá)到了10.6倍，且顯著高于其他組(P<0.05)。

至采收時(shí)，僅投喂發(fā)酵廢液的B組輪蟲密度最低，為11 ind./mL，投喂微擬球藻+發(fā)酵廢液固型物的G組輪蟲密度最高，為211 ind./mL，微擬球藻+裂殖壺藻混合投喂的E組次之，為169 ind./mL，除B組外其余各組輪蟲密度均有增長(圖1)。除B組和僅投喂裂殖壺藻的C組外，其余各組輪蟲的日增長量均在第4天時(shí)達(dá)到峰值，其中G組最高，為65 ind./mL(圖2)。

2.2 投喂不同餌料對水質(zhì)的影響

從圖3可見：試驗(yàn)開始前2天,各組總氨氮濃度升高速度較快，之后由于進(jìn)行換水操作，其趨勢發(fā)生變化；至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，B、D和G組上升明顯，其中，僅投喂發(fā)酵廢液的B組氨氮濃度上升最快，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到最高值(13.81 mg/L)；而C、E和F組氨氮濃度均呈現(xiàn)先上升后下降的波動(dòng)趨勢。

表1 不同餌料對輪蟲種群密度的影響
Tab.1 Effects of different diets on the population density of rotifer

組別group餌料diet 輪蟲抱卵率/% carrying egg rate of rotifer Brachionus plicatilis0 d1 d4 d7 d日均增長量/(ind.·mL-1·d-1)average daily production日均增長率/(%·d-1)average daily growth rate增長倍數(shù)multipleANannochloropsis sp.37.1±1.5a41.3±3.2ab61.4±2.3bc28.5±1.3b8.4±0.8c19.6±1.2c4.0±0.4dBfermentation waste37.1±1.5a33.3±1.3c17.8±1.1e1.3±0.7c-1.3±0.4d-9.2±5.3e0.6±0.1eCSchizochytrium sp. 37.1±1.5a38.4±1.5bc32.2±2.2d11.9±1.5c1.0±0.3d4.2±1.4d1.4±0.3eDNannochloropsis sp. + fermentation waste37.1±1.5a41.7±2.1ab52.8±2.1c58.1±3.9a16.7±2.0b27.5±1.3ab6.9±0.2cENannochloropsis sp. +Schizochytrium sp.37.1±1.5a44.6±3.8ab77.5±7.4a57.8±7.4a21.3±5.8ab30.4±1.6ab8.5±0.5bFNannochloropsis sp. +fermentation waste and Schizochytrium sp.37.1±1.5a42.4±5.6ab55.3±4.5c59.2±7.1a14.0±5.5bc25.3±1.6bc5.9±0.3cGNannochloropsis sp. mixed+solid fermentation waste37.1±1.5a46.7±4.1a68.2±6.9ab69.4±7.1a27.3±4.6a33.5±2.6a10.6±1.4a

注：同列中標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)

Note：The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter within the same column are not significant differences

從圖4可見：試驗(yàn)期間，A、B、D和G組水體的亞硝酸鹽含量隨培養(yǎng)時(shí)間延長均有升高，其中D組最為顯著，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到最高值0.43 mg/L；除D、G組外，其余各組的亞硝酸鹽隨培養(yǎng)時(shí)間的延長均呈先升后降趨勢，C、E、F組于試驗(yàn)后期趨近于0。

從圖5可見：試驗(yàn)期間，A、B、D、G組水體硝酸鹽含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長上升明顯，尤其D、G組明顯高于其他組，其中D組在第6天時(shí)出現(xiàn)最高值，為10.81 mg/L；而C、E、F組呈現(xiàn)波動(dòng)變化趨勢，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)硝酸鹽含量無明顯升高。

從圖6可見，試驗(yàn)期間，除C組外，其余各組pH隨培養(yǎng)時(shí)間的延長均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢，尤其以B組和D組最為明顯，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別降至7.13、7.17。

3 討論

3.1 投喂不同餌料對水質(zhì)及輪蟲密度的影響

關(guān)于水質(zhì)對輪蟲生長與繁殖影響的研究較多，氨氮、pH等均為主要因素[15-16]。本試驗(yàn)中，投喂不同餌料的各組輪蟲其最終種群密度差異較大，其中，以微擬球藻+發(fā)酵廢液固型物混合投喂的G組輪蟲全程抱卵率及最終密度均為最高，而僅投喂發(fā)酵廢液的B組輪蟲全程的抱卵率及最終密度均為最低。對比各組水體的氨氮變化可見，B組水體氨氮濃度在所有試驗(yàn)組中上升最快，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)氨氮濃度也最高。根據(jù)鄧平等[17]報(bào)道，褶皺臂尾輪蟲對氨氮耐受范圍為6～10 mg/L，生活環(huán)境中的非離子氨不超過1 mg/L。而本試驗(yàn)中所用發(fā)酵廢液中氨氮含量為129 mg/L，投喂輪蟲后第1天，水體氨氮濃度便達(dá)到6 mg/L，第4天時(shí)超過12 mg/L，這應(yīng)是B組輪蟲抱卵率及種群密度最低的主要原因。此外，從投喂發(fā)酵廢液的B組、微擬球藻+發(fā)酵廢液混合的D組、微擬球藻+發(fā)酵廢液固型物混合的G組輪蟲密度及水質(zhì)指標(biāo)對比也可以看出，發(fā)酵廢液中菌體等固型廢物在水中會(huì)繼續(xù)分解，表現(xiàn)為氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽升高，pH下降。研究表明，低pH對輪蟲的生長與繁殖均有不利影響[18-19]。另外，pH和氨氮的交互作用也可能是造成輪蟲密度減少的原因[20]。不同餌料自身特性及其水環(huán)境中微生物的差異應(yīng)是導(dǎo)致所測水質(zhì)指標(biāo)不同的原因。環(huán)境條件一致時(shí)，投喂不同餌料是否會(huì)產(chǎn)生特異的菌群，進(jìn)而影響水質(zhì)及輪蟲的生長則有待深入研究。

本試驗(yàn)中以微擬球藻+發(fā)酵廢液固型物混合投喂的G組在投喂前將發(fā)酵廢液離心，去上清液，再將固型物重新分散，如此處理后明顯改善了水質(zhì)，該組輪蟲生長也優(yōu)于其他各組?？紤]到各組水質(zhì)會(huì)因投喂及輪蟲自身代謝導(dǎo)致惡化過快，本試驗(yàn)中于第2天開始對各組進(jìn)行換水操作，一定程度上改善了水質(zhì)。但從G組氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽等指標(biāo)能夠明顯看出，隨著輪蟲繁殖，密度的增加，水質(zhì)也會(huì)逐漸變差。這說明在輪蟲培養(yǎng)過程中，其自身代謝與餌料對水質(zhì)污染具有疊加和累積效應(yīng)。因此，培養(yǎng)輪蟲時(shí)，水質(zhì)管理及調(diào)控操作的核心是找到餌料投入、輪蟲數(shù)量及采收或換水時(shí)間間的平衡關(guān)系，使投入產(chǎn)出達(dá)到理想水平。

3.2 餌料營養(yǎng)對輪蟲密度的影響

研究表明，餌料的單一會(huì)直接影響輪蟲的增殖[21]。周立斌等[22]報(bào)道，以酵母+微擬球藻混合投喂輪蟲，7 d后輪蟲密度可由30 ind./mL增長至155 ind./mL，單獨(dú)投喂酵母組次之，而二者均優(yōu)于投喂微擬球藻組。另有研究發(fā)現(xiàn)，僅以酵母投喂輪蟲時(shí)，其種群密度過早進(jìn)入平臺(tái)期，之后較難再增長，表現(xiàn)出營養(yǎng)缺乏的現(xiàn)象[23]。Hirayama等[24]以淡水小球藻Chlorellavulgaris(k-22)添加維生素 B12培養(yǎng)輪蟲，效果明顯優(yōu)于不添加的對照組，表明維生素等微量元素可能是投喂單一餌料時(shí)的營養(yǎng)限制因子。本試驗(yàn)中，分別投喂微擬球藻與裂殖壺藻、發(fā)酵廢液、發(fā)酵廢液固型物的E、F、G組輪蟲密度增長要高于單一餌料投喂的各組，表明餌料多樣化有利于輪蟲繁殖。僅投喂微擬球藻的A組輪蟲密度呈先升后降趨勢，而所監(jiān)測的水質(zhì)指標(biāo)相對較好，排除不良水質(zhì)的影響，可看出其應(yīng)存在營養(yǎng)不足的問題。值得注意的是，A組輪蟲的抱卵率在第4天時(shí)也處于較高水平，隨后密度下降，表明微擬球藻的營養(yǎng)可以維持輪蟲存活及繁殖，但可能影響其卵與幼體的質(zhì)量，導(dǎo)致幼體發(fā)育受阻或抗逆性差，以及最終成活率下降。

裂殖壺藻富含二十二碳六烯酸(DHA)，也是輪蟲培養(yǎng)過程中常用的營養(yǎng)強(qiáng)化餌料[25]。宋曉金等[26]以80 mg/L的裂殖壺藻干粉強(qiáng)化褶皺臂尾輪蟲12 h，結(jié)果表明，輪蟲體內(nèi)DHA/FA值為13.4%，干燥輪蟲粉中DHA含量比只投喂綠球藻的對照組高出132%，且輪蟲密度也明顯增加。本試驗(yàn)中，單獨(dú)投喂裂殖壺藻的C組輪蟲抱卵量及最終密度均處于較低水平，與上述報(bào)道不一致，推測原因可能是兩項(xiàng)研究所用餌料性狀(前者為凍干粉，本試驗(yàn)為冷凍藻液)及培養(yǎng)時(shí)長(前者12 h，本試驗(yàn)7 d)不同。與A組結(jié)果類似，僅投喂裂殖壺藻其營養(yǎng)不足的問題有可能會(huì)隨著時(shí)間累積，最終表現(xiàn)出輪蟲密度降低。除此之外，臂尾輪蟲攝食粒徑上限應(yīng)在10 μm以內(nèi)，適合粒徑為4.5 μm[27]。本試驗(yàn)中所用裂殖壺藻的粒徑多在10 μm以上，而微擬球藻多在5 μm以內(nèi)，兩種餌料粒徑不同也會(huì)影響輪蟲的攝食，表現(xiàn)為種群密度的差異。本試驗(yàn)表明，單一的微藻餌料很難滿足輪蟲的高密度培養(yǎng)，這與已有的報(bào)道相一致[21-23]，表明輪蟲培養(yǎng)過程中餌料多樣化及組合投喂的重要性。

3.3 發(fā)酵廢液用于輪蟲規(guī)?；囵B(yǎng)的可行性

褶皺臂尾輪蟲是多數(shù)海水蝦蟹類和魚類育苗優(yōu)質(zhì)而不可或缺的生物餌料。小球藻、微擬球藻等微藻含有較豐富的蛋白質(zhì)、脂肪，尤其是二十二碳五烯酸(EPA)等不飽和脂肪酸含量較高，加之其大小合適，培養(yǎng)技術(shù)相對成熟，對水質(zhì)污染少，已被廣泛應(yīng)用于輪蟲培養(yǎng)[7-8]。實(shí)際生產(chǎn)中必須考慮到大量培養(yǎng)微藻的成本因素，一般少有全程使用微藻培養(yǎng)輪蟲，而其多用于投喂前的營養(yǎng)強(qiáng)化。中華絨螯蟹等種類的池塘生態(tài)育苗需要大量的輪蟲，通常要用多于育苗池塘面積幾倍的室外土池塘定向培養(yǎng)微擬球藻，即便如此，藻類仍較難滿足需求，輪蟲產(chǎn)量仍然是限制蟹苗產(chǎn)量的最主要因素。為了保證輪蟲產(chǎn)量，生產(chǎn)中通常使用發(fā)酵雞糞，其分解的有機(jī)物能直接被輪蟲利用，另一方面雞糞也能作為肥料促進(jìn)藻類及微生物的生長，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為輪蟲的食物。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，從營養(yǎng)角度分析，發(fā)酵雞糞增加了餌料的多樣性，對輪蟲生長及其自身營養(yǎng)組成有益。但使用未經(jīng)處理或處理方法不當(dāng)?shù)募S肥有可能引入病原生物，給輪蟲培養(yǎng)及后續(xù)苗種生產(chǎn)造成了生物安全隱患，尤其糞肥中時(shí)有抗生素、重金屬等有害物質(zhì)，致使水產(chǎn)品中有害物殘留風(fēng)險(xiǎn)增加[28]。因此，尋找培養(yǎng)輪蟲的適合餌料對產(chǎn)業(yè)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本試驗(yàn)中對維生素C生產(chǎn)過程產(chǎn)生的發(fā)酵廢液及其與不同餌料組合投喂褶皺臂尾輪蟲的效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，認(rèn)為該發(fā)酵廢液具有較好的營養(yǎng)價(jià)值，但在室溫下易污染、分解，性狀不穩(wěn)定，對水質(zhì)產(chǎn)生較大影響，不應(yīng)直接施用。建議將發(fā)酵廢液進(jìn)行固液分離，其中，固型物可配合微藻投喂輪蟲，液相部分可作為液體肥料培養(yǎng)藻類，以藻養(yǎng)蟲。然而，因藥廠生產(chǎn)條件各異，發(fā)酵廢液性狀多樣，現(xiàn)階段也無標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)運(yùn)的方法，這些均可能影響其使用效果。另外，在使用過程中，發(fā)酵廢液與微藻等其他餌料的配比對輪蟲生長、繁殖及營養(yǎng)組成的影響，以及發(fā)酵廢液是否能進(jìn)行進(jìn)一步的發(fā)酵后使用，均有待深入研究。

總之，將此發(fā)酵廢液用于水產(chǎn)生物餌料培養(yǎng)是一舉多得且可行的方案，但其中仍然有大量的研究工作需要開展。