張瑩，齊鑫，王孝杰，李鍵爽，呂里康，姚一甲，溫海深

(中國海洋大學(xué) 海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

許氏平鲉Sebastesschlegelii隸屬于硬骨魚綱Osteichthyes鲉形目Scorpaeniformes平鲉科Sebastidae平鲉屬Sebastes，原名黑鲪，俗稱黑頭、黑寨魚、黑石鱸等，是一種近海巖礁底棲魚類。主要分布在中國渤、黃海和東海海域，以及朝鮮半島東西兩岸、日本北海道周邊海域和鄂霍次克海南部水域[1]。因其肉質(zhì)鮮美，現(xiàn)已成為中國北方沿海網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟魚類之一。許氏平鲉為體內(nèi)受精的卵胎生魚類。雄性性成熟后，11月份左右與雌魚交尾，精子貯存在雌魚體內(nèi)，待次年4月卵細(xì)胞成熟時完成受精。鑒于許氏平鲉卵胎生的繁殖生物學(xué)特性，其成熟精子在雌性許氏平鲉體內(nèi)貯存時間約為5個月[2-3]。因此，了解其精子形態(tài)及其生物學(xué)特性，可為闡明卵胎生許氏平鲉體內(nèi)受精過程及探究精子在雌魚體內(nèi)貯存位置提供理論基礎(chǔ)。

目前，學(xué)界已有一些關(guān)于卵生魚類精子超低溫冷凍的相關(guān)報道，精子經(jīng)過超低溫液氮(-196 ℃)保存，代謝停滯，生命活動靜止，能夠保證其形態(tài)學(xué)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整性，在此情況下可保存數(shù)年之久，在一定條件下激活，與卵子進(jìn)行正常受精[4]。目前，該技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖及種質(zhì)資源保護中發(fā)揮了重要作用，并主要在卵生經(jīng)濟魚類中研究與應(yīng)用較多，包括青、草、鰱、鳙[5]“四大家魚”，以及興國紅鯉[6]、西伯利亞鱘Acipenserbaerii、美洲鰣Alosasapidissima、暗紋東方鲀Takifuguobscurus[7]、點帶石斑魚Epinephelusmalabaricus[8]等。然而超低溫冷凍也會對精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大損傷，影響精子的激活率和受精能力，如“四大家魚”精子經(jīng)冷凍后部分細(xì)胞膜受損，激活后受精率大幅下降[5]，大黃魚多數(shù)精子的質(zhì)膜出現(xiàn)膨脹，核膜破裂，染色質(zhì)松散，線粒體嵴減少，使精子失去受精能力[9]。

許氏平鲉作為體內(nèi)受精的卵胎生魚類，雌魚體內(nèi)通常會貯存多尾雄魚精子，以保證物種多樣性。這一現(xiàn)象在魚類育種中對保持優(yōu)良種質(zhì)具有較大影響，此外，雌雄魚性腺成熟不同步，精液超低溫冷凍技術(shù)將有助于許氏平鲉的人工受精及種質(zhì)保存。因此，探究超低溫冷凍對許氏平鲉精子超微結(jié)構(gòu)的影響，研究其限制激活率和受精率的因素，有利于超低溫冷凍技術(shù)的改進(jìn)。本研究中通過掃描電鏡和透射電鏡觀察，對精子變態(tài)過程、形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)描述，并配制有效的精液稀釋液和保護液，按比例混合后冷凍保存精液，觀察冷凍后精子的超微結(jié)構(gòu)，旨在為許氏平鲉繁殖生物學(xué)、品種改良及資源增殖等提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用許氏平鲉取自山東蓬萊人工養(yǎng)殖群體，選取3齡性成熟雄魚9尾，體質(zhì)量為500～750 g。采樣前，將試驗魚暫養(yǎng)在體積為0.5 m3圓柱形塑料桶(直徑80 cm,高100 cm)中，暫養(yǎng)期間每天換水兩次，停止投喂，連續(xù)充氣，水溫為(18±4)℃，pH 為7.8～8.1，溶氧為(7.5±0.59)mg/L，光照模擬自然光周期14L∶10D。

1.2 方法

1.2.1 精子石蠟組織切片、H.E染色 使用MS-222(200 mg/L)將試驗魚麻醉，解剖取出精巢，使用4%中性多聚甲醛(4% PFA，溶于1×PBS，pH 7.4)浸泡12 h固定。經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，用切片機(LEICA-RM 201，Germany)連續(xù)切片，切片厚度為4～5 μm，40～42 ℃溫水展片，37 ℃下烘箱烘干。烘干后對切片脫蠟復(fù)水，用Lillie-Mayer蘇木精-醇溶伊紅Y染色(H.E染色)，中性樹脂封片、晾干，置顯微鏡(Olympus,Japan)下觀察并拍照。

1.2.2 精子采集固定、涂片制作及電鏡樣品制備

許氏平鲉為體內(nèi)受精魚類，即使雄魚性成熟時精液量也極少(約100 μL/尾)，難以通過擠壓腹部的方法獲得精液。采用解剖法從輸精管中獲取精液，用牙簽蘸取少量精液在載玻片上涂勻后鏡檢；用堿性PBS(0.01 mol/L，pH 7.8)稀釋后再次鏡檢觀察，可觀察到激活后的精子形態(tài)及運動狀態(tài)。

取10 μL新鮮精液于1.5 mL離心管中，加入1 mL 1×PBS充分洗滌，離心(300g，10 min)沉淀精子，棄上清；同樣方法再洗滌一次，棄去上清后加入1 mL 4% PFA，固定20 min，將帶有精子的固定液上下顛倒混勻，吸取一滴平涂于氨基防脫載玻片上吸附30 s，用蒸餾水沖去多余固定液，使用鐵蘇木精-0.5% 醇溶伊紅(I.H.E)染精核、線粒體鞘、染細(xì)胞質(zhì)和精子尾部。

同樣的方法洗滌鮮精，棄上清后，于2.5% 戊二醛(1×PBS，pH 7.4)中混勻，固定24 h，使用0.1 mol/L的磷酸緩沖液和蒸餾水分別沖洗3次，經(jīng)梯度酒精脫水、醋酸異戊酯置換及在CO2臨界點干燥儀中干燥后用掃描電鏡(JSM-840)觀察并拍照；另取10 μL鮮精，固定于2.5% 戊二醛12 h，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗，1%鋨酸固定2 h，再經(jīng)0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗兩次，梯度酒精脫水、包埋、切片，隨后用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，置于透射電鏡(H-7000)下觀察并拍照。

1.2.3 精子超低溫冷凍 在1 L蒸餾水中加入氯化鈉3.775 g、葡萄糖10 g、牛血清白蛋白10 g、土霉素5 g，滲透壓300 mOsmol/kg，pH 7.7，配制精液稀釋液，將其與冷凍保護液(在精液稀釋液中加入10%的二甲基亞砜DMSO)混合，取精液加入混合液中，按1∶20～1∶25(精液與混合液的體積比)混勻，取5 μL精液加入到100 μL混合液中，4 ℃下平衡20 min后置于液氮面上方10 cm，平衡12 min，液氮面平衡6 min，投入液氮(-196 ℃)中冷凍保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 精子變態(tài)過程

精子變態(tài)過程的觀察見圖1、圖2。光鏡下可見由精細(xì)胞向精子變態(tài)過程中，精細(xì)胞核首先轉(zhuǎn)化為半月形(圖1-B)，隨后轉(zhuǎn)化為月牙狀(圖1-E)，成熟精子精核由彎變直，尾部鞭毛逐漸形成，含有成熟精子的精小囊，即將向小葉腔釋放精子(圖1-F)。透射電鏡下可見正在變態(tài)的精子精核呈月牙形，細(xì)胞質(zhì)濃縮，成熟精子精核曲度減少，由月牙形轉(zhuǎn)變?yōu)橹钡拈L片狀(圖2-F)；精子發(fā)生過程中，細(xì)胞核的核質(zhì)高度濃縮，由最初的顆粒狀濃縮為粗纖維狀，最后形成短粗纖維狀的致密結(jié)構(gòu)；部分遠(yuǎn)端中心粒形成鞭毛的基體，與精子頭部植入窩連接并向后形成軸絲，逐漸延伸，形成鞭毛(圖2-D)。在鞭毛發(fā)生過程中，線粒體首先圍繞在細(xì)胞核周圍，隨后向鞭毛基部遷移，最終有規(guī)律地排列在鞭毛基部周圍。成熟精子細(xì)胞質(zhì)極少，精子頭部無頂體，頭部幾乎全部被精核占據(jù)(圖2-F)。

2.2 許氏平鲉精子形態(tài)及精子超微結(jié)構(gòu)

許氏平鲉精液呈乳白色黏稠膏狀半流體，用pH為7.8的弱堿性PBS可有效激活許氏平鲉的精子，稀釋后光鏡下可觀察到精子劇烈運動(圖3-A)。精子經(jīng)H.E染色后，精核呈藍(lán)色，線粒體鞘和鞭毛呈淺粉紅色(圖3-B)；經(jīng)I.H.E染色后，清晰可見精核呈藍(lán)黑色，線粒體鞘呈深黑色，尾部呈淺黑色(圖3-C)?？梢?用鐵蘇木精比常規(guī)的鋁蘇木精具有更強的染色效果。

電鏡下可觀察到精子頭部為長片狀，正面觀為長橢圓形，側(cè)面觀為薄片狀。精子頭部長為(3.93±0.24)μm，尾部長為(23.02±0.57)μm，全長為(28.51±0.91)μm。精子線粒體鞘突出(圖3-F)，在核的后端可見一明顯的植入窩，與尾部基部嵌合且為不對稱嵌套形成袖套腔，在袖套腔內(nèi)分布著12～15個線粒體和一些囊泡化的細(xì)胞器，在透射電鏡下觀察精子核為黑色，染色質(zhì)致密，鞭毛基部可見基體(中心粒的衍化產(chǎn)物)。精子尾部(鞭毛)橫切可見經(jīng)典的“9+2”結(jié)構(gòu)，即由2條中心軸絲和外圍較粗的9條二聯(lián)體微管構(gòu)成，且細(xì)胞膜包圍維管束，并形成左右兩個側(cè)鰭(圖3-I)。

2.3 冷凍精子超微結(jié)構(gòu)變化

許氏平鲉精子冷凍后，少部分形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)正常，但多數(shù)出現(xiàn)尾部斷裂現(xiàn)象(圖4-B)，經(jīng)電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)大部分精子細(xì)胞膜受損，質(zhì)膜出現(xiàn)膨脹，不能與細(xì)胞核緊密接觸，部分精子頭部細(xì)胞核裸露且核內(nèi)染色質(zhì)松散；線粒體鞘劈裂或膨脹，少數(shù)線粒體丟失，內(nèi)膜嵴減少或消失，線粒體呈空泡狀，基體中軸絲分布混亂，失去鮮精基體中軸絲清晰可見的“9+2”結(jié)構(gòu)(圖4-C、D、E)；鞭毛的側(cè)鰭出現(xiàn)彎曲(圖4-F)，由此推測，多數(shù)冷凍精子激活后受精能力減弱或失去受精能力。

3 討論

3.1 許氏平鲉鮮精形態(tài)結(jié)構(gòu)

精子的超微結(jié)構(gòu)是檢驗精子質(zhì)量好壞、揭示精子入卵機制的重要依據(jù)。在許氏平鲉精子的超微結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，其頭部不具有頂體結(jié)構(gòu)，與其他硬骨魚類結(jié)論一致[10]。這是由于硬骨魚類的卵細(xì)胞具有獨特的受精孔，不需要通過頂體反應(yīng)防止多精入卵。許氏平鲉精子頭部呈長片狀，線粒體集中在基體周圍，形成精子的中段部分，線粒體鞘中含有12～15個線粒體。線粒體為精子尾部的運動提供能量，許氏平鲉作為卵胎生魚類，精子需進(jìn)入雌魚生殖道內(nèi)約一個月時間才能夠受精，其頭部細(xì)長，線粒體數(shù)量遠(yuǎn)高于卵生硬骨魚類，這可能是為滿足精子在輸卵管中運動及需要較長時間貯存所消耗的能量進(jìn)化而來。卵生硬骨魚的精子頭部通常為球形或接近卵圓型，如香魚Plecoglossusaltivelis和大瀧六線魚Hexagrammosotakii頭部呈子彈形或鈍頂錐形，含線粒體1～2個[11-12]，在黑鯛Sparusmacrocephalus中，線粒體鞘內(nèi)線粒體呈分層分布，共包含6～8個線粒體[13]，同為鲉形目的卵生魚花彩圓鱗鲉Parascorpaenapicta、花斑短鰭蓑鲉Dendrochiruszebra、毒鲉Synanceiahorrida精子頭部均為球形，線粒體數(shù)少于10個[14]；而卵胎生的孔雀魚Poeciliareticulata和褐菖鲉Sebastiscusmarmoratus的精子頭部細(xì)長，線粒體多達(dá)30～40個[15-16]。另外，許氏平鲉的精子尾部與孔雀魚相似[15]，存在翅膀狀的側(cè)鰭結(jié)構(gòu)，而在其他卵生硬骨魚類如黃顙魚Pelteobagrusfulvidraco[17]、四川華鳊魚Sinibramataeniatus[18]中也存在類似結(jié)構(gòu)，但泥鰍Misgurnusanguillicaudatus[19]、斑點叉尾鮰Ictaluruspunctatus[20]的精子尾部未見此結(jié)構(gòu)，該側(cè)鰭的功能還需要進(jìn)一步探究。

3.2 許氏平鲉凍精超微結(jié)構(gòu)

本試驗中配制適宜冷凍劑將精子凍存，冷凍后的精子經(jīng)電鏡觀察，雖有部分形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，但多數(shù)結(jié)構(gòu)受損。人類精子冷凍保存結(jié)果表明，其頂體的完整率與正常精子相比顯著下降且精子頭部出現(xiàn)破損，導(dǎo)致精子的受精率降低[21]。小鼠精子冷凍保存后，質(zhì)膜受損，采用流式細(xì)胞儀對其DNA和染色體完整性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DNA斷裂現(xiàn)象且體外受精率下降[22]。在硬骨魚類中，精子冷凍技術(shù)在人工授精、遺傳育種中具有廣泛的應(yīng)用前景，但凍精同樣出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)受損現(xiàn)象，限制激活率和受精率。虹鱒Oncorhynchusmykiss的精子經(jīng)冷凍保存后，質(zhì)膜受損，線粒體腫脹，具有完整膜和功能性線粒體的精子僅占18%[23]。帕達(dá)絢鯰Ompokpabda的精子經(jīng)冷凍后受精率和孵化率與鮮精相比出現(xiàn)顯著下降[24]。在鯉科魚類中，陳松林等[5]報道，冷凍精子受精率不足70%，且與冷凍前鮮精活性息息相關(guān)，冷凍處理使精子細(xì)胞膜大幅受損，凍精的數(shù)量為鮮精數(shù)量的10倍以上才能達(dá)到一致的受精效果。精子結(jié)構(gòu)的損傷可能是由于在持續(xù)降溫過程中形成細(xì)小冰晶或冷凍劑的滲透壓所致。許氏平鲉作為卵胎生魚類，精子在雌魚體內(nèi)貯存時間長，激活后需要更多的能量維持精子運動，因此，結(jié)構(gòu)的完整及能量的提供對雌魚成功受精尤為重要，在未來應(yīng)用中，需加大凍精數(shù)量以保證受精效果。此外，本試驗中采用三步冷凍法保存許氏平鲉精子，可能導(dǎo)致形成較多的冰晶并對精子結(jié)構(gòu)造成損傷，F(xiàn)lores等[25]提出，與溫度持續(xù)降低冷凍方法相比，精子活力在快速冷凍下大幅度下降，因此,本試驗中若采用程序化降溫法或優(yōu)化冷凍精液配方等都可能會提高精子活力。