鄭寧澤?陶亮?王琴

【摘要】目的 體外檢測黃芩素對順鉑抑制卵巢癌A2780細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制。方法 選擇對數(shù)生長期A2780細(xì)胞，采用CCK-8法分別檢測黃芩素對A2780細(xì)胞的毒性、有黃芩素和無黃芩素作用下順鉑對A2780細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）差異、在細(xì)胞縫隙連接（GJ）通道功能抑制劑18-α-甘草次酸（18-α-GA）的作用下順鉑對A2780細(xì)胞抑制率的變化以及增加黃芩素對順鉑作用的影響，使用細(xì)胞接種熒光示蹤法檢測黃芩素對A2780細(xì)胞GJ通道功能的影響。利用GEO公共數(shù)據(jù)庫，比較卵巢正常上皮組織和卵巢癌上皮組織中編碼Cx43的GJA1基因表達(dá)的差異。利用蛋白免疫印跡法檢測黃芩素對A2780細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)的影響。利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測黃芩素的靶蛋白，并構(gòu)建靶蛋白與GJ通道的互作網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果 當(dāng)黃芩素≤10.00 μmol/L，其對A2780細(xì)胞無明顯毒性。與單用順鉑比較，10.00 μmol/L

黃芩素可增加順鉑對A2780細(xì)胞的抑制率（P < 0.01）。GEO公共數(shù)據(jù)庫分析顯示，卵巢癌上皮組織中GJA1 mRNA的表達(dá)水平低于卵巢正常上皮組織（P < 0.01）;黃芩素可上調(diào)A2780細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)量（P < 0.01）。18-α-GA可降低順鉑對A2780細(xì)胞的抑制率，并且能逆轉(zhuǎn)黃芩素對順鉑增敏作用（P均< 0.01）。Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫分析顯示，黃芩素直接靶向于GJ通道中的4個(gè)蛋白。結(jié)論 黃芩素能增強(qiáng)順鉑對卵巢癌A2780細(xì)胞的毒性，其機(jī)制可能與增強(qiáng)A2780細(xì)胞的GJ通道功能有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】黃芩素;卵巢癌;順鉑;細(xì)胞縫隙連接

Effect of baicalein on the inhibitory role of cisplatin on the proliferation of ovarian cancer A2780 cells Zheng Ningze， Tao Liang， Wang Qin. Department of Pharmacology， Zhongshan School of Medicine， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China

Corresponding author， Wang Qin， E-mail： Wangqin6@ sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To evaluate the effect and mechanism of baicalein on the inhibitory role of cicplatin on the proliferation of ovarian cancer A2780 cells. Methods The A2780 cells in the logarithmic growth phase were selected. The cytotoxicity of baicalein on the ovarian cancer A2780 cells was assessed by CCK-8 assay. The difference of IC50 of cisplatin in the A2780 cells treated with and without baicalein was statistically compared. After the treatment with cell gap junction （GJ） pathway inhibitor 18-α-glycyrrhetinic acid （18-α-GA）， the effect of cisplatin on the inhibitory rate of A2780 cells was evaluated. The effect of baicalein treatment on the inhibitory role of cisplatin was assessed. The impact of baicalein on the function of GJ signaling pathway in the A2780 cells was evaluated by Parachute assay. Based on the GEO dataset， the expression levels of GJA1 （Cx43） genes between the normal ovarian epithelial and ovarian cancer epithelial tissues were statistically compared. The effect of baicalein on the expression of Cx43 protein in the A2780 cells was assessed by Western blot. The targeted protein of baicalein was predicted by Swiss Target Prediction database. The interaction network between the targeted proteins and GJ pathway was constructed.? Results Baicalein treatment at a dose of≤10 μmol/L provoked no obvious toxicity to the A2780 cells. Compared with cisplatin alone， baicalein treatment at a dose of 10 μmol/L could significantly increase the inhibitory rate of cisplatin on the A2780 cells （P < 0.01）. Administration of 18-α-GA could considerably lower the inhibitory rate of cisplatin on the A2780 cells and significantly reverse the sensitization effect of baicalein on cisplatin （both P < 0.01）. GEO dataset revealed that the expression level of Cx43 mRNA in the ovarian cancer epithelial tissues was significantly lower compared with that in the normal ovarian epithelial tissues （P < 0.05）. Treatment with baicalein could significantly up-regulate the expression level of Cx43 protein （P < 0.01）. Swiss Target Prediction database demonstrated that baicalein directly targeted to the four proteins in the GJ pathway. Conclusion Baicalein can increase the cytotoxicity of cisplatin upon the ovarian cancer A2780 cells， probably correlated with the enhancement of the function of GJ pathway in the A2780 cells.

【Key words】Baicalein;Ovarian cancer;Cisplatin;Gap junction

卵巢癌是常見的一種惡性腫瘤，患者病死率在婦科腫瘤中居于首位。大部分卵巢癌患者在經(jīng)過一線化學(xué)治療之后，容易出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，導(dǎo)致化學(xué)治療失敗、腫瘤復(fù)發(fā)[1-2]。其中，導(dǎo)致卵巢癌患者出現(xiàn)耐藥的原因是，鉑類藥物的使用會出現(xiàn)一系列的不良反應(yīng)，從而限制了鉑類藥物在臨床上的使用劑量[3]。因此，尋找提高一線化學(xué)治療藥物療效的方法，是延長卵巢癌患者生存期的關(guān)鍵所在。細(xì)胞縫隙連接（GJ）是連接相鄰2個(gè)細(xì)胞胞漿的一種蛋白質(zhì)通道，由接合素蛋白（Cx）組成，如Cx32、Cx37、Cx43等。大多數(shù)腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中，GJ通道功能會明顯下降;而在恢復(fù)GJ通道功能之后，腫瘤細(xì)胞的生長會受到抑制[4]。重建和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的GJ通道功能，由GJ通道介導(dǎo)的“旁觀者效應(yīng)”能夠增強(qiáng)輻射和抗腫瘤藥物對腫瘤的殺傷作用[5-6]。抑制GJ通道功能可以減弱順鉑和紫衫醇等抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性[7]。因此，GJ通道可增強(qiáng)化學(xué)治療藥物的細(xì)胞殺傷作用。既往研究表明，人卵巢癌細(xì)胞中Cx的表達(dá)和GJ通道功能是降低的[8]。因此恢復(fù)卵巢癌細(xì)胞中的GJ通道功能，對提高藥物療效具有重要意義。

黃芩素是從黃芩根部提取出來的一種單體成分，對多種腫瘤都有明顯的抑制作用，包括膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌等。其發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制多種多樣，主要包括清除自由基、抑制細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物的形成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[9-11]。目前筆者尚未查及黃芩素與卵巢癌細(xì)胞中GJ通道功能關(guān)系的相關(guān)研究。為此，本研究觀察順鉑聯(lián)合黃芩素對卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響，探討黃芩素對順鉑毒性的影響及其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、材 料

黃芩素購于中國食品藥品檢定研究院。順鉑、二甲亞砜、18α-甘草次酸（18-α-GA）、Cx抗體、微管蛋白（Tubulin）抗體購于美國Sigma-Aldrich公司。羊抗鼠二抗購于美國Jackson公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）購于日本Dojindo分子科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、活細(xì)胞染料CM-Dil和Calcein-AM購于美國Invitrogen生物試劑公司。雙抗、胰酶和胎牛血清購于美國Gibco公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

卵巢癌A2780細(xì)胞來源于美國典型培養(yǎng)物收藏中心（ATCC），置于高糖DMEM培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清和100 U/ml的雙抗），在5% CO2、37℃溫箱中培養(yǎng)。

三、細(xì)胞存活率的測定

采用CCK-8法。取對數(shù)生長期的卵巢癌A2780細(xì)胞，稀釋成5×104/ml的細(xì)胞混懸液，然后以每孔0.1 ml接種至96孔板中，每組接種3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁之后，將培養(yǎng)基去除。對于黃芩素的毒性測定，于孔板中加入含有黃芩素（濃度為0、0.01、0.10、1.00、10.00、50.00 μmol/L）

的培養(yǎng)基，分別孵育48 h和72 h;對于順鉑與黃芩素的聯(lián)合實(shí)驗(yàn)，于孔板中先加入含10.00 μmol/L黃芩素的培養(yǎng)基預(yù)孵育24 h，再與含順鉑（濃度梯度為0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、30.00、50.00、100.00 μg/ml）的培養(yǎng)基共同孵育48 h;對于回復(fù)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞先與10.00 μmol/L黃芩素預(yù)孵24 h，然后與4.00 μg/ml順鉑、25.00 μmol/L

18-α-GA和10.00 μmol/L黃芩素或其組合共同孵育48 h。吸取含藥培養(yǎng)基，加入CCK-8溶液孵育0.5 ～ 1.0 h，最后在450 nm的波長下檢測各個(gè)孔的吸光度（OD）。存活細(xì)胞比例= OD待測時(shí)點(diǎn)/OD0 h;抑制率= 1-（OD加藥孔-OD本底）/（OD對照孔-OD本底）;半數(shù)抑制濃度（IC50）使用GraphPad軟件繪制生存曲線計(jì)得。每組試驗(yàn)至少平行重復(fù)3次，最后結(jié)果取平均值。

四、細(xì)胞接種熒光示蹤法

將細(xì)胞接種至12孔板中，孵育24 h。然后加入10.00 μmol/L的黃芩素孵育48 h。在培養(yǎng)供體細(xì)胞的孔中加入染料Calcein-AM（能通過GJ通道傳遞至相鄰細(xì)胞）和CM-Dil（能滲透進(jìn)入細(xì)胞，但不能通過GJ通道傳遞），在37℃的條件下孵育30 min。將供體細(xì)胞消化下來，以500/孔接種至受體細(xì)胞所在的孔中，繼續(xù)孵育4 h。最后，利用免疫熒光顯微鏡進(jìn)行拍攝。每個(gè)供體細(xì)胞周圍含有綠色熒光的細(xì)胞的數(shù)量，即為GJ通道功能的度量。

五、蛋白免疫印跡法

取對數(shù)生長期的A2780細(xì)胞，接種至6孔板中，培養(yǎng)24 h。去除試驗(yàn)組中的培養(yǎng)基，加入含10.00 μmol/L黃芩素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。丟棄培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3遍，加入蛋白裂解液提取總蛋白。測定蛋白濃度，取20 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉，然后加入抗Cx43抗體（1∶5000）4℃孵育過夜。次日加入過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，然后顯影，最后用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行灰度分析。

六、卵巢癌相關(guān)的數(shù)據(jù)的提取和分析

為了分析Cx43 mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，在“GEO profiles”數(shù)據(jù)庫的檢索框中輸入“GJA1; ovarian cancer”。檢索結(jié)果納入標(biāo)準(zhǔn)為：①種屬為“human”;②樣本分別為正常組織和腫瘤組織;③正常卵巢組織和卵巢癌組織的臨床樣本均≥3例。

七、黃芩素的作用靶點(diǎn)與GJ通道互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在Pubchem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/）中檢索黃芩素化合物的Canonical SMILES號，并將其導(dǎo)入到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）中進(jìn)行化合物作用靶點(diǎn)的預(yù)測，一共獲得100個(gè)靶蛋白基因。在KEGG數(shù)據(jù)庫中獲取GJ通道的基因集，然后利用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。將黃芩素的靶基因集和GJ通道的互作網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，最后獲得黃芩素的作用靶點(diǎn)與GJ通道之間的關(guān)系。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行結(jié)果處理分析，正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)以表示，2組比較用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較則采用LSD-t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、黃芩素對卵巢癌A2780細(xì)胞的毒性測定

0.01 ～ 10.00 μmol/L的黃芩素對卵巢癌A2780細(xì)胞生存率無影響（P > 0.05），50.00 μmol/L的黃芩素對細(xì)胞生長有抑制作用，其存活率低于0 μmol/L（P < 0.001），見圖1。當(dāng)黃芩素濃度為10.00 μmol/L時(shí)，可認(rèn)為對細(xì)胞生長無毒性，因此選擇黃芩素10.00 μmol/L作進(jìn)一步研究。

二、有黃芩素和無黃芩素作用下順鉑對卵巢癌A2780細(xì)胞的IC50比較

單用順鉑對卵巢癌A2780細(xì)胞的IC50為7.6 μg/ml;當(dāng)10 .00 μmol/L黃芩素孵育卵巢癌A2780細(xì)胞24 h，再與順鉑和黃芩素的混合液共同處理48 h，卵巢癌A2780細(xì)胞對順鉑的反應(yīng)性增加，黃芩素+順鉑對A2780細(xì)胞的IC50下降至4.9 μg/ml，與單用順鉑的IC50比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），見圖2。

三、有黃芩素和無黃芩素作用下卵巢癌A2780細(xì)胞的GJ通道功能變化

GEO數(shù)據(jù)庫分析顯示，與正常卵巢組織相比，卵巢癌組織中的Cx43蛋白編碼基因GJA1 mRNA表達(dá)水平降低（P < 0.01），見圖3A。細(xì)胞接種熒光示蹤試驗(yàn)顯示，與無黃芩素的A2780細(xì)胞相比，經(jīng)過黃芩素作用48 h的A2780細(xì)胞GJ通道功能增強(qiáng)，見圖3B。其Cx43蛋白的表達(dá)水平也隨之升高（P < 0.01），見圖3C。

四、黃芩素通過增強(qiáng)GJ通道功能增加順鉑的細(xì)胞增殖抑制作用

25.00 μmol/L 18-α-GA和4.00 μg/ml順鉑共同處理組的A2780細(xì)胞抑制率低于單用順鉑（P < 0.01）;相比于單用順鉑處理，10.00 μmol/L黃芩素和順鉑的共同處理能夠增加順鉑對A2780細(xì)胞抑制率（P < 0.01），而18-α-GA的加入可減弱這種增敏作用（P < 0.01），見圖4。

五、黃芩素預(yù)測靶點(diǎn)與GJ通道的關(guān)系

利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫對黃芩素的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。在預(yù)測到的100個(gè)靶蛋白中，有4個(gè)蛋白存在于GJ通道中，分別是原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src、絲裂原活化蛋白激酶3? （MAPK3）、表皮生長因子受體（EGFR）和周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）。通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，可以看出黃芩素直接靶向的這4個(gè)蛋白與GJA1存在直接的相互作用關(guān)系（圖5），因此可推測黃芩素可通過作用于這4個(gè)靶蛋白，進(jìn)而影響Cx43在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)。

討論

鉑類藥物的化學(xué)治療是卵巢癌術(shù)后的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但是由于鉑類藥物毒性較大，限制了鉑類藥物單獨(dú)使用的劑量[13]。特別是對于卵巢癌復(fù)發(fā)的患者，單獨(dú)使用鉑類藥物難以達(dá)到令人滿意的效果。所以目前對于卵巢癌的治療，越來越趨向于鉑類藥物與其他藥物的聯(lián)合使用[14]。這類藥物的作用機(jī)制與鉑類藥物的作用機(jī)制不同，比如血管生成抑制劑、多聚ADP核糖聚合酶抑制劑[15-16]。藥物的聯(lián)合使用，不僅降低了鉑類藥物的毒性，還增強(qiáng)了鉑類藥物的療效。既往的研究表明，GJ作為連接相鄰細(xì)胞胞漿的蛋白質(zhì)通道，損傷的細(xì)胞所產(chǎn)生的死亡信號能夠通過該通道傳遞至相鄰未損傷的細(xì)胞中，從而介導(dǎo)了“旁觀者效應(yīng)”，使得一些抗腫瘤藥物的療效增加[17]。本研究顯示，GJ通道功能抑制劑可減弱順鉑對卵巢癌A2780細(xì)胞的抑制作用，與以往的研究結(jié)果相一致。因此，GJ通道可以作為增加抗腫瘤藥物療效的靶點(diǎn)。

黃芩素是一種黃酮類化合物，研究顯示其對多種腫瘤具有明顯的抑制作用，而且其發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制多種多樣[9， 18]。本研究也顯示，黃芩素能夠在對卵巢癌A2780細(xì)胞無毒性的濃度下，增加順鉑對其的抑制作用。另外，多項(xiàng)研究顯示黃酮類藥物具有增強(qiáng)GJ通道功能的作用，比如槲皮素能夠增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞的GJ通道功能[19]。山柰酚可上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中的GJ通道功能[20]。筆者團(tuán)隊(duì)前期的研究顯示，黃芩素能夠通過增強(qiáng)Cx32-Hela細(xì)胞的GJ通道功能，進(jìn)而增加順鉑對Hela細(xì)胞的殺傷作用[12]。本研究顯示，黃芩素同樣也能夠增強(qiáng)卵巢癌A2780細(xì)胞的GJ通道功能。結(jié)合前述研究結(jié)果，推測GJ通道參與了黃芩素發(fā)揮增敏作用的過程。進(jìn)一步的研究使用了GJ通道抑制劑18-α-GA，結(jié)果顯示18-α-GA能削弱黃芩素的增敏作用，進(jìn)一步證明了黃芩素所發(fā)揮的順鉑增效作用是通過增強(qiáng)A2780細(xì)胞的GJ通道功能實(shí)現(xiàn)。

在卵巢組織中，Cx43蛋白是組成GJ通道的主要成分，并在卵巢組織的正常發(fā)育中起到重要的作用[21]。有研究顯示，GJ通道功能在卵巢癌細(xì)胞中明顯減弱[22]。為此，本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫比較了編碼Cx43蛋白的GJA1基因在卵巢正常上皮組織和卵巢癌上皮組織中的差異。結(jié)果顯示在卵巢癌上皮組織中，Cx43的表達(dá)降低。由此推測，卵巢癌組織中Cx43表達(dá)的下調(diào)導(dǎo)致GJ通道功能減弱，并且黃芩素增強(qiáng)GJ通道功能的作用可能與Cx43有關(guān)。為了驗(yàn)證這個(gè)推測，本研究觀察了黃芩素對Cx43蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示黃芩素可上調(diào)Cx43蛋白的表達(dá)。另外，我們利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測黃芩素的作用靶點(diǎn)，并構(gòu)建黃芩素靶蛋白與GJ通道的關(guān)系。根據(jù)所得的互作網(wǎng)絡(luò)圖，可看出黃芩素直接靶向于GJ通道的4個(gè)靶蛋白，并且這4個(gè)靶蛋白與Cx43蛋白有直接的相互作用關(guān)系。

綜上所述，本研究首次證明了黃芩素可通過增強(qiáng)卵巢癌A2780細(xì)胞中的GJ通道功能，進(jìn)而增加順鉑對卵巢癌細(xì)胞的毒性。本研究結(jié)果為尋找化學(xué)治療增效、提高抗腫瘤藥物的效果以及克服腫瘤耐藥的難題提供了理論基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-12-20）

（本文編輯：林燕薇）