甘周慶?楊露?王翼潔?劉佳?陳灼林?江瀅?李敏?彭福華

【摘要】目的 分析微生物宏基因組二代測(cè)序（mNGS）在急性或亞急性腦炎或腦膜炎患者腦脊液中檢出的DNA病毒特征和臨床意義。方法 對(duì)疑診急性或亞急性腦炎或腦膜炎并接受腦脊液mNGS的病例進(jìn)行回顧性分析，按照臨床診斷分組并比較各組檢出的DNA病毒種類(lèi)、特異序列水平[每1 M序列中的比對(duì)序列數(shù)（RPM）]和傳統(tǒng)病毒病原學(xué)檢查結(jié)果。結(jié)果 160例疑診急性或亞急性腦炎或腦膜炎的病例分別有30例（18.8%）、85例（53.1%）和45例（28.1%）的臨床診斷為病毒性腦炎或腦膜炎（不能區(qū)分DNA病毒和RNA病毒）、其他感染性腦炎或腦膜炎（細(xì)菌、真菌或寄生蟲(chóng)）和非感染性腦炎或腦膜炎（免疫炎性、腫瘤等），這3組中分別有8例（26.7%）、30例（35.3%）和8例（17.8%）檢出DNA病毒。病毒性腦炎或腦膜炎組mNGS檢出的病毒均為皰疹病毒，以單純皰疹病毒1型、水痘-帶狀皰疹病毒和巨細(xì)胞病毒最常見(jiàn)，其RPM有很高的，但大部分均很低，去除RPM≥100的數(shù)據(jù)后，其平均RPM與非感染性腦膜炎組和其他感染性腦膜炎或腦膜炎組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。除了1例有傳統(tǒng)病毒病原學(xué)陽(yáng)性結(jié)果和1例有很高的RPM支持其致病性，其他均無(wú)傳統(tǒng)病毒病原學(xué)證據(jù)支持其致病性;而另外2組可以檢出多種DNA病毒，以EB病毒、細(xì)環(huán)病毒和巨細(xì)胞病毒最常見(jiàn)，尤其是其他感染性腦炎或腦膜炎組，它們的平均RPM很低，而且均無(wú)傳統(tǒng)病毒病原學(xué)證據(jù)支持其致病性。結(jié)論 急性或亞急性腦炎或腦膜炎患者的腦脊液中皰疹病毒和細(xì)環(huán)病毒等DNA病毒較為常見(jiàn)，尤其是感染性疾病中，mNGS有助于其檢出和診斷，但對(duì)于占多數(shù)的RPM較低的結(jié)果，是否有致病性及臨床意義，仍需結(jié)合臨床分析作進(jìn)一步解讀。

【關(guān)鍵詞】DNA病毒;腦炎;腦膜炎;腦脊液;宏基因組二代測(cè)序;臨床意義

Features and clinical significance of DNA viruses detected by metagenomic Next-generation Sequencing of cerebrospinal fluids in acute or subacute encephalitis or meningitis patients Gan Zhouqing， Yang Lu， Wang Yijie， Liu Jia， Chen Zhuolin， Jiang Ying， Li Min， Peng Fuhua. Department of Neurology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Peng Fuhua， E-mail： pfh93@ 163. Com

【Abstract】Objective To analyse the features and clinical significance of DNA viruses detected by metagenomic Next-generation Sequencing （mNGS） of cerebrospinal fluids （CSF） in acute or subacute encephalitis or meningitis patients.? Methods A retrospective analysis is performed on the cases of acute or subacute encephalitis or meningitis conducted mNGS （based on Illumina MiniSeq system， with reads per million mapped readers （RPM） ≥ 1 as positive for DNA viruses） of CSF， and the viral types and their RPM levels were compared among groups classified according to clinical diagnosis， a composite reference standard.? Results Among 160 cases of suspected encephalitis or meningitis， 30 cases （18.8%）， 85 cases （53.1%） and 45 cases （28.1%） were classified into viral encephalitis or meningitis （VEM） group， non-viral infectious encephalitis or meningitis （NVIEM） group and non-infectious encephalitis or meningitis （NIEM） group respectively， and DNA viruses were detected in 8 cases （26.7%）， 30 cases （35.3%） and 8 cases （17.8%） of the 3 groups respectively. The DNA viruses in VEM group are all herpesviruses， with human alpha-herpesvirus 1， human alpha-herpesvirus 3 and cytomegalovirus being the most common， and most of them with low RPM， When excluding data with RPM ≥ 100 of this group， there are no significant statical difference among 3 group （P > 0.05）. Viruses in this group all had no evidence of traditional viral etiology to support their pathogenicity， with low RPM levels as well， except for one case with positive results of traditional viral etiology and one case with really high RPM level. In contrast， Estein-Barr virus， Torque teno viruses and cytomegalovirus are most frequently seen in the other 2 groups， especially in NVIEM group， with lower RPM levels and without evidence of traditional viral etiology to support their pathogenicity for all cases.? Conclusions DNA viruses like herpesviruses and Torque teno viruses can be commonly seen in CSF of acute or subacute encephalitis or meningitis patients， especially in infectious diseases， mNGS helps with DNA viral detection in CSF， but those results with low RPM levels should be explained under clinical settings.

【Key words】DNA viruses;Encephalitis;Meningitis;Cerebrospinal fluids;

Metagenomic Next-generation Sequencing;Clinical significance

病毒感染是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）感染類(lèi)型之一，目前，仍有超過(guò)一半的CNS感染無(wú)法明確病因[1]。腦脊液微生物宏基因組二代測(cè)序（mNGS）是近年發(fā)展起來(lái)的基于基因組學(xué)的病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)，基本原理是通過(guò)對(duì)新鮮樣本（腦脊液等）進(jìn)行高通量測(cè)序獲得其所含的微生物的核酸信息，然后與已知病原體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)和分析來(lái)確定樣本所含的病原體[2-3]。目前已有一些病例報(bào)告或小樣本研究報(bào)道其有助于腦脊液中皰疹病毒（HSV）、腸道病毒和一些蟲(chóng)媒病毒等病毒的檢出，但并未系統(tǒng)討論mNGS檢出的這些DNA病毒的臨床意義，或評(píng)估其真實(shí)性[4-8]。因此，本課題組對(duì)1年內(nèi)疑診急性或亞急性腦炎或腦膜炎并進(jìn)行腦脊液mNGS（只進(jìn)行DNA提?。┑牟±M(jìn)行回顧性分析，按照臨床診斷分組，比較各組檢出的DNA病毒種類(lèi)和特異序列水平，以及探討其臨床意義。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

回顧性收集于2017年10月1日至2018年12月30日在我院住院治療的患者的臨床資料，按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，納入標(biāo)準(zhǔn)：①疑診急性或亞急性（病程< 6個(gè)月）腦炎或腦膜炎并成功接受腦脊液mNGS;②均按診療常規(guī)完成診治，并接受1 ～ 6個(gè)月的隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①資料不完整或失訪;②確診RNA病毒性腦炎或腦膜炎;③無(wú)明確臨床診斷;④處于治療后恢復(fù)期。匯總?cè)虢M患者的基線資料，將這些患者分為病毒性腦炎或腦膜炎、其他感染性腦炎或腦膜炎（細(xì)菌、真菌或寄生蟲(chóng)）和非感染性腦炎或腦膜炎（免疫炎性、腫瘤等）3組。

二、mNGS實(shí)驗(yàn)方法

取200 μl 腦脊液樣本于室溫下以5000轉(zhuǎn)/分離

心10 min，使用天根DNA提取試劑盒（TIANGEN DNA Mini kit DP316）從腦脊液上清中提取DNA并純化，同時(shí)每批測(cè)試設(shè)立一個(gè)無(wú)菌水的陰性對(duì)照（NTC），然后通過(guò)Qubit和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量，接著參照Illumina公司的文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（QIAseqTM Ultralow Input Library Kit）操作手冊(cè)進(jìn)行DNA文庫(kù)構(gòu)建。將帶有不同索引標(biāo)簽的合格DNA文庫(kù)匯集在一起，進(jìn)行擴(kuò)增和富集，然后在Illumina測(cè)序平臺(tái)（Illumina MiniSeq）進(jìn)行測(cè)序。

三、生物信息學(xué)分析和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)

測(cè)序生成的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)接頭引物、中低質(zhì)量序列和短序列（長(zhǎng)度< 50 bp）的過(guò)濾后得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，然后使用Burrows-Wheeler比對(duì)軟件與人類(lèi)參考基因組（hg19）比對(duì)來(lái)過(guò)濾掉人源序列[9]。接著把剩余的數(shù)據(jù)與自建的微生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（從NCBI網(wǎng)站ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/下載，包含了與人類(lèi)疾病相關(guān)的11 910種細(xì)菌、7103種病毒、1046種真菌和305種寄生蟲(chóng)的基因組信息）進(jìn)行比對(duì)，以得到樣本的微生物組成及相應(yīng)的種或?qū)伲ㄈ绻雌ヅ涞骄唧w物種）水平上的測(cè)序深度、覆蓋度和特異序列數(shù)，特異序列數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為每1 M序列中的比對(duì)序列數(shù)（RPM），并計(jì)算RPM比率（RPM-r），定義為RPMsample/RPMNTC（NTC未檢出時(shí)，RPMNTC = 0，RPM-r = RPMsample）。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)于DNA病毒，RPMsample≥1，且RPM-r > 5或RPMNTC = 0。測(cè)序結(jié)果通常在2 ～ 5 d內(nèi)獲得，包括檢出微生物（原核生物、真核生物和DNA病毒）及其RPMsample。

四、臨床診斷的判斷

綜合患者的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室及輔助檢查結(jié)果、治療反應(yīng)和轉(zhuǎn)歸對(duì)病例的臨床診斷進(jìn)行確認(rèn)，在隨訪結(jié)束后由2名主治醫(yī)師級(jí)別以上的醫(yī)師參考相應(yīng)指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立進(jìn)行診斷，對(duì)意見(jiàn)不統(tǒng)一的病例進(jìn)行討論后確定，其中病毒性腦炎或腦膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)參考既往研究[10]。對(duì)臨床診斷的可靠性劃分為4個(gè)水平：①確定的，有除mNGS外的病原學(xué)、血清學(xué)或病理等公認(rèn)的確診證據(jù);②很可能的，臨床表現(xiàn)符合相應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，特異性治療有效，并排除一些相似的疾病，但無(wú)確診依據(jù);③可能的，部分臨床表現(xiàn)符合相應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，特異性治療有效或無(wú)效，無(wú)確診依據(jù);④無(wú)法判斷（這些病例被排除）。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。比較3組的臨床特征、檢出的DNA病毒種類(lèi)及其RPM水平，其中分類(lèi)變量資料使用例數(shù)（百分比）描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，連續(xù)變量使用中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）描述，多組間比較使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，α = 0.05（雙側(cè)），兩兩比較使用Bonferroni法校正檢驗(yàn)水平，α= 0.0167（雙側(cè)）。

結(jié)果

一、3組腦炎或腦膜炎患者的臨床資料

共有180例病例符合入選標(biāo)準(zhǔn)，共納入160例，分別有30例、85例和45例的臨床診斷為病毒性腦炎或腦膜炎、其他感染性腦炎或腦膜炎和非感染性腦炎或腦膜炎，見(jiàn)圖1。除了性別和mNGS同期腦脊液的紅細(xì)胞水平，其他特征在3組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05），病毒性腦炎或腦膜炎患者的年齡較小，很少使用免疫抑制劑或長(zhǎng)期服用糖皮質(zhì)激素（激素），病程短，改良Rankin量表（mRS）評(píng)分較低，但采樣前較多已經(jīng)接受阿昔洛韋或利巴韋林抗病毒治療;各組mNGS同期腦脊液的特征亦符合各自常見(jiàn)的腦脊液特征，但病毒性腦炎或腦膜炎和非感染性腦炎或腦膜炎之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.0167），提示臨床上兩者間的鑒別尤為重要[11]。

二、患者臨床診斷與mNGS結(jié)果匯總

160例入組病例分別有30例（18.8%）、85例（53.1%）和45例（28.1%）的臨床診斷為病毒性腦炎或腦膜炎[2例確診為單純皰疹病毒1型（HSV-1）性腦炎（圖1a）]、其他感染性腦炎或腦膜炎（42例有傳統(tǒng)病原學(xué)證據(jù)確診）和非感染性腦炎或腦膜炎（14例確診），無(wú)病毒與其他微生物的混合感染。這3組病例中分別有8例（26.7%）、30例（35.3%）和8例（17.8%）檢出DNA病毒。病毒性腦炎或腦膜炎組檢出的DNA病毒均為HSV，以HSV-1、HSV-3和巨細(xì)胞病毒（CMV）最常見(jiàn)，但僅1例的傳統(tǒng)病毒病原學(xué)檢查陽(yáng)性（圖1b），1例的RPM很高，考慮有致病性，其他均無(wú)傳統(tǒng)病毒病原學(xué)證據(jù)支持其致病性。其他感染性腦炎或腦膜炎組檢出的DNA病毒最常見(jiàn)的是EB病毒（EBV）、細(xì)環(huán)病毒（TTV）和CMV[三者共占93.3%（28/30）];這些病例均確診或臨床診斷為較明確的其他感染性腦炎或腦膜炎（細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)），而且僅1例HBV的同期血清病毒DNA陽(yáng)性（圖1c），支持合并慢性乙型肝炎活動(dòng)期的診斷而非HBV性腦炎，均無(wú)傳統(tǒng)病毒病原學(xué)證據(jù)支持其致病性，因此考慮為非致病性（亞臨床感染？不排除污染可能）。非感染性腦炎或腦膜炎組則檢出各種DNA病毒，除了1例HBV的同期血清病毒DNA陽(yáng)性（圖1d），均無(wú)傳統(tǒng)病毒病原學(xué)證據(jù)支持其致病性，考慮非致病性（亞臨床感染？不排除污染可能）。

三、檢出病毒的RPM

病毒性腦炎或腦膜炎組檢出的病毒RPM有很高的也有較低的;而其他感染性腦炎或腦膜炎組檢出的病毒的RPM均較低;非感染性腦炎或腦膜炎組檢出的病毒的RPM則很低（圖2）。去除病毒性腦炎或腦膜炎組RPM ≥ 100的數(shù)據(jù)后，3組檢出的病毒的RPM比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05，圖2）。

討論

腦脊液的mNGS目前已經(jīng)作為慢性或復(fù)發(fā)的腦炎或腦膜炎的一線診斷試驗(yàn)和急性腦炎或腦膜炎的二線診斷試驗(yàn)被廣泛應(yīng)用[12]。本課題組對(duì)我科1年內(nèi)疑診急性或亞急性腦炎或腦膜炎并接受腦脊液mNGS的病例進(jìn)行回顧性分析，綜合分析患者的臨床診斷、傳統(tǒng)病毒病原學(xué)檢查結(jié)果、RPM來(lái)討論其檢出的DNA病毒的特征以及臨床意義，初步評(píng)估其對(duì)DNA病毒性腦炎或腦膜炎的診斷價(jià)值。

mNGS相對(duì)于傳統(tǒng)病毒病原學(xué)檢查的一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)是一次試驗(yàn)可以同時(shí)檢測(cè)上千種病毒，甚至不需要依賴臨床預(yù)判，即檢測(cè)范圍廣，尤其是在腦脊液獲取困難、資源受限的情況下[2-3， 13]。本研究的結(jié)果顯示mNGS檢出的與臨床診斷一致的，考慮有致病性的DNA病毒主要為各型的HSV，以HSV-1、HSV-3和CMV最常見(jiàn)，這與其他研究類(lèi)似[4-8]。未發(fā)現(xiàn)其他類(lèi)型的致病性病毒可能與樣本量過(guò)小、流行病學(xué)或病例選擇（較多病例接受抗病毒治療，平均病程也偏長(zhǎng)）有關(guān)。由于未進(jìn)行RNA提取，本研究中未檢測(cè)RNA病毒，盡管理論上也是可行的[7]。

本研究中最常見(jiàn)的考慮非致病性的DNA病毒是EBV、TTV、CMV、梅克爾多元癌細(xì)胞病毒（MCPyV）和HBV，并且通常在其他感染性腦炎或腦膜炎組檢出，其平均RPM水平介于病毒性腦炎或腦膜炎組和非感染性腦炎或腦膜炎組之間。因此，帶來(lái)的疑問(wèn)是，這些在其他感染性腦炎或腦膜炎組檢出的病毒是否是混合感染，我們推測(cè)它們可能為潛伏感染、隱性感染或攜帶狀態(tài)等亞臨床感染，當(dāng)然也不排除假陽(yáng)性（污染）。首先，它們也是其他研究中常見(jiàn)的背景微生物，盡管大部分病例采樣前未接受任何抗病毒治療，以及有較長(zhǎng)的病程，它們的平均RPM仍很低，約50%的病例未達(dá)其他研究中較為公認(rèn)的RPM≥3的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)[6，8]。其次，因?yàn)镃NS感染時(shí)血腦屏障被破壞或通透性增加，這些病毒核酸也可能是來(lái)源于血液，或腦脊液中的白細(xì)胞，如在檢出HBV的患者的血清亦檢測(cè)到很高水平的HBV DNA，這種情況更傾向于考慮合并慢性乙型肝炎（活動(dòng)期），因?yàn)镠BV不在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。本研究中檢出的各種非致病性的DNA病毒均可在健康人的血液中通過(guò)mNGS檢測(cè)到，尤其是TTV、EBV和CMV[14]。超過(guò)90%的人群有EBV或CMV的淋巴細(xì)胞的潛伏感染，敗血癥等重癥患者的EBV、CMV、HSV-1和HHV-6再激活率分別達(dá)48%、18%、26%和24%[15]。既往研究也顯示，在多種非病毒性CNS感染患者甚至非感染性疾病患者的腦脊液中通過(guò)PCR發(fā)現(xiàn)低水平的DNA或RNA病毒[16-17]。再者，除了HBV，這些mNGS檢測(cè)到的DNA病毒未對(duì)診治流程產(chǎn)生影響，也因此導(dǎo)致多數(shù)病例未進(jìn)行相應(yīng)的傳統(tǒng)病毒病原學(xué)檢查。急性或亞急性腦炎或腦膜炎患者的腦脊液中HSV和TTV等DNA病毒較為常見(jiàn)，尤其是感染性疾病中，HBV的例子說(shuō)明我們?cè)谂R床工作中應(yīng)重視對(duì)這些RPM較低的結(jié)果的進(jìn)一步解讀來(lái)明確其臨床意義。

RPM反映檢測(cè)到的病毒的序列數(shù)或相對(duì)豐度（半定量），既往研究已顯示其不一定與病毒負(fù)荷成比例，也不一定反映疾病嚴(yán)重性[7]。我們的研究顯示，mNGS檢出的DNA病毒的RPM越高，其診斷意義可能越高，特別是RPM≥100時(shí)，幾乎排除了非致病性，而RPM較低（RPM < 100）時(shí)可能是非致病性的，其臨床意義需結(jié)合臨床判斷。此外，由于大部分病例未進(jìn)行嚴(yán)格的同期傳統(tǒng)病毒病原學(xué)檢查，假陽(yáng)性的情況不能評(píng)估，即使是病毒性腦炎或腦膜炎組檢出的較低RPM的病毒，也可能是非致病性的。mNGS的陽(yáng)性界限和真實(shí)性仍有待明確，本研究的結(jié)果有助于指導(dǎo)進(jìn)一步的對(duì)比研究。

總之，mNGS檢測(cè)范圍廣和無(wú)需臨床預(yù)判的優(yōu)點(diǎn)使得其檢出率可能優(yōu)于傳統(tǒng)方法，有助于腦脊液中DNA病毒的檢出和診斷，但對(duì)于占多數(shù)的RPM較低的結(jié)果，是否有致病性和臨床意義，仍需結(jié)合臨床分析和進(jìn)一步解讀。當(dāng)然，本研究為回顧性分析，存在病例選擇偏倚，未與傳統(tǒng)方法比較等不足，仍需更多研究來(lái)明確mNGS檢測(cè)DNA病毒的陽(yáng)性界限和評(píng)價(jià)真實(shí)性，以及改進(jìn)方法以檢測(cè)RNA病毒。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-12-15）

（本文編輯：洪悅民）