孫竹興，鄧奎林，劉娜，張歡雨，劉紅梅

(河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002)

細(xì)菌無(wú)處不在，感染可導(dǎo)致人類大部分的疾病和所有的傳染病.使用抗菌劑是防治細(xì)菌滋生和繁殖的有效手段.相對(duì)于小分子抗菌劑而言，高分子抗菌材料具有更強(qiáng)、更持久、更穩(wěn)定的抗菌性能，更低的毒性和環(huán)境友好[1-3].近年來(lái)高分子抗菌材料的制備以及在臨床上的應(yīng)用引起了學(xué)者廣泛關(guān)注.新型抗菌聚合物通過(guò)對(duì)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析將具有抗菌作用的單體或官能團(tuán)通過(guò)各種反應(yīng)，制備出主鏈或支鏈具有抗菌官能團(tuán)的新型聚合物[4].Sun等[5]提出了一種基于立體化學(xué)策略的冰片修飾的聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)得到P(MMA-co-BA)的抗菌共聚物，不少于10%的冰片丙烯酸酯(BA)片段可對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢桿菌(Staphylococcusaureus)產(chǎn)生獨(dú)特的抗菌活性，高達(dá)25%的BA片段可賦予該共聚物出色的抗菌性能.哌嗪對(duì)臨床上一些耐藥性菌株也非常有效，而且可以增加聚合物溶解性，改善其生物活性.Zhang等[6]通過(guò)乙二胺四乙酸二酐(EDTAD)和哌嗪(PA)的縮聚反應(yīng)得到一種抗菌哌嗪衍生物(PE-B)，抗菌測(cè)試結(jié)果表明，PE-B對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出有效的抑制活性.Hassan等[7]通過(guò)2-硝基芐基氯和哌嗪反應(yīng)合成二胺2,20-(哌嗪-1,4-二基雙(亞甲基))二苯胺，抗菌研究結(jié)果表明，該化合物對(duì)蘇云金芽孢桿菌、腐生葡萄球菌和果膠桿菌均表現(xiàn)出比妥布霉素和四環(huán)素更高的活性[7].但抗菌材料的研究不應(yīng)止于此，筆者期待有更大、更廣闊的發(fā)展.

熒光分析與成像技術(shù)具有靈敏度高、分辨率高、選擇性好、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、對(duì)生命體損傷小等優(yōu)勢(shì)，在生物化學(xué)、醫(yī)療診斷等方面得到了廣泛的研究和應(yīng)用，并可用來(lái)觀察其他技術(shù)無(wú)法觀察到的組織形態(tài)細(xì)節(jié)[8].熒光標(biāo)記物具有標(biāo)記簡(jiǎn)便、響應(yīng)時(shí)間快等優(yōu)點(diǎn)[9-10]，已經(jīng)成為探究細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的重要手段.因此，在抗菌性聚合物等生物材料的活細(xì)胞成像研究中，熒光分析與成像是不可或缺的.香豆素類熒光化合物具有發(fā)射強(qiáng)度高、色光鮮艷、熒光強(qiáng)烈等優(yōu)點(diǎn)，能較好地標(biāo)記于活細(xì)胞，成為熒光分析與成像研究中重要的熒光分子之一[11].在材料結(jié)構(gòu)上引入了香豆素類熒光基團(tuán)，使其具有標(biāo)記、監(jiān)測(cè)和示蹤的能力[12-13].筆者通過(guò)簡(jiǎn)便高效、原子經(jīng)濟(jì)的Ugi反應(yīng)一鍋法合成了含有香豆素和哌嗪獨(dú)特結(jié)構(gòu)的新型熒光標(biāo)記抗菌聚合物——聚(1，4雙-(3氨丙基)呱嗪/PB/醛/叔丁基異腈)(PC)[14].評(píng)價(jià)了PC的抗菌性能，并利用其活細(xì)胞標(biāo)記和示蹤的能力，研究了其在細(xì)菌抑制及活細(xì)胞成像上的性能.這種既具有優(yōu)異生物相容性，又具備良好抗菌性以及熒光標(biāo)記能力的新型生物材料，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[15].

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

津島RF-5301PC熒光分光光度計(jì)(日本)，津島UV-3600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本),Bruker AVANCEⅢ 600-MHz NMR波譜儀(瑞士)，ZEISS LSM 880激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)),Bioscreen C多功能微生物生長(zhǎng)自動(dòng)培養(yǎng)(芬蘭).苯甲醛，1，4雙(-3-氨丙基)哌嗪，叔丁基異腈，相對(duì)分子質(zhì)量為800的聚乙二醇，4-(二乙氨基)水楊醛，DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶，胎牛血清，ATT，所用化學(xué)品及試劑均為分析純.

1.2 聚合物的合成

1.2.1 單體聚乙二醇二丁二酸酯(PB)的合成

將相對(duì)分子質(zhì)量為800的聚乙二醇(1.600 g,2 mmol)、丁二酸酐(5.000 g,5 mmol)加入到反應(yīng)瓶中，80 ℃下攪拌反應(yīng)48 h.用乙酸乙酯溶解產(chǎn)物并在乙醚中沉淀3次，在40 ℃下真空干燥12 h 得到白色固體,合成路線如圖1所示.

圖1 PB單體的合成Fig.1 Synthesis of PB monomer

1.2.2 單體7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素的合成

1)7-N,N-二乙氨基香豆素的合成：將4-(二乙氨基)水楊醛(1.93 g，10 mmol)溶于40.0 mL乙醇中，加入丙二酸二乙酯(3.12 mL，20 mmol)和哌啶(1 mL，10 mmol).攪拌反應(yīng)混合物并加熱回流過(guò)夜，通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng).減壓除去溶劑，然后加入濃HCl(20.0 mL)和冰醋酸(20.0 mL)進(jìn)行水解并再攪拌6 h，將溶液冷卻并倒入100 mL冰水中.加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%NaOH溶液以將溶液的pH值調(diào)節(jié)至7，向溶液中加入30.0 mL二氯甲烷，用水(3×10.0 mL)洗滌有機(jī)層，用MgSO4干燥，然后真空濃縮，通過(guò)柱色譜法用乙酸乙酯-己烷(體積比1∶3)純化粗產(chǎn)物.得化合物1.

2)7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素的合成：在50 ℃下，將干燥的DMF(2.14 mL，27.79 mmol)在N2氣氛下滴加到POCl3(2.18 mL，23.16 mmol)中并攪拌30 min，得到紅色溶液.將化合物1(2.01 g，9.26 mmol，溶于10.0 mL DMF)滴加到該溶液中.將混合物在70 ℃下攪拌12 h，然后倒入100 mL冰水中.加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%NaOH溶液以將混合物的pH值調(diào)節(jié)至7.將粗產(chǎn)物用30.0 mL乙酸乙酯稀釋，有機(jī)層用水(3×10.0 mL)洗滌，用MgSO4干燥，然后真空濃縮.通過(guò)柱色譜法用乙酸乙酯-己烷(體積比1∶2)純化粗產(chǎn)物，得化合物2.合成路線如圖2所示.

1.7-N,N-二乙氨基香豆素；2.7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素.圖2 7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素的合成Fig.2 Synthesis of 7-N,N-Diethylamino-3-aldehyde counarin

1.2.3 聚合物PC的合成

將苯甲醛(0.388 g,3.6 mmol),1,4雙-(3-氨丙基)哌嗪(0.416 g,2 mmol),7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素(0.098 g,0.4 mmol)依次加入反應(yīng)瓶中,再加入4 mL甲醇.室溫下攪拌反應(yīng)0.5 h，然后加入PB(1.634 g，1 mmol)反應(yīng)0.5 h，再加入叔丁基異腈(0.338 g,4 mmol)，繼續(xù)反應(yīng)2 d后.將產(chǎn)物用截留相對(duì)分子質(zhì)量 1 000 u的透析袋透析48 h，每隔3 h換1次水，冷凍干燥，得白色粉末，即為目標(biāo)產(chǎn)物PC.合成路線如圖3所示.

圖3 聚合物PC的合成Fig.3 Synthesis of polymer PC

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

將凍存的E.coli和S.aureus在斜面上復(fù)蘇，然后傳代；取10 mL LB液體培養(yǎng)基于25 mL錐形瓶中，高溫高壓滅菌后，置于超凈臺(tái)上自然冷卻.用接種針挑取1環(huán)加入到液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，備用.

1.3.1 濾紙片法

將質(zhì)地均勻的濾紙片用打孔器制成10 mm的濾紙片，滅菌、干燥；以50 mg/mL PC作為樣本，以相同濃度氨芐青霉素溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水作為陰性對(duì)照.將樣品濾紙片和陰陽(yáng)對(duì)照分別置于LB固體培養(yǎng)基制成的平板中，間距25 mm，在37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈大小.

1.3.2 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線法

取生長(zhǎng)良好的E.coli和S.aureus用LB培養(yǎng)基調(diào)節(jié)OD600為0.1的菌懸液；然后將50 mL LB培養(yǎng)液與1 mL菌懸液混合，加入到蜂窩板上，加入PC使其終質(zhì)量濃度分別為0、1、5、10、20、50 mg/mL，每個(gè)樣設(shè)置3個(gè)平行(結(jié)果取3個(gè)數(shù)的平均數(shù))，每隔1 h測(cè)1次，測(cè)72 h.

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為Hela細(xì)胞，采購(gòu)于北京協(xié)和細(xì)胞資源中心，培養(yǎng)條件為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱.48 h換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用胰酶消化傳代.

2 結(jié)果與分析

2.1 聚合物的結(jié)構(gòu)表征

采用核磁共振氫譜、紅外光譜等手段對(duì)聚合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征.圖4是PC的紅外譜圖.3 193 cm-1處的特征峰為酰胺中N—H的伸縮振動(dòng)峰，酰胺鍵中C=O伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在1 678 cm-1處；酯鍵上C=O伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在1 733 cm-1處，飽和C—H的特征峰在2 871 cm-1處.

圖5為PC在氘代氯仿中的1H NMR核磁譜圖.化學(xué)位移δ=1.13處為7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素中的(-CH3,a)上的質(zhì)子峰，δ=1.30處為叔丁基中(CH3-，b)上的質(zhì)子峰，1.40～1.75處的化學(xué)位移歸因于1,4-雙(3-氨丙基)哌嗪中(-CH2-，c、d)上的質(zhì)子峰，化學(xué)位移δ=3.54～3.65處為(-OCH2CH2-，k、j)上的質(zhì)子峰，苯甲醛上(-CH-，r、s)的吸收峰在δ=7.20～7.35處，7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素中(-CH-，t)的吸收峰在7.70處.由FTIR與1H NMR分析表明所得產(chǎn)物為目標(biāo)聚合物，并通過(guò)GPC測(cè)得PC的摩爾質(zhì)量為2.76×104g/mol.

圖4 PC的紅外光譜Fig.4 FTIR spectrum of PC

圖5 PC的1H NMR核磁譜Fig.5 The 1H NMR spectrum of PC

2.2 抑菌性研究

2.2.1 濾紙片法測(cè)定抑菌性能

為表征PC的抑菌性能，進(jìn)行了濾紙片實(shí)驗(yàn)，PC質(zhì)量濃度為50 mg/mL，陽(yáng)性對(duì)照為相同質(zhì)量濃度的氨芐青霉素溶液，陰性對(duì)照為生理鹽水.使用E.coli和S.aureus2種細(xì)菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，PC在2種菌落上均出現(xiàn)明顯的抑菌圈，說(shuō)明PC對(duì)2種細(xì)菌的生長(zhǎng)均有抑制作用.

圖6 PC對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制性能Fig.6 Inhibitory properties of PC against E.coli and S.aureus

2.2.2 生長(zhǎng)曲線法測(cè)定抑菌作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證聚合物的抑菌性，利用細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線來(lái)檢測(cè)PC的抑菌性能，選擇了0、1、5、10、20、50 mg/mL 6個(gè)不同質(zhì)量濃度的PC溶液，分別加入到大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的孔板中，培養(yǎng)72 h后繪制2種細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線，如圖7和圖8所示.

圖7 不同質(zhì)量濃度PC下E.coli的生長(zhǎng)曲線Fig.7 Growth curve of E.coli under different concentrations of PC

圖8 不同質(zhì)量濃度PC下S.aureus的生長(zhǎng)曲線Fig.8 Growth curve of S.aureus under different concentrations of PC

2.3 聚合物的熒光性質(zhì)測(cè)定

為了研究探針的紫外可見(jiàn)吸收和熒光性質(zhì)，對(duì)其光譜性能進(jìn)行測(cè)定.將聚合物PC配成質(zhì)量濃度為1×10-2μg/mL的溶液進(jìn)行光譜測(cè)定，結(jié)果如圖9所示，PC的紫外最大吸收波長(zhǎng)λmax為405 nm，最大激發(fā)波長(zhǎng)λex為420 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)λem為492 nm.

圖9 PC的紫外吸收譜(a)和熒光光譜(b)Fig.9 UV absorption spectrum of PC(a) and fluorescence spectrum(b)

2.4 細(xì)胞相容性研究

2.4.1 MTT法結(jié)果分析

生物相容性是抑菌材料應(yīng)用于各領(lǐng)域的一個(gè)重要參數(shù)，筆者研究了不同質(zhì)量濃度和時(shí)間下PC對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并計(jì)算存活率，結(jié)果如圖10所示，只有在質(zhì)量濃度為50 μg/mL，72 h時(shí)，細(xì)胞最低生存率為86.95%，其他存活率均大于87.15%，可初步證明PC幾乎不對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性.

2.4.2 AM-PI雙染色法

為更進(jìn)一步驗(yàn)證PC的低細(xì)胞毒性，將PC(50 μg/mL)與細(xì)胞共培育24 h和72 h后，用5 μg/mL的鈣黃綠素AM和5 μg/mL碘化丙啶PI進(jìn)行染色，孵育細(xì)胞30 min后PBS洗3次，共聚焦顯微(20×)，染料AM的激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，接收波長(zhǎng)500～580 nm；染料PI的激發(fā)波長(zhǎng)561 nm，接收波長(zhǎng)580～680 nm.結(jié)果如圖11所示，可以看出，鏡下細(xì)胞絕大部分均顯示為活細(xì)胞，可知PC的細(xì)胞毒性較小，不影響細(xì)胞正常生命活動(dòng).

圖10 不同質(zhì)量濃度和時(shí)間下PC的細(xì)胞毒性Fig.10 Cytotoxicity of PC at different concentrations and times

比例尺：20 μm.圖11 24 h空白對(duì)照組明場(chǎng)(a)和AM-PI雙染色(b)，72 h空白對(duì)照組明場(chǎng)(c)和AM-PI雙染色(d)Fig.11 24 h blank control group bright field (a) and AM-PI double staining (b),72 h blank control group bright field map (c) and AM-PI double staining stain (d)

2.5 活細(xì)胞成像研究

2.5.1 PC在活細(xì)胞內(nèi)成像

為了研究PC質(zhì)量濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系，利用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像.細(xì)胞用質(zhì)量濃度為0,10,20,50 μg/mL的PC培養(yǎng)液孵育1 h后，用PBS洗滌3次，共聚焦顯微鏡成像(40×)，405 nm激發(fā)，接收波長(zhǎng)為410～515 nm.結(jié)果如圖12所示，由圖12可知，探針在細(xì)胞內(nèi)發(fā)出較明顯的熒光，且隨著探針濃度增大，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng).

比例尺：20 μm.圖12 活細(xì)胞內(nèi)聚合物PC的熒光強(qiáng)度Fig.12 Fluorescence intensity of polymer PC in living cells

2.5.2 活細(xì)胞內(nèi)PC的熒光穩(wěn)定性

為研究PC在細(xì)胞內(nèi)的熒光穩(wěn)定性，將PC(50 μg/mL)與細(xì)胞共培養(yǎng)1 h后PBS洗3次，共聚焦顯微鏡成像(63×oil)，成像方式為持續(xù)掃描15 min，如圖13所示.由圖13可知，探針熒光強(qiáng)度衰減較弱，依然具有較為強(qiáng)烈的熒光.圖14為細(xì)胞內(nèi)熒光衰減曲線，熒光強(qiáng)度在15 min內(nèi)從139降至122，證明PC在細(xì)胞內(nèi)具有良好的熒光穩(wěn)定性.

比例尺：5 μm.圖13 PC在活細(xì)胞內(nèi)的熒光穩(wěn)定性Fig.13 Fluorescence stability of PC in living cells

圖14 PC的熒光衰減曲線Fig.14 PC fluorescence decay curve

2.5.3 光漂白恢復(fù)

為了探究PC的分子流動(dòng)性，將PC(50 μg/mL)與細(xì)胞共培養(yǎng)1 h后，用PBS洗3次，共聚焦顯微鏡成像(63×oil).如圖15所示.對(duì)活細(xì)胞區(qū)域1進(jìn)行光漂白，并觀察其熒光恢復(fù)情況，使用fit formula擬合公式進(jìn)行分析，得到光漂白恢復(fù)曲線，如圖16.證明在經(jīng)過(guò)光漂白后，PC在活細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度下降，但在較短時(shí)間(以平均每分鐘熒光強(qiáng)度恢復(fù)22.89的速度)，其熒光強(qiáng)度顯著恢復(fù)，證明聚合物PC的分子在活細(xì)胞內(nèi)具有良好的流動(dòng)性.

區(qū)域1為光漂白區(qū)域，區(qū)域2為熒光對(duì)照區(qū)域,區(qū)域3為背景區(qū)域，比例尺：5 μm.圖15 不同區(qū)域的光漂白圖像Fig.15 Bleaching image of different areas area

圖16 不同區(qū)域熒光強(qiáng)度變化曲線Fig.16 Fluorescence intensity curve of different regions

2.5.4 PC在活細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)時(shí)程成像

良好的生物相容性及光穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)探針應(yīng)用的重要因素，為了進(jìn)一步探究PC對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程的影響，用PC(50 μg/mL)對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行染色，利用激光共聚焦(40×)及活細(xì)胞工作站進(jìn)行20 h的在線長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè).結(jié)果如圖17所示.從長(zhǎng)時(shí)程成像中可以看到加入PC后,細(xì)胞的生命活動(dòng)沒(méi)有受到明顯的影響，可以進(jìn)行正常的分裂和生長(zhǎng)，因此可以看出PC對(duì)Hela細(xì)胞的毒性較小，不影響其正常的生命活動(dòng)，并且從中可以看出，在20 h內(nèi)，可持續(xù)觀測(cè)到熒光，但由于時(shí)間較長(zhǎng)焦平面丟失，只有在細(xì)胞分裂時(shí)可看到明亮的熒光，未分裂細(xì)胞的熒光較為模糊.

比例尺：10 μm.圖17 PC在活細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)時(shí)程成像Fig.17 Long-term imaging of PC in living cells

3 結(jié)論

以1,4雙-(3-氨丙基)哌嗪、7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素、PB、叔丁基異腈、苯甲醛為原料，通過(guò)高效、原子經(jīng)濟(jì)性的Ugi反應(yīng)得到了新型熒光標(biāo)記哌嗪抗菌聚合物PC.通過(guò)抑菌性研究表明PC對(duì)E.coli和S.aureus的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，且對(duì)E.coli的抑制作用更明顯，可能與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)；MTT法及AM-PI雙染色法表明PC生物相容性好；通過(guò)一系列活細(xì)胞成像研究，表明了PC具有良好的熒光性能、良好的熒光穩(wěn)定性、良好的分子流動(dòng)性等特點(diǎn)，可作為性能優(yōu)異的熒光標(biāo)記物.作為新型的抗菌材料，PC不僅可廣泛用于細(xì)胞、細(xì)菌方面的研究，還可應(yīng)用于活體內(nèi)細(xì)菌的指示劑，為未來(lái)抗菌材料的研發(fā)提供了一種新思路.

致謝：感謝河北大學(xué)碩士研究生賈旭、王游游和付聰聰同學(xué)在實(shí)驗(yàn)中給予的幫助.