鄭抒，謝靜，秦劍

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶401121）

香豆素是化學(xué)式以苯并-α-吡喃酮為母核的一類化合物的總稱［1］，具有香甜氣味，可作為沐浴露、香水、精油等化妝品的增香劑［2］，但大部分香豆素類化合物在化妝品中被禁用。合成香豆素類化合物對(duì)人體毒性大，會(huì)引發(fā)肝功能損傷［3］，且天然香豆素因其光敏作用［4-6］易導(dǎo)致涂抹在皮膚上會(huì)引起皮膚紅斑、色素沉著過度等皮膚損傷，甚至皮膚癌［7］。不少國家都嚴(yán)格限制了該類化合物在化妝品中的添加和使用。德國聯(lián)邦風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究所明確要求，嬰幼兒護(hù)理產(chǎn)品中不得添加香豆素類化合物［8］。歐洲聯(lián)盟發(fā)布的26種化妝品香料過敏原名單中也有香豆素［9］。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015年版）》（以下簡稱《2015版規(guī)范》）明確規(guī)定，苯丙香豆素、六氫化香豆素等香豆素類化合物為化妝品中禁用物質(zhì)［10］。針對(duì)香豆素類化合物的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜（HPLC）法［11-12］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法［13-15］、氣相色譜法［16］、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法［17］等?！?015版規(guī)范》僅收載了6-甲基香豆素、8-甲氧基補(bǔ)骨脂素、三甲沙林、5-甲氧基補(bǔ)骨脂素、歐前胡內(nèi)酯、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃銅9種香豆素類化合物的HPLC法［9］。相較于HPLC法和CC-MS/MS法，GC-MS法具有不使用有機(jī)流動(dòng)相、定性定量準(zhǔn)確、不易殘留、試驗(yàn)方法易復(fù)制等優(yōu)點(diǎn)，特別適合易揮發(fā)化合物的檢測(cè)。但該方法在化妝品中香豆素類化合物的檢測(cè)中應(yīng)用較少，涉及的檢測(cè)方法有限，檢測(cè)對(duì)象不夠全面。劉思然等［17］建立了GC-MS法測(cè)定27種香料，其中涉及的香豆素類化合物包括6-甲基香豆素和香豆素。漆愛明等［18］優(yōu)化了國標(biāo)方法，并建立了同時(shí)測(cè)定化妝品中19種香料的GC-MS法，其中并未涉及香豆素類化合物。已報(bào)道的針對(duì)香豆素類化合物的定性或定量分析研究中，種類覆蓋不完全，尤其是關(guān)于苯丙香豆素、六氫化香豆素的檢測(cè)方法鮮有報(bào)道。本研究中選擇《2015版規(guī)范》中明確規(guī)定禁用但無檢測(cè)方法的4，6-二甲基-8-特丁基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、苯丙香豆素、7-甲氧基香豆素、7-甲基香豆素、六氫化香豆素，以及植物提取物中常見的7-羥基-6-甲氧基香豆素（別名為東莨菪內(nèi)酯）和5，7-二甲氧基香豆素［1］為研究對(duì)象，建立了檢測(cè)化妝品中上述8種香豆素類化合物的GC-MS法，為該類物質(zhì)的檢測(cè)及其在化妝品中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支持。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TSQ 8000 Evo型三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，電子轟擊離子源（美國賽默飛公司）；MSA225S-1CE-DI型天平（德國賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；XPE204型天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為萬分之一）；Multi Reax型恒溫混勻器（德國Heidolph公司）；KQ-800KDE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為800 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

苯丙香豆素標(biāo)準(zhǔn)品（phenprocoumon，純度為96%，批號(hào)為4-RTW-119-6），六氫化香豆素標(biāo)準(zhǔn)品（hexahydrocoumarin，純度為96%，批號(hào)為5-KHI-39-2），4，6-二甲基-8-特丁基香豆素標(biāo)準(zhǔn)品（4，6-dimethyl-8-tert-butylcoumarin，純度為96%，批號(hào)為6-CWA-105-3），5，7-二甲氧基香豆素標(biāo)準(zhǔn)品（5，7-dimethoxycoumarin，純度為98%，批號(hào)為2-HBS-28-1），均購于加拿大Toronto Research Chemicals公司；7-甲氧基香豆素標(biāo)準(zhǔn)品（7-methoxycoumarin，純度為99%，批號(hào)為26723，美國AccuStandard公司）；7-乙氧基-4-甲基香豆素標(biāo)準(zhǔn)品（7-ethoxy-4-methylcoumarin，純度為98%，批號(hào)為10214970，美國Alfa Aesar公司）；7-甲基香豆素標(biāo)準(zhǔn)品（7-methylcoumarin，純度為99.8%，批號(hào)為A0013703，中國Bepure公司）；7-羥基-6-甲氧基香豆素標(biāo)準(zhǔn)品（scopoletin，純度為99.9%，批號(hào)為00019090-622，美國ChromaDex公司）；甲醇（質(zhì)譜純，批號(hào)為CG2113850，美國Fisher公司）；二氯甲烷（色譜純，批號(hào)為29Y1902FK，美國ACS公司）；純化水（18.2 MΩ·cm，默克密理博純水機(jī)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 GC條件

色譜柱：Thermo TG-5SILMS弱極性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：氦氣；流速：1.0 mL/min；分流比：1∶10；分流流量：10 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣口溫度：250℃；程序升溫：80℃、保持3 min，以8℃/min的速率升至240℃、保持5 min；運(yùn)行時(shí)間：28 min。

2.1.2 MS條件

離子化方式：電子轟擊（EI）離子源；電子轟擊源：70 eV；掃描方式：選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）；離子源溫度：280℃；傳輸線溫度：280℃。各化合物的采集參數(shù)見表1。

表1 8種香豆素化合物的保留時(shí)間與特征離子Tab.1 Retention time and characteristic ions of the eight coumarins

2.2 樣品前處理

水劑類化妝品（含香水）：取樣品0.2 g，精密稱定，置具塞比色管中，用二氯甲烷定容至10 mL，充分振蕩均勻，超聲，取上清液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜濾過，進(jìn)樣分析。

乳液、膏霜類化妝品：取樣品0.2 g，精密稱定，置具塞比色管中，加入1.0 mL飽和氯化鈉溶液，用二氯甲烷定容至10 mL，充分振蕩均勻，超聲，取上清液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜濾過，進(jìn)樣分析。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

取六氫化香豆素和7-羥基-6-甲氧基香豆素標(biāo)準(zhǔn)品各適量，精密稱定，溶于甲醇，配制成質(zhì)量濃度分別為200 mg/L和40 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；其余6種香豆素標(biāo)準(zhǔn)品同法配制為質(zhì)量濃度為100 mg/L。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用二氯甲烷稀釋，六氫化香豆素質(zhì)量濃度為2.00，5.00，10.00，20.0，40.0，100.0 mg/L，7-羥基-6-甲氧基香豆素質(zhì)量濃度為0.40，1.00，2.00，4.00，8.00，20.0 mg/L，其余6種香豆素質(zhì)量濃度為1.00，2.50，5.00，10.0，20.00，50.0 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察與檢測(cè)限、定量限確定：取2.3項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。以8種香豆素類化合物的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，詳見表2。取樣品0.2 g，精密稱定，加二氯甲烷稀釋至10 mL，以3倍信噪比計(jì)算檢測(cè)限，以10倍信噪比計(jì)算定量限。結(jié)果見表2。

表2 8種香豆素化合物的線性關(guān)系考察結(jié)果與檢測(cè)限、定量限Tab.2 Results of the linear relation test，LOD and LOQ of the eight coumarins

加樣回收試驗(yàn)與精密度試驗(yàn)：在水劑、乳液和膏霜3種化妝品空白基質(zhì)中，添加2.3項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，六氫化香豆素質(zhì)量濃度分別為5.0，10.0，40.0 mg/L，7-羥基-6-甲氧基香豆素分別為1.0，2.0，8.0 mg/L，其余6種香豆素化合物分別為2.5，5.0，20.0 mg/L。同樣品前處理方法進(jìn)一步處理，按2.1項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，各水平檢測(cè)6份平行樣品。結(jié)果見表3。3種化妝品空白基質(zhì)在其余6種香豆素加標(biāo)質(zhì)量濃度為2.5 mg/L、六氫化香豆素為5.0 mg/L、7-羥基-6-甲氧基香豆素為1.0 mg/L的SIM圖見圖2。結(jié)果表明，8種香豆素類化合物在3種不同基質(zhì)中含量的RSD在0.91%～5.68%范圍內(nèi)，均小于6%，表明方法的精密度良好。回收率在89.78%～116.64%范圍內(nèi)，造成部分化合物回收率偏高的原因可能是由化妝品的基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致，與化妝品基質(zhì)復(fù)雜，各種物質(zhì)的干擾較多，導(dǎo)致回收樣品基線偏高，且回收率整體偏高趨勢(shì)一致。

表3 3種空白基質(zhì)加樣回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)結(jié)果（%，n=6）Tab.3 Results of the recovery test and the precision test of the three types of blank matrixes（%，n=6）

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

香豆素類物質(zhì)若添加進(jìn)化妝品，會(huì)作為增香劑使用，且具有一定光敏特性，故選擇香豆素類化合物使用可能性較大的香水類、沐浴洗發(fā)類非特殊護(hù)膚品樣品各10份，防曬劑特殊類護(hù)膚品樣品10份，依據(jù)本研究中建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，該30份樣品中均未檢出8種香豆素類化合物。

3 討論

3.1 色譜柱選擇

考慮到8種香豆素類化合物都具有一定極性，強(qiáng)極性色譜柱穩(wěn)定性不強(qiáng)，升溫到一定程度時(shí)基線易漂移，影響檢測(cè)結(jié)果，故未選擇強(qiáng)極性色譜柱。本研究中比較了實(shí)驗(yàn)室常見的中極性（DB-624，30 m×0.25 mm，1.4 μm）和弱極性（TG-5SILMS，30 m×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱中各組分的分離情況。中極性色譜柱未檢出苯丙香豆素，且7-乙氧基-4-甲基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、7-羥基-6-甲氧基香豆素3種化合物的出峰時(shí)間較晚，其中，7-羥基-6-甲氧基香豆素因出峰時(shí)間過長導(dǎo)致拖尾嚴(yán)重，影響檢測(cè)限。弱極性色譜柱能同時(shí)檢出這8種香豆素類物質(zhì)，分離度理想，峰形尖銳對(duì)稱。綜合考慮化合物的總運(yùn)行時(shí)間、分離度與峰形，最終選擇弱極性色譜柱進(jìn)行檢測(cè)。

1.六氫化香豆素2.7-甲基香豆素3.7-甲氧基香豆素4.4，6-二甲基-8-特丁基香豆素5.7-羥基-6-甲氧基香豆素6.7-乙氧基-4-甲基香豆素7.5，7-二甲氧基香豆素8.苯丙香豆素A.水劑B.乳液C.膏霜圖2 3種空白基質(zhì)在同一加標(biāo)質(zhì)量濃度的選擇離子監(jiān)測(cè)圖1.Hexahydrocoumarin 2.7-Methylcoumarin 3.7-Methoxycoumarin 4.4，6-Dimethyl-8-tert-butylcoumarin 5.Scopoletin 6.7-Ethoxy-4-methylcoumarin 7.5，7-Dimethoxycoumarin 8.PhenprocoumonA.Liquid preparation B.Emulsion preparation C.Cream preparationFig.2 SIM diagrams of the three types of blank matrixes adding mixed standard solution with the same mass concentration

3.2 萃取溶劑選擇

8種香豆素類化合物在甲醇中的溶解度均很好。但考慮到甲醇極性較大，使用甲醇作為萃取溶劑會(huì)對(duì)弱極性色譜柱造成很強(qiáng)的柱流失。同時(shí)，正己烷與甲醇不互溶，四氫呋喃對(duì)儀器有一定腐蝕性，丙酮為易制毒類試劑，故采用二氯甲烷作為萃取溶劑。標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制由二氯甲烷稀釋標(biāo)準(zhǔn)混合品溶液后得到。香豆素類化合物在各種劑型的化妝品中分布廣泛，香水等液體類化妝品可直接用二氯甲烷分散并超聲溶解；對(duì)于不易分散的乳霜等其他類化妝品，采用1.0 mL氯化鈉飽和溶液破乳后，再加入二氯甲烷振蕩，分散樣品，超聲提取。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立了同時(shí)測(cè)定化妝品中8種香豆素類化合物的GC-MS法，對(duì)水劑類、乳液類、膏霜類3種不同基質(zhì)的化妝品進(jìn)行了相應(yīng)前處理，且8種香豆素類物質(zhì)得到滿意分離，獲得了各化合物的特征離子數(shù)據(jù)，方法定性定量準(zhǔn)確、操作簡便，精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果能滿足檢測(cè)要求，可為香豆素類化合物在化妝品中的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)督提供技術(shù)支持。