江舟

（云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南昆明 650500）

香豆素類(lèi)化合物是具有芳香氣味的天然產(chǎn)物，通過(guò)植物酪氨酸衍生出苯丙烷內(nèi)酯，從細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物中鑒定出多種香豆素。目前，在豆科等74 科植物中發(fā)現(xiàn)香豆素類(lèi)化合物，自然界發(fā)現(xiàn)香豆素具有抗病毒保護(hù)心臟等藥理作用，影響多種植物的生長(zhǎng)發(fā)育，具有調(diào)節(jié)根系微生物群落結(jié)構(gòu)等作用。根據(jù)化合物母核結(jié)構(gòu)分為簡(jiǎn)單香豆素、異香豆素類(lèi)等，在自然界中主要分布于菊科、瑞香科等植物中，香豆素類(lèi)化合物具有光學(xué)活性用作熒光增白劑等，合成新型香豆素化合物應(yīng)用前景廣闊，香豆素生物合成主要細(xì)節(jié)處于探索階段，本文綜述香豆素植物體內(nèi)相關(guān)功能，介紹關(guān)鍵酶基因研究進(jìn)展，為后續(xù)研究提供理論參考。

1 香豆素類(lèi)化合物簡(jiǎn)介

1.1 香豆素類(lèi)型

香豆素是重要的有機(jī)雜環(huán)化合物，其衍生物具有多種生理學(xué)性質(zhì)，如抗凝血作用等，某些香豆素衍生物具有抗HIV 活性，有些在臨床上作為口服抗凝血藥廣泛應(yīng)用。香豆素分子存在C=C 雙鍵及內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，具有優(yōu)異的光學(xué)性能，使其呈現(xiàn)熒光量子收率高等特點(diǎn)，是熒光傳感器分子設(shè)計(jì)中的優(yōu)秀候選熒光團(tuán)，在醫(yī)化生等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。香豆素具有芬芳?xì)馕?，可在飲料食品中作為芳香劑[1]。

天然香豆素類(lèi)化合物主要存在于瑞香科、蕓香科等高等植物中。目前發(fā)現(xiàn)天然香豆素類(lèi)化合物有近千種，可分為簡(jiǎn)單香豆素，吡喃香豆素等類(lèi)型。簡(jiǎn)單香豆素是在苯環(huán)上具有取代基香豆素，苯環(huán)上的C-6 位電負(fù)荷性較高，含氧取代基多出現(xiàn)在C-6 位上。呋喃香豆素類(lèi)結(jié)構(gòu)中呋喃環(huán)是6 位異戊烯基于7 位羥基環(huán)合成，根據(jù)呋喃環(huán)與母體駢合位置分為線性與角型，常見(jiàn)線型有補(bǔ)骨脂素等[2]。吡喃香豆素是6 位異戊烯形成2，2-二甲基-a-吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)化合物，常見(jiàn)線型吡喃香豆素有獨(dú)活中的花椒內(nèi)酯，角型吡喃香豆素有白花前胡中的邪蒿內(nèi)酯。

1.2 香豆素化合物的功能

香豆素是最簡(jiǎn)單的植物次生代謝物，細(xì)胞受損后釋放，香豆素化合物具有抗病毒、抗HIV 等多種藥理作用[3]。香豆素主要功能包括參與植物生長(zhǎng)過(guò)程，香豆素可通過(guò)抑制水稻脫落酸分解代謝延遲種子萌發(fā)，可抑制超氧化合物歧化酶活性，破壞小麥糊粉層氧化還原穩(wěn)態(tài)，可能在基因轉(zhuǎn)錄中起誘導(dǎo)因子作用，香豆素對(duì)許多雜草種子萌發(fā)具有較強(qiáng)抑制作用。

研究發(fā)現(xiàn)，東莨菪內(nèi)酯具有清除活性氧自由基的作用，在擬南芥中刺激細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)育，植物在缺鐵下根系分泌東莨菪內(nèi)酯等小分子氧化還原活性分子，兒茶酚香豆素可與土壤中鐵形成螯合物[4]。東莨菪內(nèi)酯被分泌到根際抑制植物病原體生長(zhǎng)，Beyer 等發(fā)現(xiàn)擬南芥東莨菪內(nèi)酯可抑制銹病真菌活性避免大豆感染，抗菌素東莨菪內(nèi)酯在煙草根中積累抵御壞死真菌個(gè)安然，植物可利用香豆素等代謝物混合物消滅致病菌。香豆酸以無(wú)香氣糖苷形式存在于液泡中，水解同時(shí)閉環(huán)生成香豆素，豆科草木犀植株高大，香豆素含量高，香豆素衍生物4-羥基香豆素形成于微生物代謝，霉菌將反式鄰香豆酸轉(zhuǎn)化為4-羥基香豆素，雙香豆素會(huì)引起牲畜內(nèi)出血導(dǎo)致死亡。

1.3 香豆酸的藥理作用

香豆素化合物具有抗寄生蟲(chóng)等多種藥理作用。腫瘤是當(dāng)今危及人類(lèi)生命的常見(jiàn)疾病，我國(guó)腫瘤在首要疾病中排名第二。自然界為人類(lèi)提供治療疾病的系列藥物，許多化學(xué)藥物發(fā)現(xiàn)源于天然產(chǎn)物，中國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥有大量使用中草藥抗腫瘤案例。日本學(xué)者對(duì)Prangos 體外實(shí)驗(yàn)表明，胃腺癌細(xì)胞MK-1 細(xì)胞具有抑制作用。AIDS 是人類(lèi)HIV 引起全身性免疫缺陷疾病，目前以HIV 逆轉(zhuǎn)錄酶等為靶點(diǎn)，用于臨床治療藥物對(duì)人體細(xì)胞毒性大，可開(kāi)發(fā)天然化合物為先導(dǎo)化合物進(jìn)行藥物研究。

香豆素具有良好的抗菌活性，蛇床子水提物可抑制金黃色葡萄球菌與耐藥金黃色葡萄球菌，復(fù)方蛇床子水劑可減弱其殘余株致病力。天然香豆素在自然界中含量低，人們通過(guò)研究香豆素抗菌構(gòu)效關(guān)系將多種結(jié)構(gòu)片段形成復(fù)合結(jié)構(gòu)。研究表明，丙沙星取代基引入香豆素3-位得到雙取代環(huán)丙沙星香豆素衍生物，性能優(yōu)于環(huán)丙沙星，提高單取代環(huán)丙沙星香豆素衍生物。1956 年國(guó)外學(xué)者提出衰老與自由基學(xué)說(shuō)，活性氧與許多衰老相關(guān)疾病發(fā)生防治有關(guān)。川牛膝成分香豆素具有抗腎功能衰竭功能，通過(guò)防止生成氧自由基改善腎功能衰竭。瑞香素是臨床治療血栓閉塞型脈管的中草藥單體，具有抗紅細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化作用。

2 香豆素化合物的合成

1820 年香豆素首次由慕尼黑香豆中分離，法國(guó)尼古拉斯分離出香豆素進(jìn)行命名。1868 年英國(guó)化學(xué)家威廉[5]首次合成。生物合成中簡(jiǎn)單香豆素結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化是在6位烷基化，取代7 位羥基形成呋喃環(huán)香豆素。植物中的L-苯丙氨酸解氨酶可將L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸，在肉桂酸4-羥化酶作用下發(fā)生鄰羥基化反應(yīng)，經(jīng)過(guò)反應(yīng)形成香豆素類(lèi)化合物等次生代謝產(chǎn)物，葉綠體中缺乏C4H 時(shí)C2H 可將肉桂酸轉(zhuǎn)化為鄰香豆酸。

2.1 香豆素合成途徑研究

香豆素化合物是很多植物次生代謝產(chǎn)物，目前鑒定香豆素物質(zhì)有數(shù)千種，香豆素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用。有關(guān)香豆素合成研究包括香豆素與植物抗病性，香豆素化合物與植物生長(zhǎng)關(guān)系研究等。植物生長(zhǎng)中香豆素起到調(diào)控作用，東莨菪烴是香豆素化合物中生物生長(zhǎng)抑制劑，香豆素類(lèi)化合物生長(zhǎng)中具有抗氧化劑。香豆素合成途徑是苯丙烷代謝中合成植保素支路，具有許多重要生物學(xué)功能，抵御多種植物病原菌在植物體內(nèi)生長(zhǎng)繁殖。

酚類(lèi)植保素是植物體內(nèi)苯丙烷代謝中一次生物質(zhì)，主要合成途徑為苯丙烷代謝中苯丙氨酸支路，苯丙氨酸解氨酶是關(guān)鍵酶。PAL是苯丙烷代謝途徑第一酶，是目前研究最多的酶。國(guó)內(nèi)外對(duì)煙草等植物PAL 基因進(jìn)行克隆分析，目前PAL 在植物抗病中研究廣泛。C4H 為首個(gè)鑒定植物P450 單加氧酶，代謝途徑中作用是催化反式肉桂酸轉(zhuǎn)化為對(duì)羥基香豆酸。目前在黃瓜等50 多種植物中克隆C4H 基因，C4H 基因表達(dá)受到多種因素調(diào)控，研究認(rèn)為基因啟動(dòng)子序列中存在共同的順式作用元件。4CL 以C4H 酶催化產(chǎn)物羥基香豆酸為底物，是酚類(lèi)物質(zhì)合成的關(guān)鍵點(diǎn)，目前在大豆等植物中發(fā)現(xiàn)得到4CL基因。煙草中4CL 由Nt4cl1 參與酚類(lèi)物質(zhì)的合成，對(duì)4CL 基因研究主要集中于與木本素的關(guān)系。

2.2 香豆素合成方法

目前，合成香豆素類(lèi)化合物方法包括Pechman 法，Perkin 法等。Knoevenagel 法反應(yīng)原理是在弱堿催化下化合物與醛發(fā)生縮合反應(yīng)生成香豆素衍生物。William[6]首次人工合成Perkin 反應(yīng)，在強(qiáng)堿弱酸催化下發(fā)生烯醇化酸酐縮合反應(yīng)。Hanson[7]首次報(bào)道Pechmann 縮合反應(yīng)，含活潑氫酮酸脂與取代苯酚發(fā)生親電取代反應(yīng)，與酚羥發(fā)生內(nèi)酯交換。最近對(duì)Pechmann 反應(yīng)研究增多。

Perkin 法最早用于制備香豆素類(lèi)化合物合成法，是工業(yè)生產(chǎn)香豆素主要方法，存在羥醛縮合等副反應(yīng)。Kneovenagel 合成法與Perkin 類(lèi)似，適合制備3 位取代香豆素類(lèi)化合物。Pechmann 合成法因催化劑酸用量較大，副產(chǎn)物較多，分離提取困難。改進(jìn)方法使香豆素化合物合成效率得到提高，成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。香豆素生物合成包括反式肉桂形成香豆素與其他羥基化香豆素，與UDP-葡萄糖在2-香豆酸O-B 葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶下生成反式鄰香豆酸β-葡萄糖苷，在紫外線輻射下引起非酶光化學(xué)反應(yīng)。香豆素非游離態(tài)以葡萄糖苷形式存在，自發(fā)內(nèi)酯化形成游離香豆素。

反式肉桂酸在C4H 作用下進(jìn)行對(duì)羥基化形成對(duì)香豆酸，與對(duì)香豆酰CoA2-羥化酶生成2-二羥基香豆素酰CoA。香豆酸可與香豆酸-羥基化酶作用生成咖啡酸，對(duì)香豆酰Co 可在羥基肉桂?；夤瘐；D(zhuǎn)移酶作用下生成對(duì)香豆酰莽草酸，咖啡CoA 與咖啡酰輔酶下生成阿魏酰CoA，在香豆素酶作用下發(fā)生內(nèi)酯化形成東莨菪內(nèi)酯?？Х弱oA 可在體外與含酚酶活性植物提取物作用轉(zhuǎn)化成七葉亭，傘形花內(nèi)酯6-羥基化在P450單加氧酶作用下完成。七葉亭合成通過(guò)對(duì)香豆素酸到2-二羥基肉桂酸實(shí)現(xiàn)。

3 香豆素生物合成關(guān)鍵酶基因

研究對(duì)香豆素含量存在差異百花草木樨進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，鑒定出213 個(gè)unigenes 為苯丙氨酸合成途徑，初步歸納百花草木樨香豆素合成通路。Wu[8]等對(duì)不同香豆素含量百花草木樨調(diào)控香豆素合成基因micro RNA 分析，利用GO 對(duì)預(yù)測(cè)靶基因功能注釋?zhuān)芯空咴谙愣顾睾铣赏緩街型诰蚨鄠€(gè)參與香豆素合成基因。香豆素合成通路中大多基因以家族形式存在于植物中，PAL為限速酶調(diào)節(jié)進(jìn)入苯丙烷代謝總通量，發(fā)現(xiàn)At PAL1 控制類(lèi)黃酮合成，ClassI 與木質(zhì)素合成相關(guān)。

Vogt[9]認(rèn)為CCo AOMT 與木質(zhì)素合成相關(guān)，擬南芥根中東莨菪內(nèi)酯產(chǎn)生需要C3H 活性，東莨菪內(nèi)酯含量下降3%。Kawai[10]等將2OGDs 分為DOXB 與DOXC，蕓香Rg C2'H 僅催化p-香豆酰CoA 形成傘形花內(nèi)酯。擬南芥At F6'H1 介導(dǎo)阿魏CoA 鄰羥基化生成東莨菪內(nèi)酯。AtF6'H2 僅為具有對(duì)肉桂酸CoA 硫代脂活性，S8H與同源基因F6'H2 轉(zhuǎn)化本氏煙草葉片，由于煙草葉片中自然存在阿魏酸，F(xiàn)6'H2 過(guò)量表達(dá)為S8 催化反應(yīng)提供底物。Vanholme[11]等在擬南芥中發(fā)現(xiàn)COSY，COSY 是BAHD-?；D(zhuǎn)移酶家族成員，C2'H 作用下隨后順?lè)磻?yīng)異構(gòu)化是光催化，研究表明，COSY 在閉光器官中的香豆素合成具有重要功能。催化碳水化合物部分β-葡萄糖苷鍵水解產(chǎn)生香豆素苷元形式。BGLU 廣泛參與細(xì)胞壁木質(zhì)化等植物次生代謝重要生理過(guò)程，擬南芥中At BGLU21-23 控制產(chǎn)生東莨菪苷水解，AtBGLU42 參與誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)細(xì)胞疾病的抵抗力。UGT 為糖基轉(zhuǎn)移酶I 家族，植物可通過(guò)UGT 將東莨菪內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為東莨菪苷，糖基化香豆素將東莨菪苷轉(zhuǎn)化為東莨菪內(nèi)酯。

4 模式植物中UGT 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族在香豆素代謝中起到重要作用，糖基化在調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物有效性方面起到重要作用，可以改變?cè)诩?xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)，糖基化是糖基轉(zhuǎn)移酶催化常見(jiàn)后修飾過(guò)程。UGT 基因家族C 末端含有44 個(gè)氨基酸組成保守序列PSPG 基序，僅憑序列信息無(wú)法可靠預(yù)測(cè)物種間糖基化次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)變化。UG 分布廣泛，單雙子葉植物在物種間所占基因數(shù)量差異小，研究對(duì)擬南芥121 個(gè)，蒺藜苜蓿243 個(gè)UGT氨基酸序列多序列對(duì)比，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)bootstrap 為1000。擬南芥14 組，痢疾苜蓿15 個(gè)組，F(xiàn) 組為雙子葉植物特有組，在DE 組中UGT 數(shù)量最多。D 組中蒺藜苜蓿比其他植物擴(kuò)張明顯，IG 組水稻和蒺藜苜蓿中有明顯擴(kuò)張。大豆組中GmSGT2 參與大豆皂苷I 的生成物合成，擬南芥D 組參與類(lèi)黃酮等生物合成。G 組參與萜類(lèi)化合物黃橙橙。預(yù)測(cè)DE 組可能與香豆酸合成相關(guān)。

5 結(jié)語(yǔ)

綜述了香豆素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因研究進(jìn)展，大量研究對(duì)生物合成途徑諸多基因進(jìn)行克隆鑒定，更多研究針對(duì)單個(gè)基因功能研究。關(guān)鍵基因是單一參與香豆素生物合成。結(jié)構(gòu)基因在香豆素生物合成途徑調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模糊，具體調(diào)控靶基因作用機(jī)制不明確。香豆素含量高的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系不成熟。今后香豆素生物合成研究應(yīng)關(guān)注利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)掘香豆素生物合成關(guān)鍵酶基因，在香豆素生物合成下游途徑探索；克隆出調(diào)控香豆素合成基因后，構(gòu)建非模式植物轉(zhuǎn)基因體系進(jìn)行功能驗(yàn)證，從遺傳學(xué)角度研究驗(yàn)證香豆素合成不同基因生物學(xué)功能。