王金泗，蔡少鑫，曾 偉，程雪飛，劉立航，林孟波

福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建省立醫(yī)院腫瘤外科，福州 350001

Dachshund家族轉(zhuǎn)錄因子1(Dach1)是RDGN網(wǎng)絡(luò)通路上的重要抑癌基因，已有報(bào)道稱Dach1在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，其機(jī)制可能與其啟動子甲基化有關(guān)，但Dach1對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移功能的影響尚未見報(bào)道。低表達(dá)Dach1可以通過影響TGF-β通路而抑制多種實(shí)體瘤如乳腺癌、前列腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移，因此存在潛在的影響結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的功能。本研究通過下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480的Dach1表達(dá)后，進(jìn)一步研究其對SW480細(xì)胞遷移、侵襲的作用變化，并研究其可能的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞、試劑和培養(yǎng)液

SW480細(xì)胞購自ATCC；DMEM培養(yǎng)液及新生小牛血清購自Hyclone公司；轉(zhuǎn)染用無血清Opti-MEMI購自Sigma公司；熒光素酶實(shí)驗(yàn)試劑盒購買于Promega公司；Zeb1、GAPDH的熒光定量PCR引物由上海英駿生物有限公司合成；miR-200b，miR-200c，U6引物，miR-200c mimics及對照，si-Dach1，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及轉(zhuǎn)染試劑盒購買于銳博公司。序列為：si-Dach1正義鏈：5′-GCCUCCUAAGAGGACUCAATT-3′，反義鏈：5′-UUGAGUCCUCUUAGGAGGCTT-3′)；RNAi陰性對照正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)；GAPDH正義鏈：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反義鏈：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；Zeb1正義鏈：5′-GAACAGGACTCAAGACATCTCAGTGT-3′，反義鏈：5′-GGTTTATTCTCTATCTTTTGCCGTATCT-3′。單克隆抗體Dach1、E-cadherin、β-catenin、Zeb1購自Santa Cruz公司，GAPDH抗體以及HRP標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗及羊抗鼠熒光二抗購于武漢博士德公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。轉(zhuǎn)染前6孔板中每孔接種約5×105個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照轉(zhuǎn)染試劑盒使用說明，實(shí)驗(yàn)分組為：對照組(SW480con組，轉(zhuǎn)染siRNA對照序列)，低表達(dá)Dach1組(SW480si-Dach1組，轉(zhuǎn)染si-Dach1)，低表達(dá)Dach1同時高表達(dá)miR-200c組(SW480si-Dach1+miR-200c組，轉(zhuǎn)染si-Dach1+miR-200c mimics)。

1.3 Real-time PCR檢測miR-200b、miR-200c水平

使用Trizol提取各細(xì)胞中的RNA(步驟按照產(chǎn)品說明書)，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用ABI 7300 Real-time PCR檢測儀檢測miR-200b、miR-200c、Zeb1和GAPDH的mRNA水平。

1.4 Western blot法檢測蛋白水平

參照Santa Cruz公司所提供的蛋白提取方法，應(yīng)用蛋白裂解緩沖液(150 mmol/L氯化鈉，1%NP-40，1%去氧膽酸鈉，0.1%十二烷基磺酸鈉，1 mmol/L正釩酸鈉，1 mmol/L苯甲磺酰氟)裂解細(xì)胞得到總蛋白。以BSA(胎牛血清)作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)蛋白定量試劑盒(Bio Rad公司產(chǎn)品)繪制蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，分光光度計(jì)測570 nm波長處吸光度值，計(jì)算提取液的蛋白濃度。取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。然后電轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜成功后，含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉30 min。加一抗(1∶1000)在4 ℃下過夜。TBST洗滌3次，二抗(1∶5000)振蕩孵育2 h。采用化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。

1.5 Transwell檢測低表達(dá)Dach1對SW480細(xì)胞遷移和侵襲的影響

按照上述實(shí)驗(yàn)分組后，將轉(zhuǎn)染48 h后已長滿的SW480細(xì)胞消化后制成懸液，遷移實(shí)驗(yàn)用含10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL，侵襲實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為5×106個/mL。每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后取上室，以棉簽拭去小室濾膜上的細(xì)胞。PBS洗后將小室置于95%乙醇中固定10 min，PBS洗5 min×2次，蘇木精染色2～5 min，水洗后倒置于普通顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)13個視野(×100)內(nèi)的膜下細(xì)胞數(shù)。將4℃的DMEM培養(yǎng)液加入液化的基質(zhì)膠中，使基質(zhì)膠濃度稀釋至200 μg/mL，將200 μL槍頭的尖端剪掉，取稀釋液200 μL均勻涂抹在8 μm孔徑的Transwell聚碳酸酯膜上，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)以檢測細(xì)胞的侵襲能力。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測低表達(dá)Dach1對SW480細(xì)胞遷移能力的影響

按照上述實(shí)驗(yàn)分組后，轉(zhuǎn)染48 h后將細(xì)胞制成懸液，以每孔4×105的密度接種到6孔培養(yǎng)板上，37℃溫箱中培養(yǎng)過夜后取出細(xì)胞，用200μL槍頭，使槍頭垂直于孔表面作垂直于背面標(biāo)記線的垂線做劃痕。吸凈舊的培養(yǎng)液，用無菌PBS洗細(xì)胞面3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)液，置入37℃溫箱中培養(yǎng)，分別取劃痕后0、24 h培養(yǎng)板于鏡下觀察劃痕彌合情況并拍照，并測量標(biāo)記位點(diǎn)的劃痕寬度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Dach1低表達(dá)增強(qiáng)SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力

在SW480細(xì)胞中通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染si-Dach1后，蛋白水平驗(yàn)證SW480si-Dach1組較SW480con組Dach1低表達(dá)。

Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力，得到如圖1所示結(jié)果。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，SW480si-Dach1組遷移的細(xì)胞數(shù)多于SW480con組[(102.33±1.53)vs. (44.67±2.52)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)48 h后SW480si-Dach1組穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)多于SW480con組[(45.33±2.52)vs. (17.33±0.58)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，24 h時SW480si-Dach1組細(xì)胞遷移的平均距離大于SW480con組[(111.67±5.86)μmvs. (42.21±3.11)μm]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 SW480con 組、SW480si-Dach1組與SW480si-Dach1+miR-200c組細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)的比較Fig.1 Comparison of the number of penetrating cells in cell migration and invasion experiments in SW480con group，SW480si-Dach1 group and SW480si-Dach1+miR-200c group

圖2 SW480con 組、SW480si-Dach1組與SW480si-Dach1+miR-200c組細(xì)胞遷移距離的比較Fig.2 Comparison of migration distances of SW480 cells in SW480con，SW480si-Dach1 and SW480si-Dach1+miR-200c groups in wound healing assay

2.2 Dach1低表達(dá)促進(jìn)SW480細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力發(fā)生改變的重要機(jī)制。我們檢測EMT通路相關(guān)蛋白表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)，SW480si-Dach1組中上皮相關(guān)指標(biāo)E-cadherin表達(dá)較SW480con組降低，而間質(zhì)相關(guān)指標(biāo)β-catenin表達(dá)較SW480con組升高。SW480si-Dach1組中Zeb1表達(dá)較SW480con組增高(圖3)，這與Real-time PCR的檢測結(jié)果相一致(圖4)。Zeb1為E-cadherin、β-catenin等蛋白的上游，由上述結(jié)果我們可以知道，低表達(dá)Dach1后，Zeb1表達(dá)升高，由此引起E-cadherin表達(dá)下降，β-catenin表達(dá)升高，SW480細(xì)胞發(fā)生EMT。

圖3 SW480con 組、SW480si-Dach1組與SW480si-Dach1+miR-200c組上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞信號通路變化Fig.3 Signaling pathway changes of epithelial-mesenchymal transition in SW480con，SW480si-Dach1 and SW480si-Dach1+miR-200c groups

圖4 SW480con 組、SW480si-Dach1組與SW480si-Dach1+miR-200c組細(xì)胞Zeb1 mRNA表達(dá)水平變化Fig.4 Zeb1 mRNA expression in SW480con，SW480si-Dach1 and SW480si-Dach1+miR-200cgroups

2.3 Dach1低表達(dá)通過抑制miR-200c表達(dá)促進(jìn)SW480細(xì)胞EMT、侵襲和遷移

已有報(bào)道m(xù)iR-200家族功能與腫瘤細(xì)胞的EMT相關(guān)，且miR-200與Zeb1互相抑制，因此我們猜測低表達(dá)Dach1是否通過miR-200來影響Zeb1從而影響SW480細(xì)胞的EMT。

首先，我們在SW480細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-Dach1并在蛋白水平驗(yàn)證Dach1低表達(dá)后，檢測miR-200家族的miR-200b和miR-200c的表達(dá)變化，miR-200b在Dach1低表達(dá)前后分別為(1.000±0.168)和(0.875±0.203)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-200c在Dach1低表達(dá)前后分別為(1.000±0.219)和(0.531±0.213)(P<0.05)，見圖5，因此我們挑選miR-200c作為我們的研究對象。

圖5 低表達(dá)Dach1后miR-200家族的表達(dá)變化Fig.5 Relative expression changes of microRNA-200 family after down-regulation of Dach1

接下來，我們在低表達(dá)Dach1的同時高表達(dá)miR-200c后，SW480si-Dach1+miR-200c組中的Zeb1在mRNA水平的表達(dá)較SW480si-Dach1組下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的miR-200c對Zeb1的抑制作用相一致。

在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，SW480si-Dach1+miR-200c組細(xì)胞少于SW480si-Dach1組(44.67±2.52)vs. (102.33±1.53)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在侵襲實(shí)驗(yàn)中48 h后SW480si-Dach1+miR-200c組細(xì)胞亦少于SW480si-Dach1組(20.33±1.53)vs. (45.33±2.52)，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中24 h后SW480si-Dach1+miR-200c組遷移的距離小于SW480con組[(44.21±3.11)μmvs. (111.67±5.86)μm]，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1、2)。

在EMT通路的蛋白表達(dá)中，SW480Si-Dach1+miR-200c組較SW480Si-Dach1組E-cadherin表達(dá)升高，β-catenin及Zeb1表達(dá)降低(圖3)。

從上述結(jié)果我們可以看出，當(dāng)Dach1低表達(dá)時，miR-200c表達(dá)下降，此時Zeb1表達(dá)升高，從而引起EMT相關(guān)通路激活(E-cadherin表達(dá)下降，β-catenin表達(dá)升高)，SW480細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)。而當(dāng)我們在低表達(dá)Dach1的同時高表達(dá)miR-200c時，Zeb1的表達(dá)下降，SW480細(xì)胞的侵襲和遷移能力下降，提示Dach1低表達(dá)時SW480細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)可能通過低表達(dá)miR-200c來實(shí)現(xiàn)。

3 討論

Dach1全稱Dachshund家族轉(zhuǎn)錄因子1，該基因在物種之間保持著高度的保守性，并在乳腺癌、前列腺癌、肺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。已經(jīng)知道Dach1能夠通過TGF-β抑制多種實(shí)體瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[1-3]，但Dach1對于結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響尚未見報(bào)道。Dach1在結(jié)直腸癌中由于啟動子的甲基化致低表達(dá)，且高表達(dá)Dach1可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系的增殖，提示Dach1潛在的抑癌基因性質(zhì)[4]。結(jié)合上述我們思考：Dach1的表達(dá)是否影響結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移呢？為了研究這個問題，我們選擇Dach1表達(dá)較高的SW480細(xì)胞，我們應(yīng)用si-RNA技術(shù)下調(diào)SW480細(xì)胞系的Dach1表達(dá)，驗(yàn)證Dach1蛋白水平低表達(dá)后進(jìn)行Transwell、細(xì)胞劃痕等實(shí)驗(yàn)，檢測了SW480中si-Dach1組相較于SW480對照組在遷移、侵襲等生物學(xué)功能的變化，初步說明了低表達(dá)Dach1的促腫瘤轉(zhuǎn)移作用。

我們發(fā)現(xiàn)低表達(dá)Dach1可以通過影響EMT促進(jìn)SW480的侵襲轉(zhuǎn)移。EMT是一種高度保守的過程，其主要的過程為具有極性的上皮細(xì)胞如結(jié)腸癌細(xì)胞系，失去貼壁緊密連接，成為遷移能力較強(qiáng)的間充質(zhì)細(xì)胞[5]。由于結(jié)腸癌細(xì)胞系在轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞后，失去了上皮的特征，更易于脫落并沿著血管轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處，因此EMT廣泛參與了結(jié)腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程[6]。由上述可知在EMT發(fā)生中伴隨著上皮標(biāo)記分子，如：細(xì)胞黏附分子(E-鈣黏蛋白即E-cadherin)等表達(dá)的降低，以及間充質(zhì)標(biāo)記分子，如：Vimentin、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、β-catenin表達(dá)的升高。在我們的實(shí)驗(yàn)中觀察到了上述的分子表達(dá)變化：低表達(dá)Dach1后，SW480細(xì)胞中的E-cadherin表達(dá)降低，而β-catenin等間質(zhì)特性的標(biāo)記分子表達(dá)升高，說明此時SW480細(xì)胞慢慢失去上皮的特征，增加了間質(zhì)細(xì)胞的特性，此時的細(xì)胞更容易從原位脫落，轉(zhuǎn)移到其他部位。與上述分子表達(dá)變化相呼應(yīng)的是，在低表達(dá)Dach1后，SW480細(xì)胞的侵襲和遷移能力的增強(qiáng)。低表達(dá)Dach1后，Zeb1的蛋白表達(dá)增加，同時也發(fā)現(xiàn)Zeb1在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)增加，說明低表達(dá)Dach1可以在轉(zhuǎn)錄水平高表達(dá)Zeb1后激活下游的EMT通路進(jìn)而影響SW480細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

我們還發(fā)現(xiàn)低表達(dá)Dach1通過抑制miR-200c的表達(dá)促進(jìn)Zeb1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。MicroRNAs(miRNAs)是目前研究基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的熱點(diǎn)之一，它可以結(jié)合到轉(zhuǎn)錄因子的3′端非編碼區(qū)影響基因的表達(dá)[7]。已經(jīng)證實(shí)miR-200家族在結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色[8]，且已知miR-200與Zeb1之間相互抑制[9]，我們發(fā)現(xiàn)低表達(dá)Dach1后miR-200c表達(dá)降低，Zeb1轉(zhuǎn)錄升高，高表達(dá)miR-200c后，SW480細(xì)胞的侵襲和遷移能力變化被逆轉(zhuǎn)。因此我們認(rèn)為低表達(dá)Dach1后，通過低表達(dá)miR-200c從而在轉(zhuǎn)錄水平高表達(dá)Zeb1，進(jìn)而激活EMT通路促進(jìn)SW480細(xì)胞的侵襲和遷移能力。