吳美琴，徐元萍，王 勇，宋曉婕，李玉霞，劉智慧，王燕萍，廖紅玉

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院(武漢市婦幼保健院)婦科，武漢 4300152武漢市第三醫(yī)院(武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院)婦產(chǎn)科，武漢 4300743武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，武漢 4300724湖北省中醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北省中醫(yī)藥研究院，武漢 430074

卵巢惡性腫瘤是女性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。卵巢癌在婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中的發(fā)病率為第3位，卻是死亡率最高的婦科腫瘤，嚴(yán)重威脅著婦女的健康與生命[2-3]。上皮性卵巢癌是最常見的卵巢惡性腫瘤，由于缺乏有效的篩查手段以及發(fā)病初期癥狀、體征較為隱蔽，大多數(shù)患者在確診時(shí)已屬晚期。如何改善卵巢癌患者的預(yù)后、延長(zhǎng)其生存期是臨床醫(yī)生面臨的困難之一，因此，尋找新的治療靶點(diǎn)是我們亟須解決的問(wèn)題。本研究以人上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，敲降IL-17后，觀察其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 裸鼠成瘤及分組

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞(來(lái)自中科院細(xì)胞庫(kù))，用0.1%的胰酶進(jìn)行消化至鏡下細(xì)胞呈橢圓形至球形時(shí)，用含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液終止消化，吸管輕輕吹打至細(xì)胞完全懸浮后收集至離心管，以1000 r/min離心5 min，棄上清，加入RPMI 1640培養(yǎng)液，稀釋至2.5×107個(gè)/mL，吹打混勻配置成單細(xì)胞懸液。取單細(xì)胞混懸液，于無(wú)菌環(huán)境中在裸鼠背側(cè)近右前肢處進(jìn)行皮下接種，每只裸鼠接種0.2 mL(約5×106個(gè)/只)，每日觀察瘤體生長(zhǎng)情況，于接種后5 d，測(cè)量移植瘤直徑，選取直徑在3～5 mm的入組，隨機(jī)將其分成空白組和IL-17-siRNA組，每組6只。采用瘤體皮下注射300 μL慢病毒(購(gòu)于上海吉瑪基因公司)的方式干預(yù)IL-17表達(dá)，濃度滴度為1×109TU/mL。每隔2天測(cè)量腫瘤體積，計(jì)算公式為：V=0.5236×L(長(zhǎng)度)×W2(寬度)。3周后頸椎脫臼法處死裸鼠，分離腫瘤組織，測(cè)量腫瘤的體積。取每組均數(shù)制作腫瘤生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)?zāi)?，統(tǒng)一以10%水合氯醛3 mL/kg麻醉小鼠，剝離皮下腫瘤結(jié)節(jié)稱瘤重。

1.2 ELISA法測(cè)量血清炎癥因子的含量

取血清，以ELISA試劑盒檢測(cè)其炎癥因子的含量。根據(jù)試劑盒(購(gòu)于南京建成生物科技有限公司)的說(shuō)明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在酶標(biāo)包被板上依次加入50 μL的梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品。設(shè)置空白孔和樣品孔，其中空白孔不加樣品和抗體。在待測(cè)樣品孔中加入血清樣品40 μL，然后再加10 μL生物素標(biāo)記的抗體。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，但空白孔不加。封板后于37℃中靜置30 min。將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋后備用。揭掉封板膜，倒掉液體，甩干后加滿洗滌液，靜置30 s后倒掉，重復(fù)洗滌5次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10 min后，迅速向每孔滴加50 μL終止液，用酶標(biāo)儀讀取吸光度值。

1.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平

常規(guī)石蠟切片脫蠟，梯度乙醇水化，PBS沖洗2 min×3次，采用蛋白酶K(0.02 g/L，10 mmol/L Tris/HCl，pH=7.4～8.0)，21 ℃～37 ℃消化15～30 min，PBS沖洗2 min×3次，加入25 μL TUNEL反應(yīng)液，37℃作用60 min，PBS沖洗3 min×3次，滴加25～50 μL的AP抗體，37℃作用30 min，PBS沖洗3 min×3次，滴加BCIP/NBT，37℃作用20 min，PBS沖洗3 min×3次，復(fù)染，封片，烘干。鏡下觀察切片，細(xì)胞核染成深棕色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。

1.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白含量

按照蛋白提取試劑盒(購(gòu)于南京建成生物科技有限公司)說(shuō)明書，提取腫瘤組織總蛋白檢測(cè)IL-17、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的表達(dá)水平。BCA蛋白定量后上樣，60 V，10% SDS-PAGE凝膠電泳1.5 h，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中轉(zhuǎn)膜30 min，TBS封閉液封閉1 h，5%脫脂奶粉25℃封閉1 h，4℃下分別孵育IL-17、STAT3、p-STAT3一抗過(guò)夜，TBST洗10 min×3次，25℃孵育二抗1 h，TBST洗10 min×3次，曝光顯影，采用BIO-RAD Image Lab軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.5 免疫組化染色

將玻片置于500 mL的檸檬酸鈉緩沖液(0.01 mol/L，pH6.0)中，加熱至持續(xù)沸騰10 min，冷卻后，PBS洗滌5 min，重復(fù)洗滌3次。H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶15 min，PBS沖洗。加0.2%的Triton X-100通透10 min。滴加10%山羊血清封閉，室溫孵育20 min。然后滴加抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)抗體和CD34抗體(稀釋比例1∶500)，陰性對(duì)照滴加PBS，4℃過(guò)夜。PBS洗滌3次，每次5 min。滴加VEGF和CD34二抗試劑，室溫孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min。滴加DAB顯色，在鏡下觀察，當(dāng)顯色發(fā)生變化時(shí)，立即將玻片浸泡在去離子水中。下一步進(jìn)行核染。在蘇木精溶液中染色4 min，在去離子水中浸泡1 min。室溫晾干載玻片，浸泡二甲苯透明，中性樹膠封片。晾干后在顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-17-siRNA抑制腫瘤的生長(zhǎng)

測(cè)量所得腫瘤的體積見圖1。兩組的腫瘤體積均隨時(shí)間逐漸增加。和對(duì)照組比較，IL-17-siRNA組的腫瘤體積在第5、7、9、11天時(shí)無(wú)顯著性變化(均P>0.05)，在第17、19、21天時(shí)，IL-17-siRNA組的腫瘤體積均顯著小于對(duì)照組(均P<0.05)，見圖1A。在第21天時(shí)，兩組的腫瘤體積見圖1B。

2.2 IL-17-siRNA促進(jìn)細(xì)胞凋亡

通過(guò)TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并分析兩組腫瘤組織中細(xì)胞的凋亡率，見圖2。和對(duì)照組比較，IL-17-siRNA組腫瘤組織中棕黃色明顯增加，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖1 兩組腫瘤體積及其增長(zhǎng)曲線Fig.1 Tumor volume and its growth curve in two groups

A：對(duì)照組；B：IL-17-siRNA組；與對(duì)照組比較，*P<0.05圖2 TUNEL法檢測(cè)IL-17對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of IL-17 on apoptosis of tumor cells

2.3 IL-17-siRNA對(duì)炎癥因子的影響

通過(guò)ELISA檢測(cè)血清中IL-4、IL-17、IFN-γ和TNF-α等炎癥因子的水平，見圖3。和對(duì)照組比較，IL-17-siRNA組的血清IL-4、IL-17、IFN-γ、TNF-α水平顯著降低，均P<0.05。

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖3 各組血清中炎癥因子的表達(dá)變化Fig.3 Expression of inflammatory factors in serum of the two groups

2.4 IL-17-siRNA相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot檢測(cè)腫瘤組織中p-JAK、JAK、p-STAT3、STAT3、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白的表達(dá)，見圖4。和對(duì)照組比較，IL-17-siRNA組腫瘤組織中p-JAK和p-STAT3蛋白表達(dá)顯著降低，Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9的表達(dá)顯著升高(均P<0.05)；JAK和STAT3的蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(均P>0.05)。

A：Western blot印跡圖；B：Western blot統(tǒng)計(jì)結(jié)果；與對(duì)照組比較，*P<0.05圖4 IL-17對(duì)腫瘤組織中p-JAK、JAK、p-STAT3、STAT3、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of IL-17 on protein p-JAK，JAK，p-STAT3，STAT3，Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9 in tumor tissues

2.5 IL-17-siRNA抑制VEGF-A和CD34的表達(dá)

通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組腫瘤組織中VEGF-A和CD34的表達(dá)情況，見圖5。和對(duì)照組比較，IL-17-siRNA組腫瘤組織中棕黃色信號(hào)減弱，VEGF-A和CD34表達(dá)降低。

圖5 IL-17對(duì)腫瘤組織中VEGF-A和CD34表達(dá)的影響Fig.5 Effect of IL-17 on VEGF-A and CD34 expression in tumor tissues

3 討論

IL-17是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，由T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生，其靶細(xì)胞分布廣泛。IL-17具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞、促進(jìn)多種細(xì)胞釋放炎性因子、促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，被認(rèn)為參與了機(jī)體多種炎癥疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等的發(fā)生。目前多項(xiàng)臨床研究顯示，在胃癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等患者外周血或腫瘤組織中可檢測(cè)出IL-17表達(dá)水平增高，且其水平與腫瘤的惡性程度相關(guān)，但其促進(jìn)腫瘤發(fā)生的機(jī)制尚未明確[4-6]。近年來(lái)隨著基礎(chǔ)研究的深入，發(fā)現(xiàn)IL-17可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管生成及干擾腫瘤免疫等機(jī)制發(fā)揮了促瘤作用。Rafa等[7]研究證明，在卵巢癌組織中，IL-17 mRNA的表達(dá)顯著高于正常組織，且IL-17陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤組織微血管密度顯著高于IL-17陰性表達(dá)的正常組織；在接種了含IL-17 cDNA的重組腫瘤細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)該腫瘤組織的血管密度明顯增多[8-10]；而腫瘤血管密度增高是血管生成活化的顯著表現(xiàn)，從而證明IL-17是通過(guò)促進(jìn)血管生成作用達(dá)到促瘤作用的；且可能是通過(guò)促進(jìn)VEGF的高表達(dá)來(lái)促進(jìn)血管的生成[11]。本研究通過(guò)移植人上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞建立裸鼠皮下成瘤模型，敲降IL-17后，結(jié)果顯示IL-17-siRNA組的腫瘤體積增加速率顯著低于對(duì)照組，且細(xì)胞凋亡率顯著升高，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)顯著升高，這表明敲降IL-17對(duì)裸鼠卵巢腫瘤的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用。

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是卵巢癌患者死亡的重要原因，血管新生為侵襲和轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)，在此過(guò)程中起關(guān)鍵作用，VEGF是目前已知最強(qiáng)的血管通透劑，它能導(dǎo)致癌性腹水或腫瘤間質(zhì)水腫，而且導(dǎo)致血漿、纖維等蛋白向血管外滲出，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的改變，從而促進(jìn)血管的形成，是與惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和腹水形成相關(guān)的重要生長(zhǎng)因子之一[4，12]。IL-17-siRNA組的VEGF-A表達(dá)顯著降低，提示敲降IL-17基因可能抑制VEGF-A的表達(dá)，抑制血管的生成，減緩卵巢癌細(xì)胞的遷移。

STAT3是STATs家族成員之一，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，被激活后轉(zhuǎn)入核內(nèi)和相應(yīng)DNA結(jié)合，引發(fā)靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄。STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活后，作用于特異的DNA片段，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[13-15]。STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了細(xì)胞的增殖、分化和凋亡的過(guò)程。STAT3的異?；罨梢鸺?xì)胞異常分化和增殖，并抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤的形成。且有研究發(fā)現(xiàn)，STAT3在許多惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，如胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等常見腫瘤[16-20]。STAT3參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，也參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖活動(dòng)。和對(duì)照組比較，IL-17-siRNA組的p-STAT3表達(dá)顯著降低，提示敲降IL-17基因可能抑制STAT3的磷酸化，減緩卵巢癌的發(fā)展。

綜上，敲降IL-17基因可能通過(guò)抑制IL-17-STAT3信號(hào)通路，抑制VEGF-A的表達(dá)，抑制卵巢腫瘤細(xì)胞的遷移，促進(jìn)腫瘤組織細(xì)胞凋亡，減緩卵巢癌的發(fā)展。