劉 迪, 龍 謙，羅 猛，胡 劍，陳 臣，裴登科

貴州省人民醫(yī)院胸外科,貴陽 550002

肺癌是來源于支氣管黏膜上皮的惡性腫瘤，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，約占全部肺癌的85%左右[1]。盡管近年來NSCLC的靶向治療取得了很大進(jìn)步，但以含鉑藥物為主的聯(lián)合化療仍然是中晚期NSCLC的主要治療手段[2]，然而，由于腫瘤對(duì)鉑類等化療藥物產(chǎn)生耐藥，NSCLC患者5年總生存率不超過15%[3]。

NSCLC對(duì)順鉑耐藥的具體機(jī)制目前尚不十分明確。PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的過度激活，可導(dǎo)致NSCLC對(duì)抗化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡作用，從而產(chǎn)生耐藥效應(yīng)[4]。此外，ERK1/2信號(hào)通路可介導(dǎo)抗凋亡作用[5]，從而在以鉑類藥物為主的腫瘤耐藥發(fā)展過程中起到至關(guān)重要的作用[6]。順鉑造成的DNA損傷，可通過核苷酸切除修復(fù)途徑來修復(fù)，而切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross-complementation group 1，ERCC1)是DNA修復(fù)系統(tǒng)中的一個(gè)關(guān)鍵基因，Newton等[7]研究發(fā)現(xiàn)ERCC1的過表達(dá)與NSCLC的順鉑耐藥有關(guān)。

骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種分泌型磷酸化糖蛋白，OPN通過激活腫瘤細(xì)胞中PI3K/AKT和ERK1/2信號(hào)通路上調(diào)NF-κB的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移[8]。目前尚不清楚OPN是否參與調(diào)控NSCLC對(duì)順鉑的耐藥。此外，ERCC1的表達(dá)受內(nèi)源和外源的多種因素影響，OPN是否能通過上調(diào)ERCC1基因的表達(dá)而增加NSCLC對(duì)順鉑的耐藥值得進(jìn)一步研究。本研究選用NSCLC A549細(xì)胞系，構(gòu)建OPN過表達(dá)細(xì)胞及OPN沉默細(xì)胞，探討OPN是否能夠通過PI3K/AKT及ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)NSCLC對(duì)順鉑的耐藥。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

NSCLC A549細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)BI公司，Opti-MEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，U0126購(gòu)自美國(guó)MedChem Express公司，LY294002購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，循環(huán)測(cè)序試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo-Fisher公司，20× Lumiglo Reagen購(gòu)自美國(guó)CST公司，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物公司，細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京普利萊公司，PMSF購(gòu)自北京Solarbio公司，PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Western blot用抗體如下：ERK1/ERK2(ab17942)、PI3K(ab191606)、ERCC1(ab129267)購(gòu)自美國(guó)ABCAM公司，GAPDH(TA-08)、羊抗鼠IgG(ZB-2305)、羊抗兔IgG(ZB-2301)購(gòu)自北京中杉金橋公司。實(shí)驗(yàn)主要儀器為ABI PCR儀，BD FACS流式細(xì)胞儀，BIO-RAD超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 OPN過表達(dá)載體及沉默載體的構(gòu)建 根據(jù)OPN基因的CDS序列，引入酶切位點(diǎn)(XhoⅠ/BamHⅠ)，合成基因片段(克隆至plvxpuro載體上)，構(gòu)建OPN過表達(dá)載體OPN-plvxpuro。設(shè)計(jì)shRNA靶序列：正義鏈引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，反義鏈引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，退火形成雙鏈，與載體pGreenpuro連接，構(gòu)建慢病毒重組載體shOPN-pGreenpuro，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)質(zhì)粒給予電泳驗(yàn)證。使用Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋Lipofectamine 3000試劑，充分混勻，制備得到脂質(zhì)體-DNA混合物及脂質(zhì)體-shRNA混合物，室溫避光孵育1 h后將脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物、脂質(zhì)體-shRNA混合物體積加入對(duì)應(yīng)孔的細(xì)胞中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞2 d后取出檢測(cè)。MTT法，RT-PCR法鑒定OPN過表達(dá)載體和沉默載體的構(gòu)建，詳細(xì)步驟見參考文獻(xiàn)[9-10]。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 6孔培養(yǎng)板每孔接種1×105個(gè)細(xì)胞，待培養(yǎng)板中細(xì)胞貼壁后加入相關(guān)藥物處理，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞2 d，收集細(xì)胞以Annexin Ⅴ-FITC和PI雙染，室溫避光孵育10 min后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)ERCC1基因表達(dá) 6孔培養(yǎng)板每孔接種1×105個(gè)細(xì)胞，待培養(yǎng)板中細(xì)胞貼壁后加入相關(guān)藥物處理，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞2 d，棄去培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng)液，使用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，計(jì)算RNA純度及濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量，通過逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，設(shè)計(jì)引物序列：ERCC1上游引物：5′-CCGCCAGCAAGGAAGAA-3′，ERCC1下游引物：5′-TGCCGAGGGCTCACAAT-3′。GAPDH上游引物：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′，GAPDH下游引物：5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3′。設(shè)置PCR程序進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，使用2-ΔΔCt方法分析mRNA表達(dá)的相對(duì)差異。

1.2.4 Western blot法檢測(cè) 6孔板中細(xì)胞經(jīng)相關(guān)藥物處理后，吸棄6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，提取細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白裂解液濃度，配置SDS-PAGE凝膠，上樣后電泳，待樣品中溴酚藍(lán)帶接近膠的底部時(shí)，停止電泳。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，洗膜后加一抗，4℃緩搖孵育過夜，洗膜后加二抗，室溫緩搖1 h孵育，洗膜后加顯影液檢測(cè)，對(duì)于目的條帶的分子量及吸光度值采用圖像處理軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 OPN過表達(dá)載體和沉默載體的構(gòu)建

在過夜培養(yǎng)的sh-OPN-pGreenpuro平板上挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶，結(jié)果表明，有陽性點(diǎn)，且條帶與理論值相符，證明載體構(gòu)建正確，詳見圖1A、1B。進(jìn)一步采用RT-PCR法檢測(cè)OPN基因mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，過表達(dá)組的OPN基因表達(dá)明顯升高，詳見圖1C；沉默組的OPN基因表達(dá)明顯下降，詳見圖1D；差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

A：過表達(dá)載體的驗(yàn)證，M：DL2000 marker，1：pGreenpuro，2：sh-OPN-pGreenpuro；B：過表達(dá)載體的驗(yàn)證，M：DL15000 marker，1：OPN-plvxpuro質(zhì)粒，2：OPN-plvxpuro/XhoⅠ/BamHⅠ；C：OPN過表達(dá)載體OPN mRNA表達(dá)水平；D：OPN沉默載體OPN mRNA表達(dá)水平圖1 OPN過表達(dá)載體和沉默載體的驗(yàn)證Fig.1 Validation of plasmids with OPN overexpression and OPN silent plasmids

2.2 OPN對(duì)NSCLC細(xì)胞順鉑耐藥的影響

根據(jù)半數(shù)抑制率實(shí)驗(yàn)，采用順鉑(DDP)4 μmol/L、U0126 5 μmol/L、LY294002 5 μmol/L處理隨后實(shí)驗(yàn)，詳見圖2A。DDP處理細(xì)胞，設(shè)對(duì)照組(Control+DDP)，OPN沉默組(shRNA-OPN+DDP)，OPN過表達(dá)組(OPN+DDP)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，OPN過表達(dá)組的細(xì)胞增殖活性明顯升高，OPN沉默組的細(xì)胞增殖活性明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，詳見圖2B。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明與對(duì)照組相比，OPN沉默組的細(xì)胞凋亡率未見明顯變化，OPN過表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖2C、2D。

2.3 PI3K及ERK1/2通路介導(dǎo)OPN促進(jìn)NSCLC順鉑耐藥

采用Western blot法檢測(cè)PI3K及ERK通路是否介導(dǎo)OPN從而促進(jìn)NSCLC順鉑耐藥，設(shè)對(duì)照組(Control)，OPN沉默組(shRNA-OPN)，OPN過表達(dá)組(OPN)，對(duì)照+順鉑組(Control+DDP)，OPN沉默+順鉑組(shRNA-OPN+DDP)，OPN過表達(dá)+順鉑組(OPN+DDP)，順鉑處理濃度為4 μmol/L。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，OPN過表達(dá)組的PI3K蛋白表達(dá)水平升高，OPN沉默組的PI3K蛋白表達(dá)水平下降，順鉑處理后OPN過表達(dá)組的PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)水平較OPN沉默組高，而ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平，各組無明顯差異，詳見圖3A、3B。

A：不同藥物半數(shù)抑制濃度；B：OPN沉默載體組及過表達(dá)載體組細(xì)胞增殖活性；C：OPN沉默載體組及過表達(dá)載體組細(xì)胞凋亡率；D：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)OPN沉默載體組及過表達(dá)載體組細(xì)胞凋亡情況圖2 OPN與NSCLC細(xì)胞在順鉑作用下的增殖和凋亡Fig.2 Correlation between OPN and cisplatin resistance in NSCLC

1：Control，2：shRNA-OPN，3：OPN，4：Control+DDP，5：shRNA-OPN+DDP，6：OPN+DDP；A：各組細(xì)胞PI3K和ERK1/2蛋白的表達(dá)水平；B：各組細(xì)胞PI3K和ERK1/2蛋白磷酸化水平圖3 各組細(xì)胞PI3K和ERK1/2蛋白表達(dá)及其磷酸化的水平Fig.3 Expression levels of PI3K and ERK1/2 proteins and their phosphorylation in each group

2.4 阻斷ERK1/2信號(hào)通路對(duì)OPN調(diào)節(jié)NSCLC順鉑耐藥的影響

使用ERK1/2信號(hào)通路抑制劑U0126，阻斷OPN下游ERK1/2信號(hào)通路，順鉑處理濃度為4 μmol/L，設(shè)對(duì)照+順鉑組(Control+DDP)，OPN沉默+順鉑組(shRNA-OPN+DDP)，OPN過表達(dá)+順鉑組(OPN+DDP)，設(shè)U0126+順鉑組(U0126+DDP)，OPN沉默+U0126 +順鉑組(shRNA-OPN+U0126+DDP)，OPN過表達(dá)+U0126+順鉑組(OPN+U0126+DDP)，對(duì)照+U0126+順鉑組(Control+U0126+DPP)進(jìn)行對(duì)比研究，U0126處理濃度為5 μmol/L。通過MTT及流式細(xì)胞術(shù)觀察腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡，結(jié)果表明各組間細(xì)胞增殖活性的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖4A，各組細(xì)胞凋亡率比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖4B、4C。

2.5 阻斷PI3K通路對(duì)OPN調(diào)節(jié)NSCLC順鉑耐藥的影響

使用PI3K通路LY294002，阻斷OPN下游PI3K通路，順鉑處理濃度為4 μmol/L，設(shè)對(duì)照+順鉑組(Control+DDP)，對(duì)照+LY294002+順鉑組(Control+LY294002+DDP)，OPN過表達(dá)+順鉑組(OPN+DDP)，OPN過表達(dá)+LY294002+順鉑組(OPN+LY294002+DDP)、OPN沉默+順鉑組(shRNA-OPN+DDP)，OPN沉默+LY294002 +順鉑組(shRNA-OPN+LY294002+DDP)，進(jìn)行對(duì)比研究，LY294002處理濃度為5 μmol/L。通過MTT及流式細(xì)胞術(shù)觀察腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡，結(jié)果表明：細(xì)胞增殖活性比較，對(duì)照+LY294002+順鉑組增殖率較對(duì)照+順鉑組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組與對(duì)照+順鉑組比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，詳見圖5A。細(xì)胞凋亡率比較，對(duì)照+LY294002+順鉑組、shRNA-OPN+LY294002+順鉑組凋亡率較對(duì)照+順鉑組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其余各組與對(duì)照+順鉑組比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，詳見圖5B、5C。

1：Control+DDP，2：shRNA-OPN+DDP，3：OPN+DDP，4：U0126+DDP，5：shRNA-OPN+U0126+DDP，6：OPN+U0126+DDP；A：U0126處理后各組細(xì)胞增殖活性；B：U0126處理后各組細(xì)胞凋亡率；C：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U0126處理后各組細(xì)胞凋亡情況圖4 U0126對(duì)OPN調(diào)節(jié)NSCLC順鉑耐藥的影響Fig.4 Effects of U0126 on OPN regulation of cisplatin resistance in NSCLC

1：Control+DDP，2：Control+LY294002+DDP，3：OPN+DDP，4：OPN+LY294002+DDP，5：shRNA-OPN+DDP，6：shRNA-OPN+LY294002+DDP；A：LY294002處理后各組細(xì)胞增殖活性；B：LY294002處理后各組細(xì)胞凋亡率；C：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LY294002處理后各組細(xì)胞凋亡情況圖5 LY294002對(duì)OPN調(diào)節(jié)NSCLC順鉑耐藥的影響Fig.5 Effects of LY294002 on OPN regulation of cisplatin resistance in NSCLC

2.6 ERCC1表達(dá)在OPN促進(jìn)NSCLC順鉑耐藥中的作用

采用RT-PCR法檢測(cè)ERCC1基因，設(shè)對(duì)照組(Control)，OPN沉默組(shRNA-OPN)，OPN過表達(dá)組(OPN)，對(duì)照+順鉑組(Control+DDP)，OPN沉默+順鉑組(shRNA-OPN+DDP)，OPN過表達(dá)+順鉑組(OPN+DDP)，順鉑處理濃度為4 μmol/L。結(jié)果表明，OPN過表達(dá)組的ERCC1 mRNA表達(dá)明顯升高，OPN沉默組的細(xì)胞ERCC1 mRNA表達(dá)明顯下降，與對(duì)照+順鉑組相比，OPN過表達(dá)+順鉑組的ERCC1 mRNA表達(dá)明顯升高，OPN沉默+順鉑組的細(xì)胞ERCC1 mRNA表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，詳見圖6A。進(jìn)一步采用Western blot法檢測(cè)ERCC1蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，OPN過表達(dá)組的ERCC1蛋白表達(dá)水平升高，OPN沉默組的ERCC1蛋白表達(dá)水平下降，順鉑處理后，OPN過表達(dá)組的ERCC1蛋白表達(dá)水平較OPN沉默組高，詳見圖6B。

1：Control；2：shRNA-OPN；3：OPN；4：Control+DDP；5：shRNA-OPN+DDP；6：OPN+DDP；A：各組細(xì)胞ERCC1 mRNA表達(dá)水平；B：各組細(xì)胞ERCC1蛋白表達(dá)水平圖6 ERCC1 mRNA與蛋白在各組細(xì)胞的表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of ERCC1 mRNA and ERCC1 protein in each group

3 討論

順鉑是一種細(xì)胞周期非特異性的細(xì)胞毒性藥物，目前臨床治療NSCLC仍采用以順鉑為主的聯(lián)合化療方案。然而NSCLC在使用順鉑治療時(shí)，易產(chǎn)生耐藥，腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后較差。OPN是具有分泌功能的磷酸化糖蛋白，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]。OPN在肺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達(dá)水平增高。研究表明，OPN表達(dá)水平增高能夠促進(jìn)NSCLC的侵襲、遷移和生長(zhǎng)，OPN能夠通過Bcl-2蛋白增強(qiáng)NSCLC的抗凋亡作用[12]，此外通過抗體抑制OPN的表達(dá)水平能夠促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡[13]。本項(xiàng)研究中，我們采用脂質(zhì)體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，構(gòu)建OPN過表達(dá)細(xì)胞及OPN沉默細(xì)胞，研究OPN與NSCLC順鉑耐藥的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑處理后，OPN過表達(dá)組細(xì)胞增殖活性明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯下降，提示OPN過表達(dá)增強(qiáng)了NSCLC細(xì)胞在順鉑處理時(shí)的抗凋亡活性及增殖能力，降低NSCLC細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

盡管高表達(dá)OPN能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥，但是其信號(hào)通路及分子機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，ανβ3整合素、CD44受體能夠與OPN相互作用，進(jìn)而激活多條信號(hào)通路，發(fā)揮影響腫瘤細(xì)胞間粘附、抑制細(xì)胞凋亡、重構(gòu)腫瘤細(xì)胞骨架等作用[14]，而PI3K/AKT、ERK1/2信號(hào)通路為OPN下游整合素的主要下游通路。此外肺癌患者EGFR、AKT1、KRAS等基因發(fā)生突變進(jìn)一步導(dǎo)致患者PI3K/AKT信號(hào)通路過度活化，致使肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥，PI3K/AKT信號(hào)通路過度活化的早期NSCLC患者通常預(yù)后較差[15]。而ERK1/2通路異常激活能夠調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的增殖及遷移，進(jìn)一步激活其下游NF-κB信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡促進(jìn)肺癌細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的耐藥[16]。因此我們推測(cè)，OPN有可能通過激活PI3K/Akt、ERK1/2信號(hào)通路引起NSCLC對(duì)順鉑的耐藥。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染OPN表達(dá)載體組的PI3K蛋白表達(dá)水平升高，OPN沉默組的PI3K蛋白表達(dá)水平下降，順鉑處理后OPN過表達(dá)組的PI3K蛋白表達(dá)水平較OPN沉默組高，而ERK1/2蛋白表達(dá)水平各組細(xì)胞無顯著差異。為此我們使用ERK1/2信號(hào)通路抑制劑U0126，阻斷OPN下游ERK1/2信號(hào)通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阻斷ERK1/2信號(hào)通路后，各組細(xì)胞的增殖及凋亡與對(duì)照組比較無顯著差異，提示OPN促進(jìn)NSCLC對(duì)順鉑耐藥的機(jī)制與ERK1/2通路無明顯相關(guān)。我們進(jìn)一步使用PI3K通路抑制劑LY294002，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照+LY294002+順鉑組增殖率較對(duì)照組低，對(duì)照+LY294002+順鉑組、shRNA-OPN+LY294002+DDP組凋亡率較對(duì)照組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，提示OPN促進(jìn)NSCLC對(duì)順鉑耐藥的機(jī)制可能與激活PI3K信號(hào)通路相關(guān)。

多個(gè)研究顯示核苷酸切除修復(fù)途徑中的ERCC1與肺癌鉑類耐藥密切相關(guān)[17]，而ERCC1的表達(dá)受內(nèi)源和外源的多種因素影響。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K通路的活化可受Klotho蛋白影響導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥，而Klotho蛋白能夠調(diào)控ERCC1表達(dá)水平，介導(dǎo)DNA修復(fù)，影響NSCLC細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥[18]。因此我們推測(cè)，OPN過表達(dá)促進(jìn)NSCLC順鉑耐藥的機(jī)制中，除了激活PI3K/AKT信號(hào)通路外，是否同時(shí)存在上調(diào)ERCC1基因的表達(dá)。為此，我們采用PCR及Western blot分別檢測(cè)ERCC1的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OPN沉默導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞中的ERCC1 mRNA和蛋白表達(dá)下降，順鉑處理后OPN過表達(dá)可上調(diào)ERCC1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，提示OPN可能通過上調(diào)ERCC1促進(jìn)NSCLC對(duì)順鉑的耐藥。

綜上所述，我們的研究證明了OPN過表達(dá)可促進(jìn)NSCLC對(duì)順鉑耐藥，OPN在促進(jìn)NSCLC順鉑耐藥過程中扮演著關(guān)鍵角色；明確OPN促進(jìn)NSCLC對(duì)順鉑耐藥的機(jī)制可能是通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路引起，與ERK1/2通路活化無明顯相關(guān)；揭示了OPN過表達(dá)可上調(diào)ERCC1，OPN可能通過PI3K/AKT信號(hào)通路上調(diào)ERCC1促進(jìn)NSCLC對(duì)順鉑的耐藥。但是OPN通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路上調(diào)ERCC1表達(dá)的具體機(jī)制，有待于我們進(jìn)一步的研究。