鄧燕 馬玉嬋 王敏 谷夢(mèng)巧 遲寬能 胡蓉 楊云慧

摘?要?以金納米粒子（Au nanoparticles，AuNPs）功能化的金屬有機(jī)骨架材料（Fe-MOFs，F(xiàn)e-MIL-88-NH2）為基質(zhì)材料，構(gòu)建了雙信號(hào)比率型免疫傳感器，用于C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）的檢測(cè)。八面體結(jié)構(gòu)的Fe-MOFs不僅提供了較大的有效表面積，可增加固定生物分子的量，促進(jìn)電子和離子的傳輸，而且表現(xiàn)出良好的導(dǎo)電性。將AuNPs修飾到Fe-MOFs上可以進(jìn)一步增加比表面積，以捕獲大量抗體以及提高電子轉(zhuǎn)移能力。隨CRP濃度的增加，K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6的氧化峰電流減小，而Fe-MOFs的氧化峰電流相對(duì)恒定。采用K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6響應(yīng)電流與Fe-MOFs的響應(yīng)電流比值作為定量測(cè)定CRP的響應(yīng)信號(hào)。以K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6作為信號(hào)探針（K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6-sP），AuNPs 修飾的Fe-MOFs作為內(nèi)參比探針（Fe-MOFs-rP），這種比率探針將sP和rP整合到一個(gè)結(jié)構(gòu)中，確保了完全相同的修飾條件以及sP和rP在同一個(gè)傳感界面上的相互依賴性，因此具有更強(qiáng)的消除環(huán)境干擾的能力。所構(gòu)建的免疫傳感器線性響應(yīng)范圍為1～200 ng/mL，檢出限為0.3 ng/mL（S/N=3）。此傳感器具有良好的選擇性，有望用于心血管疾病的早期篩查和診斷。本研究為制備檢測(cè)其它生物標(biāo)志物的比率信號(hào)放大傳感器奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?C-反應(yīng)蛋白;金屬有機(jī)骨架材料;比率型電化學(xué)免疫傳感器

1?引 言

心血管疾病是造成人類死亡的主要原因之一。歐洲心臟病學(xué)會(huì)和美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)建議根據(jù)C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）水平范圍評(píng)估患者心血管疾病的嚴(yán)重程度[1，2]。CRP是一種分子量約為120 kDa的急性期炎癥蛋白，主要由肝臟中響應(yīng)白細(xì)胞介素6（IL-6）的刺激而產(chǎn)生。近年來(lái)，許多研究證實(shí)，根據(jù)CRP的測(cè)定可有效預(yù)測(cè)人群中的心血管疾病[3，4]。CRP水平還與炎癥性腸病[5]、結(jié)腸癌[6]有很強(qiáng)的相關(guān)性。所以，臨床醫(yī)生可通過(guò)測(cè)量CRP值了解疾病活動(dòng)。在健康人血清中，CRP的濃度不超過(guò)1 μg/mL，當(dāng)機(jī)體有急性炎癥、冠心病及腫瘤發(fā)生時(shí)，血清中的CRP含量可增加近1000倍[7]。由于人血清基質(zhì)復(fù)雜，且生物標(biāo)志物的濃度較低，因此，發(fā)展靈敏、準(zhǔn)確、快速的CRP檢測(cè)方法在臨床上具有重要意義。

金屬有機(jī)骨架（MOFs）是含有芳香酸或堿的氮、氧多齒有機(jī)配體，通過(guò)配位鍵與無(wú)機(jī)金屬中心雜化自組裝而成的具有立體微孔結(jié)構(gòu)的晶體材料[8，9]。研究表明，相比較于傳統(tǒng)的多孔配位化合物或多孔材料而言，MOFs 晶體材料具有很多獨(dú)特的特征，如超高孔隙率、大的比表面積、良好的熱穩(wěn)定性、均勻的結(jié)構(gòu)以及易于制造和結(jié)構(gòu)可控[10，11]。功能性MOFs已經(jīng)被應(yīng)用在氣體儲(chǔ)存和分離[12]、樣品前處理[13]、癌癥治療[14]、催化[15]、藥物輸送[16]和化學(xué)傳感[17]等領(lǐng)域。由于MOFs的構(gòu)建是通過(guò)金屬單元與有機(jī)連接體連接，因此氧化-還原型MOFs中具有氧化-還原性的金屬離子可以產(chǎn)生較大的電流響應(yīng)。但大多數(shù)MOF材料由于其水溶性差，且棒狀結(jié)構(gòu)限制了電子轉(zhuǎn)移，使其自身的導(dǎo)電性較差。Fe-MIL-88-NH2是一種不規(guī)則的八面體形態(tài)的Fe-MOFs，在水溶液中具有較高的催化活性和穩(wěn)定性，以及良好的生物相容性，可用于生物傳感器的制備[18]。

近年來(lái)，多種比率型電化學(xué)檢測(cè)的“信號(hào)放大”與“信號(hào)減小”策略已用于對(duì)腫瘤標(biāo)志物的定量檢測(cè)[19]。含有不同電活性物質(zhì)的比率型電化學(xué)傳感器具有雙信號(hào)輸出，并可通過(guò)測(cè)量不同氧化還原電位下的雙氧化還原電流峰值強(qiáng)度的比率確定分析物的濃度，可以對(duì)內(nèi)在背景信號(hào)的影響提供內(nèi)置校正，以減少環(huán)境影響和背景噪聲，提供更準(zhǔn)確的信號(hào)，有利于提高電化學(xué)傳感的準(zhǔn)確度和靈敏度[20～22]。比率法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種分析技術(shù)，如熒光、電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光[23～25]。

本研究構(gòu)建了雙信號(hào)比率型電化學(xué)免疫傳感器，采用金納米粒子（AuNPs）功能化的Fe-MIL-88-NH2作為基質(zhì)材料，利用AuNPs和抗體中的巰基形成金硫鍵固定CRP抗體，F(xiàn)e-MOFs可以產(chǎn)生較大的電流響應(yīng)，作為內(nèi)部參考探針（Fe-MOFs-rP）;而K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6作為信號(hào)探針（K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6-sP），設(shè)計(jì)了一種新穎的雙信號(hào)比率型電化學(xué)非標(biāo)記免疫傳感策略。AuNPs被修飾到Fe-MOFs中，增加材料的電導(dǎo)率，以促進(jìn)電子的轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步提高所制備的生物傳感器的靈敏度。此策略將Fe-MOFs-rP和K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6-sP組合作為比率測(cè)定探針，可以確保完全相同的修飾條件和Fe-MOF-rP和K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6-sP之間的直接相互依賴關(guān)系，顯著減少環(huán)境干擾。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

使用CHI660D電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量，采用三電極體系（玻碳電極（GCE）、飽和甘汞電極、鉑絲輔助電極）;CS501超級(jí)恒溫器（重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）;?ST2200HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）;?ME104E電子分析天平（博特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;TGL16離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）;VTX-E混旋儀（倍捷科技公司）;DZF-6020型真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）;TTRⅢ型X射線衍射儀（日本理學(xué)公司）;JEM2100透射電鏡（日本電子株式會(huì)社）;掃描電子顯微鏡（日本Hitachi Science Systems公司）。

C-反應(yīng)蛋白（CRP）與C-反應(yīng)蛋白抗體（anti-CRP）購(gòu)于上海領(lǐng)潮生物科技有限公司;2-氨基對(duì)苯二甲酸（C8H7NO4，武漢阿瑞斯生物科技有限公司）;?FeCl3·6H2O（上海江富實(shí)業(yè)有限公司）;HAuCl4·3H2O（上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司）;乙醇（C2H5OH）、檸檬酸三鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）;谷氨酸（L-Glutamic acid，Glu）、甘氨酸（Glycine，Gly）、癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）、殼聚糖（Chitosan，CHIT）、牛血清蛋白（Bovine serum albumin;BSA）、磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer solution，PBS，pH 7.4）均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;K3[Fe（CN）6]、K4[Fe（CN）6]·3H2O、KCl（天津大茂化學(xué)試劑科技有限公司）;?N，N二甲基甲酰胺（DMF，天津津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠）。除特殊說(shuō)明外，所使用的試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（電阻>18 M Ω·cm）。人血清樣品由云南師范大學(xué)校醫(yī)院提供（所有實(shí)驗(yàn)均在相關(guān)法律規(guī)定要求下進(jìn)行）。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?Fe-MOFs（ Fe-MIL-88 NH2）的合成?參照文獻(xiàn)[26]的方法合成Fe-MIL-88 NH2。稱取0.126 g 2-氨基對(duì)苯二甲酸和0.187 g FeCl3·6H2O置于三頸燒瓶中，加入15 mL DMF，超聲數(shù)分鐘，使其分散均勻。在攪拌的條件下，取197 μL乙酸加入到上述混合溶液中。然后，將混合溶液于120℃油浴4 h 以結(jié)晶，冷卻到室溫后，分別用DMF和無(wú)水乙醇離心洗滌3次（8000 r/min，5 min）。最后，將所得樣品在真空干燥箱中60℃干燥12 h，得到紅棕色晶體。

2.2.2?CRP傳感器的制備?將玻碳電極用金相砂紙和不同粒徑的Al2O3拋光粉依次打磨成鏡面后，分別用50% （V/V） HNO3、乙醇、超純水超聲洗滌5 min，自然晾干。取8 mg Fe-MIL-88-NH2分散到2 mL滅菌水中，超聲處理得到分散液。將10 μL 0.5%（w/V）殼聚糖-分散液（1∶1，V/V）的混合液滴加到處理過(guò)的玻碳電極表面，自然晾干。根據(jù)文獻(xiàn)[27]報(bào)道的方法制備金納米溶膠。滴加20 μL 1% 金納米溶膠，使金納米顆粒（AuNPs）吸附在Fe-MOFs（Fe-MIL-88-NH2）上，用PBS溶液沖洗，晾干后，再滴加10 μL 60 μg/mL CRP抗體（anti-CRP），于4℃保存過(guò)夜，干燥，將抗體固定在AuNPs/Fe-MIL-88-NH2上。用PBS緩沖溶液沖洗電極，自然晾干后，再滴加10 μL 1%（w/V）BSA，在37℃恒溫培育1 h，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。繼續(xù)用PBS緩沖溶液沖洗，自然晾干后，與不同濃度的C-反應(yīng)蛋白抗原孵育 30 min，可制得CRP免疫傳感器。其制備流程如圖1所示。

2.2.3?CRP的電化學(xué)檢測(cè)

在制備好的傳感器上滴加10 μL不同濃度的CRP抗原進(jìn)行孵育，將修飾好的電極浸入10 mL含有5 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6和0.1 mol/L KCl 溶液中，檢測(cè)電活性探針的差分脈沖（ Differential pulse voltammetry，DPV）信號(hào)，電壓范圍0.2～1.2 V，振幅50 mV，脈沖寬度0.05 s，脈沖周期0.1 s。采用K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6響應(yīng)電流與Fe-MOFs的響應(yīng)電流比值作為定量測(cè)定CRP的響應(yīng)信號(hào)。

3?結(jié)果與討論

3.1?材料的表征

3.1.1?Fe-MIL-88-NH2和AuNPs/Fe-MIL-88-NH2的微觀形貌?圖2A和2B均為Fe-MIL-88-NH2的透射電鏡圖，可見(jiàn)所合成的Fe-MIL-88-NH2 顯示出不規(guī)則的八面體結(jié)構(gòu)，其平均直徑約為200 nm，與文獻(xiàn)[28]報(bào)道一致。圖2C和2D 為AuNPs/Fe-MIL-88-NH2的透射電鏡圖，可以發(fā)現(xiàn)，由于AuNPs與氨基具有強(qiáng)烈的吸附能力，平均直徑約為5～10 nm的AuNPs被均勻分散到Fe-MIL-88-NH2上。

3.1.2?Fe-MIL-88-NH2的粉末-X 射線衍射（XRD）表征?對(duì)合成的Fe-MIL-88-NH2材料進(jìn)行了XRD表征，并與文獻(xiàn)中的標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較。圖3中曲線a為本研究合成的材料的XRD圖譜，曲線b是文獻(xiàn)[18]中Fe-MIL-88-NH2的XRD圖譜。曲線a在11.10°處有很強(qiáng)的特征峰，與文獻(xiàn)[27]報(bào)道的結(jié)果一致。XRD的表征結(jié)果說(shuō)明成功合成了Fe-MIL-88-NH2材料且結(jié)晶度較好。

3.2?Fe-MIL-88-NH2和AuNPs對(duì)免疫傳感器的信號(hào)放大作用

為了考察Fe-MIL-88-NH2和AuNPs對(duì)響應(yīng)信號(hào)的放大作用，測(cè)定了有無(wú)AuNPs和Fe-MIL-88-NH2修飾電極在K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6溶液中的差分脈沖響應(yīng)（圖4）。曲線a為通過(guò)戊二醛將抗體固定在殼聚糖修飾的電極上的DPV響應(yīng)，此時(shí)只有K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6的氧化峰（0.2 V）。曲線b為抗體通過(guò)戊二醛被固定在Fe-MIL-88-NH2 /殼聚糖修飾的電極上的DPV響應(yīng)，與曲線a相比，在0.9 V處新出現(xiàn)了一個(gè)Fe-MOF（Fe-MIL-88-NH2）峰，并且K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6在0.2 V的電化學(xué)信號(hào)明顯增強(qiáng)，這是因?yàn)镕e-MIL-88-NH2對(duì)K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6的氧化還原反應(yīng)有一定的催化作用，因此響應(yīng)信號(hào)被放大。曲線c為抗體固定在AuNPs/Fe-MIL-88-NH2/殼聚糖修飾的電極上的響應(yīng)信號(hào)，與沒(méi)有AuNPs（曲線b）相比，信號(hào)明顯增強(qiáng)，這是由于AuNPs與Fe-MIL-88-NH2對(duì)K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6的氧化還原反應(yīng)具有協(xié)同催化作用，從而使響應(yīng)信號(hào)增強(qiáng)。Fe-MOF可以作為導(dǎo)電基質(zhì)，有效降低復(fù)合材料的電子轉(zhuǎn)移阻力，AuNPs可以降低MOFs的尺寸，有利于增加復(fù)合材料的活性位點(diǎn)和比表面積。AuNPs-Fe-MOF獨(dú)特的異質(zhì)結(jié)構(gòu)有助于加快工作電極與溶液中K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6之間的電子轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步改善Fe-MOF的電催化性能。

為了考察在0.9 V處新出現(xiàn)的Fe-MOF（Fe-MIL-88-NH2）峰是鐵離子還是配體2-氨基對(duì)苯二甲酸產(chǎn)生的，將配體溶解于滅菌水中（2 mg/mL），與殼聚糖混合滴在玻碳電極上，在PBS中進(jìn)行DPV測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖5。在0.9 V處有一個(gè)氧化峰，說(shuō)明圖4中Fe-MOF的峰是2-氨基對(duì)苯二甲酸產(chǎn)生的。

3.3?氧化還原峰電流與掃描速度的關(guān)系

在含有5 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6和0.1 mol/L KCl 溶液中考察了掃描速度對(duì)免疫傳感器電化學(xué)行為的影響。如圖6所示，在20～140 mV/s范圍內(nèi)，隨著掃描速度的增加，氧化還原峰電流增大，而且氧化還原峰電流值與掃描速度的平方根呈線性關(guān)系（圖6內(nèi)插圖），說(shuō)明傳感器的電流受擴(kuò)散控制，此電化學(xué)過(guò)程是可逆過(guò)程。

3.4?不同修飾電極界面的交流阻抗行為和循環(huán)伏安行為分析

在5 mmoL/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6和0.1 mol/L KCl 溶液中，采用電化學(xué)交流阻抗（EIS）和循環(huán)伏安法考察了不同電極修飾界面的電化學(xué)行為。圖7A為不同修飾電極的電化學(xué)阻抗譜，內(nèi)插圖為EIS模型的等效電路圖。等效電路包含Warburg阻抗（ZW）、電荷轉(zhuǎn)移電阻（Rct，大小相當(dāng)于高頻區(qū)阻抗曲線的半圓直徑）、溶液電阻（Rs，阻抗曲線的直線部分）和雙層電容（Cd1）。理想情況下，Rs和Zw不受電極表面的影響，因?yàn)樗鼈兇硖结樀臄U(kuò)散和溶液的特性[29]。

在圖7A的阻抗譜中，曲線a為裸玻碳電極（GCE），接近一條直線，說(shuō)明電子傳遞幾乎沒(méi)有阻礙，修飾Fe-MIL-88-NH2 /CHIT的玻碳電極由于覆蓋了Fe-MIL-88-NH2和殼聚糖，阻礙了電子的傳遞，阻抗增加（Rct=1100 Ω）（圖7A曲線b）;修飾了AuNPs/Fe-MIL-88 NH2/CHIT的玻碳電極，

由于AuNPs比表面積大、催化效率高、傳導(dǎo)電子的能力強(qiáng)，從而使電極阻抗值減?。≧ct=600 Ω）（圖7A曲線c）;圖7A曲線d為抗體固定在AuNPs/Fe-MIL-88 NH2/CHIT/GCE的Nyquist曲線，由于CRP抗原與CRP抗體的特異性結(jié)合，使得電極表面的傳質(zhì)阻力增大，阻抗值增加（Rct=1400 Ω）;使用1%BSA封閉anti-CRP/AuNPs/Fe-MIL-88-NH2/CHIT/GCE電極表面的非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，電極阻抗值進(jìn)一步增加（Rct=1900 ?Ω）（圖7A曲線e）;在anti-CRP/AuNPs/Fe-MIL-88 NH2/CHIT/GCE孵育CRP抗原后，阻抗又進(jìn)一步增加（Rct=4800 ?Ω）（圖7A曲線f），說(shuō)明抗原與抗體特異性結(jié)合后形成絕緣的免疫復(fù)合物，阻礙K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6電子傳遞。交流阻抗實(shí)驗(yàn)與循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，說(shuō)明傳感器構(gòu)建成功。

圖7B為不同電極的循環(huán)伏安曲線。裸GCE（圖7B曲線a）呈現(xiàn)一對(duì)氧化還原峰，為探針[Fe（CN）6]3/4的電化學(xué)氧化還原峰;修飾Fe-MIL-88-NH2 /CHIT的GCE，電極的峰電流降低（圖7B曲線b），說(shuō)明Fe-MIL-88-NH2被很好地固定在電極表面，阻礙了電子的傳遞;在GCE 上修飾AuNPs/Fe-MIL-88 NH2/CHIT后，由于AuNPs比表面積大、催化效率高、傳導(dǎo)電子的能力強(qiáng)，峰電流相應(yīng)增加（圖7B曲線c）;進(jìn)一步將抗體固定在AuNPs/Fe-MIL-88 NH2/CHIT/GCE上，由于CRP抗原與CRP抗體的特異性結(jié)合，阻礙了K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6的電子傳遞，峰電流值降低（圖7B曲線d），也說(shuō)明抗體被固定在電極表面;使用1%BSA封閉anti-CRP/AuNPs/Fe-MIL-88-NH2/CHIT/GCE電極表面的非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，峰電流值進(jìn)一步降低（圖7B曲線e）。將anti-CRP/AuNPs/Fe-MIL-88 NH2/CHIT/GCE CRP與抗原孵育后，峰電流信號(hào)值最低（圖7B曲線f），說(shuō)明抗原與抗體特異性結(jié)合后形成絕緣的免疫復(fù)合物，阻礙K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6電子傳遞。這與循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)與交流阻抗實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，說(shuō)明傳感器構(gòu)建成功。

3.5?實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

3.5.1?固定抗體濃度對(duì)免疫傳感器的影響?考察了免疫傳感器在不同固定抗體濃度（20、40、60、80和100 μg/mL）下的電流比值。由圖8可見(jiàn)，傳感器響應(yīng)電流的比值隨著固定抗體濃度的增加而變小，當(dāng)抗體濃度為60 μg/mL時(shí)，響應(yīng)電流的比值最小，之后響應(yīng)電流又隨固定抗體濃度的增加而增加。由于本實(shí)驗(yàn)為信號(hào)減小型，響應(yīng)電流的比值最小時(shí)所對(duì)應(yīng)的固定抗體濃度為最佳。因此，選擇60 μg/mL作為本實(shí)驗(yàn)的最佳固定抗體濃度。

3.5.2?抗體培育時(shí)間對(duì)傳感器響應(yīng)電流比值的影響

在固定60 μg/mL抗體濃度和其它條件不變的情況下，改變抗體培育時(shí)間，通過(guò)測(cè)定K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6響應(yīng)電流與Fe-MOFs（Fe-MIL-88 NH2）響應(yīng)電流比值（IK3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6/IMOFs）的大小，考察抗體培育時(shí)間對(duì)傳感器響應(yīng)電流的影響。由圖9可見(jiàn)，隨著抗體培育時(shí)間延長(zhǎng)，響應(yīng)電流的比值先減小后增加，在10 h時(shí)達(dá)到最小值。所以，最佳抗體培育時(shí)間選擇10 h。

3.5.3?抗原培育時(shí)間對(duì)傳感器電流的影響?固定60 μg/mL抗體濃度，抗體培育時(shí)間為10 h，在其它條件保持不變的情況下，改變抗原培育時(shí)間，通過(guò)測(cè)定K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6響應(yīng)電流與Fe-MOFs（Fe-MIL-88 NH2）響應(yīng)電流比值的大小，考察不同抗原培育時(shí)間對(duì)傳感器的影響。由圖10可知，隨著抗原培育時(shí)間延長(zhǎng)，響應(yīng)電流的比值先增加后減小，在30 min時(shí)達(dá)到最小值后，響應(yīng)電流的比值隨培育時(shí)間的延長(zhǎng)而變大。因此，最佳抗原培育時(shí)間選擇30 min。

3.6?免疫傳感器的校正曲線

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定電極對(duì)不同濃度的CRP抗原的響應(yīng)信號(hào)，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次。結(jié)果如圖11所示，隨著抗原濃度增加，K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6響應(yīng)電流與Fe-MOFs響應(yīng)電流的比值（IK3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6/IMOFs）相應(yīng)減小，且與CRP抗原濃度在1～200 ng/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.9989，線性回歸方程為IK3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6/IMOFs=0.00559C+1.14714，檢出限為0.3 ng/mL（3σ）。

3.7?免疫傳感器的特異性

為了研究此免疫傳感器的特異性，將10 ng/mL CRP抗原分別與100 ng/mL谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、前列腺特異性抗原（PSA）及癌胚抗原（CEA）按體積比1∶1混合。

然后，測(cè)量DPV響應(yīng)電流，并與由CRP抗原產(chǎn)生的響應(yīng)電流進(jìn)行比較。由圖12可知，10倍濃度的干擾物僅引起峰值電流的輕微變化，說(shuō)明谷氨酸、甘氨酸、前列腺特異性抗原和癌胚抗原對(duì)CRP的檢測(cè)幾乎不造成干擾，表明此免疫傳感器具有良好的選擇性。

3.8?免疫傳感器的穩(wěn)定性和重復(fù)性

在5 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6和0.1 mol/L KCl溶液中，傳感器在掃速0.1 V/s下，采用循環(huán)伏安法掃描200圈，電流保持原來(lái)的94.3%，使用3根電極平行測(cè)定3次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%，長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)后未發(fā)現(xiàn)電流有明顯改變，表明此納米復(fù)合材料具有良好的穩(wěn)定性。

3.9?加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

為考察所研制的傳感器對(duì)實(shí)際樣品的測(cè)試性能，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在1%的血清中加入等體積不同濃度的CRP抗原，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表1，加標(biāo)回收率分別為99.80%、99.92%、99.99%，說(shuō)明此傳感器對(duì)CRP的響應(yīng)性能良好，可用于實(shí)際樣品中CRP的測(cè)定。

4?結(jié) 論

基于比率探針，將內(nèi)部參考探針（Fe-MOF-rP）和信號(hào)探針（K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6-sP）組合，形成比率探針，并將其用于構(gòu)建集成的雙信號(hào)非標(biāo)記免疫傳感器。與非比率傳感器相比，比率型電化學(xué)傳感器具有更高的準(zhǔn)確度、靈敏度、穩(wěn)定性和選擇性。本研究使用AuNPs功能化的不規(guī)則的八面體形態(tài)的Fe-MOFs（Fe-MIL-88-NH2）作為固定基質(zhì)，其在水溶液中具有高催化活性、高穩(wěn)定性和良好的生物相容性，有利于生物分子的固定，并可以保持其生物活性。AuNPs/Fe-MIL-88-NH2復(fù)合材料作為電化學(xué)平臺(tái)具有好的性能和較高的靈敏度，用于實(shí)際血清樣品中CRP的測(cè)定，回收率令人滿意。本研究提供了一種新的比率探針，可為臨床上CRP的檢測(cè)提供參考。

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