姜芳燕，韓冰冰，李 語(yǔ)，王輝芳，楊 寧，黃 海

(1.海南熱帶海洋學(xué)院 a.熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 三亞 572022；2.三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院，海南 三亞 572000)

0 引言

長(zhǎng)尾大眼鯛(Priacanthustayenus，Richardson 1846)隸屬于屬鱸形目(Perciformes)，大眼鯛科(Pricanchidae)，大眼鯛屬(Priacanthus)，俗稱(chēng)為紅目連、大眼眶、大眼雞、大眼圈等[1-2]，為暖水性深水魚(yú)類(lèi)，分布于印度洋北部沿岸、東至印度尼西亞、北至中國(guó)，包括南海、臺(tái)灣海峽、東海南部等海域[3]，我國(guó)主要分布于海南、廣東兩地海域.長(zhǎng)尾大眼鯛因其眼睛大而得名，瞳孔的一大半在身體中線的下面.其主要特征為身體呈長(zhǎng)卵圓狀、側(cè)扁，體色多為粉紅色或銀白色而帶粉紅色光澤，頭部大，吻較短，口裂較大，接近垂直，側(cè)線完全，胸鰭短小，各鰭呈粉紅色，且腹鰭布滿(mǎn)黑色斑點(diǎn).長(zhǎng)尾大眼鯛屬于暖水性底層魚(yú)種，肉質(zhì)鮮嫩，含多種氨基酸及粗蛋白、粗脂肪等營(yíng)養(yǎng)成分，為南海北部近海底刺網(wǎng)、拖網(wǎng)漁業(yè)的主要捕撈對(duì)象之一[1-2].由于長(zhǎng)尾大眼鯛良好的凝膠形成能力，現(xiàn)已成為東南亞國(guó)家魚(yú)糜生產(chǎn)的重要魚(yú)類(lèi)[4-5].目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)長(zhǎng)尾大眼鯛的研究主要集中在其生長(zhǎng)分布[2]、骨骼[6]和肌肉營(yíng)養(yǎng)組成[1，5]等方面，而有關(guān)長(zhǎng)尾大眼鯛群體遺傳多樣性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道.線粒體DNA與核DNA相比，具有母系遺傳、變異率高、編碼效率高、進(jìn)化速度快、分子小、無(wú)組織特異性、檢測(cè)方便以及解析能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，而被稱(chēng)為生物體種系發(fā)生的“生物鐘”(molecular clock)，在物種分類(lèi)鑒定、系統(tǒng)學(xué)發(fā)生、遺傳變異以及系統(tǒng)進(jìn)化等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[6-7].其中，細(xì)胞色素c氧化酶亞基I(cytochrome c oxidase subunit I，COI)序列是最常用的遺傳標(biāo)記之一[8]，具有遺傳變異大、進(jìn)化速率適中的特點(diǎn)，已證明COI基因序列可適用于種間、種內(nèi)甚至是屬以上階元的遺傳多樣性分析[9]，被廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)以及其他無(wú)脊椎和脊椎動(dòng)物的多樣性分析、種類(lèi)鑒別和系統(tǒng)分類(lèi)和進(jìn)化、分子生物學(xué)分析等科研領(lǐng)域[10-13].本研究主要以三亞海域采集的大眼鯛樣本為研究對(duì)象，通過(guò)PCR擴(kuò)增及測(cè)序方法獲得長(zhǎng)尾大眼鯛的COI基因序列，研究其在分子水平上的遺傳進(jìn)化關(guān)系，旨在為大眼鯛屬魚(yú)類(lèi)的分類(lèi)、遺傳關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化提供分子生物學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣本采自海南省三亞市周邊漁港，選擇相對(duì)新鮮、體貌完整的長(zhǎng)尾大眼鯛(Priacanthustayenus)作為樣品，用放入冰袋的泡沫箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室.樣品通過(guò)形態(tài)鑒定，取樣后放入-20 ℃冰箱冰凍保存?zhèn)溆?

1.2 肌肉總DNA提取

魚(yú)類(lèi)肌肉總DNA提取采用北京索萊寶科技有限公司的動(dòng)物組織DNA提取試劑盒，具體操作參照廠家說(shuō)明書(shū).

1.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

COI基因擴(kuò)增引物為COI-F：(5′-CCTGCAGGAGGAGGAGAYCC-3′)和COI-R：(5′-AGTATAAGCGT CTGGGTAGTC-3′).PCR擴(kuò)增條件設(shè)置參照文獻(xiàn)[13]113，其中DNA聚合酶來(lái)源于廣州東盛生物科技有限公司生產(chǎn)的Taq Plus DNA Polymerase(5 U·μL-1)，COI基因片段PCR擴(kuò)增后，經(jīng)切膠回收，送往深圳華大基因有限公司測(cè)序.

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用ClustalX 2.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，并進(jìn)行人工校對(duì)[14]；采用MEGA 7.0分析不同序列的堿基組成、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、變異位點(diǎn)、singleton位點(diǎn)以及核苷酸差異等，對(duì)不同單倍型之間遺傳距離進(jìn)行計(jì)算[15]；系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建參照已有文獻(xiàn)進(jìn)行[7]132；使用DNASP5計(jì)算核苷酸多樣性(Pi)和單倍型多態(tài)性等[16].

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)尾大眼鯛COI序列分析

長(zhǎng)尾大眼鯛的COI基因序列PCR擴(kuò)增的結(jié)果見(jiàn)圖1，從圖中可知，其片段大小約為700 bp.采用MEGA 7.0對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和分析，結(jié)果表明，長(zhǎng)尾大眼鯛群體的線粒體DNA 的COI基因片段長(zhǎng)度為636 bp，A，T，G和C堿基的平均含量分別為22.3%，27.4%，19.3%和31.0%，A+T和G+C的平均含量約為50%，相差不明顯.G+C在密碼子的第1～3位的平均含量為39.8%～56.0%，表明4種堿基在密碼子中出現(xiàn)頻率有較明顯的偏好性.

圖1 長(zhǎng)尾大眼鯛的COI序列PCR產(chǎn)物

2.2 單倍型分布

在17條COI序列中共定義了9個(gè)基因型，除Hap3占9條序列(出現(xiàn)頻率高達(dá)52.94%)外，其余基因型都只有1條序列(出現(xiàn)頻率僅為5.88%).在這9個(gè)單倍型中，有多態(tài)性位點(diǎn)57個(gè)，共58個(gè)突變，其中，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)只有1個(gè)，占總變異位點(diǎn)的1.75%.存在插入和缺失位點(diǎn)，如其中Hap1在第7位插入堿基T，在第21位缺失堿基C；Hap2在第21，585，589，608，626，636位分別缺失堿基C，A，G，C，G；Hap4在第29位缺失堿基A；Hap7在第2位缺失堿基C.

2.3 大眼鯛群體的遺傳多樣性

通過(guò)分析17條大眼鯛的COI序列可知，其單倍型多樣性(Hd)為0.735，9種單倍型(基因型)的核苷酸多樣性(Pi)為0.020 81，平均堿基差異(K)為13.027 78.各單倍型COI序列之間的遺傳距離及標(biāo)準(zhǔn)誤差詳見(jiàn)表1.Tajima’s D的中性檢驗(yàn)結(jié)果是-1.992 73，P<0.01，差異極顯著.

表1 9種單倍型間的遺傳距離及標(biāo)準(zhǔn)誤差

注:對(duì)角線下面為遺傳距離，對(duì)角線上面為其標(biāo)準(zhǔn)誤差.

采用UPGMA法和NJ法構(gòu)建長(zhǎng)尾大眼鯛9個(gè)單倍型的分子系統(tǒng)樹(shù)(圖2和圖3).結(jié)果表明，用這2種方法建樹(shù)的分支情況基本一樣，單倍型位置除Hap2外，其他單倍型在進(jìn)化樹(shù)上的位置均有變化.在UPGMA樹(shù)中(圖2)，Hap2在最下層，往上依次為Hap6，Hap4，Hap5，Hap9，Hap1，Hap7，Hap8，Hap3，即在UPGMA樹(shù)中，Hap2與Hap6的遺傳距離最近，與Hap3最遠(yuǎn)；在NJ樹(shù)中(圖3)，Hap2也在最下層，往上依次為Hap3，Hap8，Hap1，Hap5，Hap4，Hap9，Hap7，Hap6，即在NJ樹(shù)中，Hap2與Hap3遺傳距離相差最近，與Hap6相距最遠(yuǎn).

圖2 長(zhǎng)尾大眼鯛9種單倍型的UPGMA系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

圖3 長(zhǎng)尾大眼鯛9種單倍型的NJ系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用中性選擇分析的Tajima’s D檢驗(yàn)分析長(zhǎng)尾大眼鯛的種群擴(kuò)張情況，如果有種群擴(kuò)張現(xiàn)象出現(xiàn)，種群內(nèi)部會(huì)有過(guò)多的低頻變異出現(xiàn)，Tajima’s D中性檢驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)到種群內(nèi)部出現(xiàn)的低頻變異，若其是負(fù)值且有顯著意義時(shí)，即顯示出種群擴(kuò)張事件.本實(shí)驗(yàn)中，9種長(zhǎng)尾大眼鯛的Tajima’s D的中性檢驗(yàn)結(jié)果是-1.992 73，P<0.01，差異極顯著，說(shuō)明長(zhǎng)尾大眼鯛種群經(jīng)歷過(guò)擴(kuò)張事件[7]133.本實(shí)驗(yàn)采用線粒體的COI基因從分子水平上對(duì)大眼鯛進(jìn)行種群進(jìn)化的分析，在海洋生物物種鑒定方法中，線粒體蛋白編碼基因的Msh 1序列[17]和線粒體DNA控制區(qū)的D-loop序列[18]同樣具有較廣泛的應(yīng)用，但這些方法對(duì)大眼鯛的鑒定應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究和驗(yàn)證.

長(zhǎng)尾大眼鯛有較高的單倍型多樣性(0.735)，可能是由于環(huán)境的不均一、種群數(shù)量大或者是某些生活特征能適應(yīng)種群的快速增長(zhǎng)等原因造成的.就海洋魚(yú)類(lèi)來(lái)說(shuō)，較大的種群數(shù)量是保持群體較高遺傳多樣性的基礎(chǔ)，長(zhǎng)尾大眼鯛在熱帶海洋中分布較廣，可能為其較高的遺傳多樣性提供了基礎(chǔ).另外，研究用長(zhǎng)尾大眼鯛群體的遺傳多樣性水平也相對(duì)較高(0.020 81).GRANT等[19]依據(jù)核苷酸多樣性(Pi)與單倍型多樣性(Hd)之間的關(guān)系，把種群擴(kuò)張事件分成4種模式[7]133，根據(jù)這4種模式的劃分依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，長(zhǎng)尾大眼鯛COI序列的Hd值和Pi值均比較高，屬于第4種群體擴(kuò)張模式，說(shuō)明南海長(zhǎng)尾大眼鯛種群經(jīng)歷過(guò)擴(kuò)張事件，推測(cè)其是由1個(gè)較大的種群經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)化而來(lái)，也可能是由2個(gè)以上不同的種群2次接觸后演化而來(lái).

遺傳多樣性是物種適應(yīng)、生存和進(jìn)化最根本的基礎(chǔ).遺傳多樣性越豐富，說(shuō)明該物種適應(yīng)環(huán)境變化的能力越強(qiáng)，蘊(yùn)藏的進(jìn)化潛能越大，有豐富的育種和物種改良能力[20].盡管本研究顯示出三亞地區(qū)長(zhǎng)尾大眼鯛有較高的遺傳多樣性，但是其資源也可能因?yàn)槿祟?lèi)的活動(dòng)而減少.如近年來(lái)，三亞近海出現(xiàn)一定程度的污染，并呈現(xiàn)出日趨嚴(yán)重的趨勢(shì)，加之沒(méi)有節(jié)制的大規(guī)模捕撈，也會(huì)造成長(zhǎng)尾大眼鯛資源的衰減.因此，有必要采取如加大污染治理力度或政府頒布相關(guān)法令等，以維持長(zhǎng)尾大眼鯛野生資源的可持續(xù)性開(kāi)發(fā).