吳琪閩,童劍鋒,李 聰,楊振光,李葒燁,徐小雄,馮慧敏

(海南熱帶海洋學(xué)院 a.食品科學(xué)與工程學(xué)院；b.生態(tài)環(huán)境學(xué)院,海南 三亞 572022)

0 引言

近年來,微生物研究領(lǐng)域發(fā)展迅速,如有對紅樹林根際土壤中的特定菌種進(jìn)行分離鑒定[1];對阿寬蕉根基土壤放線菌的分離鑒定[2];海南發(fā)酵羅非魚的細(xì)菌多樣性分析[3]等研究.但是在陸源微生物資源被開發(fā)得越來越飽和的情況下,人們逐漸將研究領(lǐng)域轉(zhuǎn)向了海洋微生物資源.海洋的表面積十分廣闊,占到了地球的71%,體積更是達(dá)到了整個(gè)生物圈的95%[4]37.因?yàn)槠渚薮蟮谋砻娣e與體積,所以海洋中蘊(yùn)含了極為豐富的生物資源.與陸棲微生物相比,海洋微生物處在高鹽、高壓、低溫和低營養(yǎng)等極端條件下.生存環(huán)境的特異性,使海洋微生物在物種、基因組成和生態(tài)功能上表現(xiàn)出多樣性和特異性,體內(nèi)存在特殊代謝途徑的酶,相應(yīng)產(chǎn)生了一些特殊的活性代謝物質(zhì)[4]60.例如,在肽類方面,2014年Yoon等[5]從未鑒定的海綿中分離得到了一株曲霉屬真菌Aspergillussp．SF-5921,從其發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取液中分離得到一個(gè)能夠產(chǎn)生抗神經(jīng)炎性效果化合物;Prompanya C等[6]從海綿共生真菌-曲霉屬真菌AspergillusSimilanensisKUFA0013的發(fā)酵液中分離得到對三種癌細(xì)胞有微弱的抑制活性的環(huán)肽類化合物similanamide[6].在生物堿類方面,2012年Cai等[7]從海綿來源曲霉屬真菌ZHN-7-07的次級代謝產(chǎn)物中分離到具有微弱的抗甲流(H1N1)病毒活性的生物堿類化合物.此外在聚酮類、萜類等[8]亦具有新的發(fā)現(xiàn).海洋源微生物作為一個(gè)廣大的資源,蘊(yùn)含了巨大的科研價(jià)值,正等待著科研學(xué)者們進(jìn)行研究.

海綿是一種原始的無脊椎海洋后生物,在海洋中存在已經(jīng)有6億年之久.海綿群體數(shù)量龐大,占海洋動(dòng)物種類的1/15,是在熱帶海洋中除珊瑚外的第二大生物量.全世界約有10 000～15 000種[9-10].雖然海綿是一種原始又簡單的生物,但是近年來對海綿的研究表明其次級代謝產(chǎn)物在制藥、治療腫瘤、心血管和呼吸系統(tǒng)[11-14]等疾病領(lǐng)域具有很好的醫(yī)療價(jià)值.其底棲濾食的特殊性使得體內(nèi)富集了大量微生物,能產(chǎn)生比其他海洋生物更為豐富的生物活性產(chǎn)物.海綿正逐漸成為科研人員研發(fā)海洋藥物領(lǐng)域的一個(gè)重點(diǎn)對象.

本研究旨在從三亞海域熱帶海綿中分離出可培養(yǎng)的共附生真菌,研究其種屬分布的多樣性,為海綿共附生真菌的活性研究及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 海綿樣品

圖1 供試熱帶海綿樣品形態(tài)特征

本研究共使用5種海綿樣品(如圖1所示),它們采集自海南三亞天涯區(qū)紅塘灣(18°18′10″N,109°10′0″E).樣品采集后保存在無菌采樣袋中,冰浴,當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)操作.

1.1.2 培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)采用4種分離培養(yǎng)基,分別為GPY、真菌II號、馬丁培養(yǎng)基和MEA培養(yǎng)基,每種培養(yǎng)基均添加終濃度為100 mg·L-1的硫酸鏈霉素、100 mg·L-1的氯霉素和100 mg·L-1的氨芐青霉素.

(1)GPY培養(yǎng)基:葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、酵母膏10 g、瓊脂20 g、陳海水450 mL,ddH2O定容至1L,pH 7.5;

(2)真菌II號培養(yǎng):葡萄糖10 g、甘露醇20 g、麥芽糖20 g、味精10 g、酵母膏3 g、玉米漿1 g、K2HPO40.5 g、MgSO40.3 g、瓊脂20 g、陳海水450 mL,ddH2O定容至1 L,pH6.5;

(3)Martin培養(yǎng)基:葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g、孟加拉紅0.03 g、瓊脂17 g、陳海水450 mL、ddH2O定容至1 L,pH自然

(4)MEA培養(yǎng)基:麥芽浸粉17 g、蛋白胨3 g、陳海水450 mL、ddH2O定容至1 L,pH自然.

純化培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基(Solarbio,P8931),添加45%的陳海水,終濃度為100 mg· L-1的硫酸鏈霉素、100 mg·L-1的氯霉素和100 mg·L的氨芐青霉素.

1.2 方法

1.2.1 熱帶海綿可培養(yǎng)真菌的分離

將采集的海綿樣品用無菌海水清洗3次,以去除表面附著物及其他雜質(zhì),然后分別進(jìn)行3種預(yù)處理[15]26:(1)未做任何處理;(2)將海綿樣品在10%EDTA溶液中浸泡30 min;(3)將海綿樣品在60 ℃水浴中加熱6 min.在超凈工作臺中,將經(jīng)過預(yù)處理的樣品分別用無菌手術(shù)刀和手術(shù)剪切成1 cm3左右的方塊,放入無菌的研缽中,加入1 mL的無菌海水研磨至勻漿狀,將勻漿吸取到無菌離心管中搖晃混勻后,制成10-1樣品稀釋液,再用無菌海水將配制好的10-1的樣液稀釋成10-2和10-3濃度梯度的稀釋液.

采用傾注平板法對5個(gè)樣品中的真菌進(jìn)行分離,用移液槍吸取100 μL樣液滴在培養(yǎng)皿中,然后倒入培養(yǎng)基搖晃均勻.每個(gè)處理3個(gè)平行,所有平板放在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5 d,觀察到菌落長出后及時(shí)將菌落轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng).純化好的菌株置于20%的甘油,-70 ℃保存.

1.2.2 熱帶海綿可培養(yǎng)真菌的分子鑒定

采用CTAB法提取分離得到的純化菌株的基因組DNA,利用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序.測序結(jié)果上傳至NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行Blast比對,以確定分離得到菌株的種屬歸類.

1.2.3 各樣品可培養(yǎng)真菌的相似度分析

采用索倫森相似性系數(shù)(Sorenson Similarity Coefficient,CS)比較樣品之間附生真菌種屬組成的相似程度.計(jì)算公式為:CS=2A/(B+C).式中:A為兩種樣品共有種數(shù)或?qū)贁?shù),B為樣品B的附生真菌物種數(shù)或?qū)贁?shù),C為樣品C的附生真菌物種數(shù)或?qū)贁?shù)[16].

1.2.4 熱帶海綿可培養(yǎng)真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序結(jié)果上傳至NCBI比對后,選擇與供試菌株相似度最大的序列為參比菌株序列.采用ClusterW對所有的序列進(jìn)行比對,并進(jìn)行手工調(diào)整,使用MEGA X軟件,根據(jù)kimura模型估算系統(tǒng)進(jìn)化矩陣,Bootstrap值設(shè)置為1 000,構(gòu)建供試菌株與參比菌株的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹,從而分析熱帶海綿可培養(yǎng)真菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系.

2 結(jié)果與分析

2.1 熱帶海綿共附生真菌的分離結(jié)果

利用4種分離培養(yǎng)基從5份熱帶海綿樣品中共分離得到33株真菌菌株,共計(jì)25個(gè)形態(tài)種.為初步確定分離菌株的分類地位,我們選擇了25個(gè)形態(tài)種的特征菌株,擴(kuò)增了其ITS序列并測序,結(jié)果如圖2所示,這25個(gè)形態(tài)種隸屬于14個(gè)屬,其中木霉屬Trichoderma為優(yōu)勢屬,共分離得到11株菌,約占33.33%;其次為彎孢聚殼屬Eutypella,共分離得到4株菌,約占12.12%;曲霉屬Aspergillus和Cystobasidium屬都分別分離得到了3株菌,約占9.09%;枝孢屬Cladosporium和Paraphaeosphaeria屬各分離得到2株菌,約占6.06%;Allocryptovalsa屬、外瓶霉屬Hortaea、Meyerozyma屬、擬盾殼霉屬Paraconiothyrium、Valsaria屬、韋斯特殼屬Westerdykella、威克漢姆酵母屬Wickerhamomyces和炭角菌屬Xylaria都僅分離到了一株菌,約占總數(shù)的3.03%.表1給出了14個(gè)屬測序菌株、形態(tài)形似菌株、最大相似參比菌及其登錄號,以及最大相似率.由表1中可知,菌株HMF07的最大相似菌株為Allocryptovalsapolyspora(Genebank ID:MF959500.1),二者的相似率為98.91%;菌株HMF08的最大相似菌株為Eutypellacitricola(Genebank ID:MG456731),二者的相似率為97.76%;菌株HMF23的最大相似菌株為Wickerhamomycesochangensis(Genebank ID:NR_154971.1),二者的相似率為98.29%,因此,這三個(gè)菌株可能是潛在的新的分類單元,需進(jìn)一步研究確定.菌株HMF26與Paraconiothyrium屬相似率最高,為99.61%,但是這一序列為未可培養(yǎng)的序列,因此,HMF26可能為首次分離獲得的純培養(yǎng)菌株.

表1 熱帶海綿共附生真菌25個(gè)形態(tài)種的分類

表1(續(xù))

圖2 熱帶海綿共附生真菌的多樣性

2.2 熱帶海綿共附生真菌的組成與分布

各個(gè)海綿樣品上的共附生真菌分離結(jié)果如表2所示.結(jié)果表明,海綿五號樣品分離得到的菌株數(shù)量為12株,占分離種屬的36.36%,其次為海綿一號樣品,共分離得到11株菌,海綿樣品三號上分離得到5株菌,海綿樣品二號上分離得到3株菌,海綿樣品四號上分離得到的菌株最少,只有2株.各種樣品上分離的菌株不僅數(shù)量上有差別,種類上也存在一定的差異.其中,海綿一號樣品多樣性最為豐富,共分離得到8種不同屬的真菌菌株,其次為海綿三號樣品,雖然其僅分離得到5株菌株,但是這5株菌分別隸屬于5個(gè)不同的種屬.海綿五號樣品雖然分離到了12株菌,但是其多樣性不太豐富,僅為4個(gè)屬,而海綿二號樣品和四號樣品不僅得到的菌株數(shù)量少,而且種類也不豐富.另外,從表2中還可以得知,不同海綿樣品上真菌種類的分布還是具有較大的差異,其中木霉屬Trichoderma和Cystobasidium屬在三種不同的海綿樣品上均有分布,曲霉屬Aspergillus、彎孢聚殼屬Eutypella和Paraphaeosphaeria屬在兩種不同的海綿樣品上均有分布.而其他種屬真菌只在部分海綿樣品中分離得到,如威克漢姆酵母屬Wickerhamomyces、擬盾殼霉屬Paraconiothyrium和Allocryptovalsa屬均來源于海綿一號樣品,炭角菌屬Xylaria、外瓶霉屬Hortaea、Valsaria屬均來源于海綿三號樣品,枝孢屬Cladosporium只在海綿二號樣品上分離得到,韋斯特殼屬Westerdykella只在海綿五號樣品上分離得到.

表2 5種海綿樣品上的共附生真菌分布

采用索倫森相似性系數(shù),比較樣品之間附生真菌種屬組成的相似程度.結(jié)果如表3所示.由表3中可知,海綿一號樣品與海綿五號樣品,海綿二號樣品與海綿四號樣品之間的相似性系數(shù)均大于或等于0.5,說明它們之間的共附生真菌菌群有著較高的相似性.其他海綿樣品之間的共附生真菌菌群的相似系系數(shù)均小于0.5,反映出它們之間共附生真菌多樣性水平差異性較大,相似程度低.

表3 5個(gè)海綿樣品之間真菌群落結(jié)構(gòu)相似性系數(shù)

2.3 4種分離培養(yǎng)基對海綿共附生真菌的分離能力比較

本研究共采用4種分離培養(yǎng)基進(jìn)行分離,共得到真菌菌株33株,其中真菌II號培養(yǎng)基共分離得到10株菌,占總菌株數(shù)的30.30%;Martin培養(yǎng)基共分離得到6株菌,約占18.18%;MEA培養(yǎng)基共分離得到8株,約占24.24%;GPY培養(yǎng)基共分離得到9株菌,約占27.27%.每種分離培養(yǎng)基上得到的菌株數(shù)及其種類如表4所示,結(jié)果表明,四種培養(yǎng)基均可分離得到真菌菌株,但是每種培養(yǎng)基的出菌率存在一定的區(qū)別,其中GPY培養(yǎng)基和真菌II號培養(yǎng)基出菌率更高.

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),這4種分離培養(yǎng)基分離得到的菌株,不僅數(shù)量有差異,菌株的種類也有一定的區(qū)別.其中,GPY培養(yǎng)基和真菌II號培養(yǎng)基分離得到的菌株種類最為豐富,都為7個(gè)屬,而MEA培養(yǎng)基分離得到8株4個(gè)屬的真菌菌株,Martin培養(yǎng)基分離得到的菌株數(shù)最少,僅為6株4個(gè)屬.木霉屬Trichoderma在4種分離培養(yǎng)基上均有得到.彎孢聚殼屬Eutypella和Cystobasidium屬在GPY培養(yǎng)基、MEA培養(yǎng)基和真菌II號培養(yǎng)基上均能分離得到.此外,韋斯特殼屬(Westerdykell)、Paraphaeosphaeria屬和Allocryptovalsa屬僅在Martin培養(yǎng)基上分離得到,枝孢屬Cladosporium、威克漢姆酵母屬Wickerhamomyces、外瓶霉屬Hortaea只在GPY培養(yǎng)基上分離得到;而邁耶氏酵母屬M(fèi)eyerozyma、擬盾殼霉屬Paraconiothyrium和炭角菌屬Xylaria則只在真菌Ⅱ號培養(yǎng)基上分離得到;Valsaria屬則只在MEA培養(yǎng)基上分離得到.研究結(jié)果說明熱帶海綿共附生真菌對不同培養(yǎng)基具有偏好性,但GPY培養(yǎng)基和真菌Ⅱ號培養(yǎng)基最適合用于分離海綿共附生真菌.

圖2 供試菌株與參比菌株基于RDNA-ITS序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

表4 4種培養(yǎng)基上海綿共附生真菌的分布

種屬 菌株數(shù)量(株)/屬真菌二號MartinMEAGPYAllocryptovalsa—1——Aspergillus2——1Cladosporium———2Cystobasidium1—11Eutypella2—11Hortaea———1Meyerozyma1———Paraconiothyrium1———Paraphaeosphaeria —2——Trichoderma2252Valsaria ——1—Westerdykella—1——Wickerhamomyces———1Xylaria1———分離菌株數(shù)(種類)10(7)6(4)8(4)9(7)

2.4 熱帶海綿共附生真菌基于rRNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

將供試的25個(gè)菌株的ITS序列上傳至Genebank進(jìn)行Blast比對,并下載各菌株的參比序列,以Saccharomyces cerevisiae(Genebank ID:LC424144)為外類群構(gòu)建供試菌株與參比菌株基于rDNA-ITS序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹.由圖2可知,供試的菌株可以明顯分為兩大類,一大類為酵母菌,一大類為絲狀真菌.其中HMF23與未培養(yǎng)真菌菌株 FICUS 017(Genebank ID:JX174745)聚到了一起,可能為首次獲得的純培養(yǎng)菌株的新物種.

3 討論

本研究從三亞海域的五個(gè)熱帶海綿樣品種共分離出33株真菌菌株,ITS序列表明它們屬于14個(gè)屬,其中HMF07、HMF08和HMF23菌株與已知最大相似菌的相似率都低于99%,有可能為潛在的新物種,而HMF26的最大相似菌為未培養(yǎng)真菌,其也有可能為首次獲得的可培養(yǎng)菌株.本研究結(jié)果表明,木霉屬Trichoderma為熱帶海綿共附生真菌中的優(yōu)勢屬.這一結(jié)果與前人的報(bào)道不太相符.在張圣良等[17-19]的研究中,優(yōu)勢菌屬均為曲霉屬.導(dǎo)致這種差別的因素,我們認(rèn)為主要集中在兩種方面.在本次研究中,我們采取了三種預(yù)處理方法,一種是60 ℃水浴加熱6 min,一種是在10% EDTA溶液中浸泡30 min,還有一種便是不做處理.三種預(yù)處理方法下,60 ℃水浴加熱并分離出菌株.在前人對海洋源共附生真菌的分離研究中,采用EDTA溶液浸泡的預(yù)處理方式尚屬少見,大部分都是經(jīng)過沖洗后即研磨制取樣液.所以EDTA溶液對曲霉屬真菌或其他菌屬是否產(chǎn)生抑制影響,是值得考慮的一個(gè)因素.另外,由于采集的海綿樣品尚未得到鑒定,所以海綿樣品的種類與特定分布海域的環(huán)境因素是否會對曲霉屬真菌與木霉屬真菌產(chǎn)生影響也暫時(shí)不得而知.木霉屬作為自然界中分布較為廣泛的真菌類群,因其中許多種類對植物病原真菌具有拮抗和重寄生作用以及能夠產(chǎn)生纖維素酶等多種酶類而備受關(guān)注[20].本研究分離出木霉屬為優(yōu)勢屬類的結(jié)果亦可為后人對海洋源木霉屬真菌的特定研究中提供一定的參照作用.

在前人關(guān)于海綿共附生真菌的研究報(bào)道中[21-25],分離得到的種屬有曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、擬盾殼霉屬(Paraconiothyrium)、枝孢屬(Cladosporium)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)、假絲酵母屬(Candida)、邁耶氏酵母屬(Meyerozyma)、紅酵母屬(Rhodotorula)、側(cè)齒霉屬(Engyodontium)、炭角菌屬(Xylaria)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、鏈格孢屬(Alternaria)、暗球腔菌屬(Phaeosphaeria)、光黑殼屬(Preussia)、雙散霉屬(Dicyma)、擬盤多孢屬(Pestalotiopsis)等種類豐富的海洋真菌.本研究分離得到的33株真菌中,除了分離到與上述研究中共有的真菌外,還分離到外瓶霉屬(Hortaea)、韋斯特殼屬(Westerdykella)、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)、Valsaria屬、Paraphaeosphaeria屬、Allocryptovalsa屬和Cystobasidium屬,這些種屬在前人的研究中少見或未見.

本研究采用4種不同的真菌分離培養(yǎng)基對熱帶海綿共附生真菌進(jìn)行分離培養(yǎng),研究結(jié)果表明GPY培養(yǎng)和真菌II號培養(yǎng)分離得到的菌株數(shù)量和種類都較為豐富,因此嘗試用于海洋真菌的分離培養(yǎng).而Martin培養(yǎng)基在分離海洋源真菌的實(shí)驗(yàn)中作為一種常見的培養(yǎng)基,其分離效果普遍得到大家認(rèn)可,但是在本次實(shí)驗(yàn)中并未取得顯著的效果,所以在培養(yǎng)基的選取中仍然需要經(jīng)過多方面的考量.