王沛政,李衛(wèi)東

(海南熱帶海洋學(xué)院 生態(tài)環(huán)境學(xué)院,海南 三亞 572022)

0 引言

珊瑚生態(tài)系統(tǒng)是海洋中最大的生態(tài)系統(tǒng),也是最復(fù)雜的水中生態(tài)系統(tǒng),它在所有海洋生態(tài)系統(tǒng)中提供了最高的生物多樣性[1-2].軟珊瑚屬于刺胞動(dòng)物門(Cnidaria)、珊瑚蟲綱(Anthozoa)、八放珊瑚亞綱(Octocorallia)軟珊瑚目(Alcyonacea).軟珊瑚科下的屬有肉芝軟珊瑚屬(Sarcophyton)、豆莢軟珊瑚屬(Lobophytum)和短指軟珊瑚屬(Sinularia)等 18 個(gè)屬.短指軟珊瑚(Sinularia)全球種類有170多種,是擁有種類數(shù)量最多的軟珊瑚屬.其中,在印度洋-太平洋海域Sinularia有128種,個(gè)體形態(tài)變化很大,其群體直徑從幾厘米到幾米不等,有些種類甚至成為一些珊瑚礁區(qū)域的優(yōu)勢(shì)種[3].軟珊瑚在全球分布廣泛,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)軟珊瑚種類超過3 000 種,從近岸淺海珊瑚礁到深海,熱帶和亞熱帶到高緯度地區(qū)都有分布,而且在整個(gè)印度-西太平洋珊瑚礁海域軟珊瑚的豐度和多樣性都很高[4-5],不僅孵育了大量的海洋生物,而且為海洋生物提供棲息、生活和繁殖場(chǎng)所[6].SWEATMANET等[7]報(bào)道，大堡礁(GBR)多達(dá)37%的礁區(qū)被軟珊瑚覆蓋.在東沙環(huán)礁上，一些珊瑚礁60%～70%區(qū)域?yàn)檐浬汉魉采w[8].軟珊瑚肉質(zhì)柔軟而不被海洋中的其他動(dòng)物所啃食,這可能是與其次生代謝產(chǎn)物有關(guān).現(xiàn)已從軟珊瑚中分離獲得了一系列具有拒捕食、防附著、抗微生物等化學(xué)防御作用的化合物,而且軟珊瑚中部分化合物也顯示了較強(qiáng)的藥理活性,如抗腫瘤、抗菌以及抗病毒等[9-13].

軟珊瑚形態(tài)學(xué)鑒定比較困難.目前,一般是通過共肉組織中CaCO3骨針和外部形態(tài)2個(gè)形態(tài)特征來進(jìn)行種類鑒定[14].經(jīng)典生物分類學(xué)為部分軟珊瑚分類提供了可靠的分類方法,但是大部分軟珊瑚分類和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系仍然不明確,分類仍然相當(dāng)混亂,分類上出現(xiàn)了許多同物異名現(xiàn)象[15].MCFADDEN等[16]認(rèn)為，軟珊瑚體內(nèi)骨針形態(tài)豐富、多變,目前根據(jù)骨針形態(tài)分類存在一定困難,需要積累大量經(jīng)驗(yàn)；對(duì)于不同的分類學(xué)家,骨針形態(tài)分析時(shí)具有強(qiáng)烈的主觀性.軟珊瑚的全基因組信息能為上述問題的解決提供新的思路.

軟珊瑚在全球分布廣泛,在珊瑚礁系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用.HUA等[17]于2019年首次報(bào)道了造礁石珊瑚多孔鹿角珊瑚(Acroporamillepora)的全基因組測(cè)序研究結(jié)果.目前,軟珊瑚全基因組測(cè)序研究尚未見報(bào)道.筆者以海南島周邊地區(qū)主要的軟珊瑚——短指軟珊瑚為研究對(duì)象,通過高通量測(cè)序等技術(shù)手段初步對(duì)其進(jìn)行了全基因組測(cè)序研究,旨在為本地區(qū)軟珊瑚的保護(hù)和研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1材料與方法

1.1 材料

短指軟珊瑚Sinulariaceramensis來源于海南三亞西島海域.

1.2 短指軟珊瑚共肉組織不同部位蟲黃藻的分布鑒定方法

利用手術(shù)刀片取出短指軟珊瑚共肉組織的表層組織和中部組織進(jìn)行壓片,然后用顯微鏡進(jìn)行觀測(cè).

利用短指軟珊瑚特異的COI引物和28s rDNA引物對(duì)短指軟珊瑚共肉組織的表層組織和中部組織的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè),來確定能否擴(kuò)增出短指軟珊瑚共肉組織.利用蟲黃藻特異性ITS引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè),來確定能否擴(kuò)增出蟲黃藻基因組DNA,進(jìn)而確定蟲黃藻在短指軟珊瑚共肉組織分布情況.具體引物序列如下：

(1)ITS引物：上游引物為5′-CCGGTGAATTATTCGGACTGACGCAGTGCT-3′；下游引物為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′.目標(biāo)序列片段大小為750 bp.

(2)COl引物：上游引物為5′-CCATAACAGGACTAGCAGCATC-3′；下游引物為5′-ATCATAGCATAGAACCATACC-3′.目標(biāo)序列片段大小為1 000 bp.

(3)28 s引物：上游引物為5′-GCACTTCTGGAGGGCGAGCCGT-3′；下游引物為5′-TTCCACTGGCTTCACCCTATTCA-3′.目標(biāo)序列片段大小為450 bp.

1.3 軟珊瑚全基因組測(cè)序

檢測(cè)合格的DNA 樣品通過 Covaris 超聲波破碎儀隨機(jī)打斷成長度為 350 bp 的片段,末端修復(fù)、加 A 尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR 擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)文庫制備.構(gòu)建好的文庫通過 Illumina Nova Seq進(jìn)行 PE 測(cè)序.

2 結(jié)果與分析

2.1 短指軟珊瑚共肉組織不同部位蟲黃藻分布分析

光滑短指軟珊瑚活體圖像及其共肉組織見圖1，圖中粗壯的莖干白色箭頭所示為短指軟珊瑚的取樣部位.

圖1 短指軟珊瑚圖像及其共肉組織

短指軟珊瑚共肉組織的表層組織和中部組織進(jìn)行壓片,顯微鏡檢測(cè)如圖2所示,左邊圖像為短指軟珊瑚共肉組織的表皮部位組織壓片,從圖中可以觀察到大量蟲黃藻個(gè)體；右邊圖像為短指軟珊瑚共肉組織的中間部位組織壓片,圖中有大量的骨針,但沒有發(fā)現(xiàn)蟲黃藻個(gè)體.因此，短指軟珊瑚共肉組織中部可能沒有蟲黃藻.

圖2 短指軟珊瑚(Sinularia ceramensis Verseveldt )共肉組織不同部位壓片

為進(jìn)一步檢測(cè)短指軟珊瑚共肉組織表層組織和中部組織是否存在蟲黃藻DNA,我們利用短指軟珊瑚特異的COI引物和28s rDNA引物和蟲黃藻特異性ITS引物對(duì)短指軟珊瑚共肉組織不同部位組織DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)(圖3).點(diǎn)樣孔2和3為軟珊瑚共肉組織的中部組織和表層組織蟲黃藻特異性ITS引物擴(kuò)增結(jié)果,點(diǎn)樣孔2未擴(kuò)增出條帶,表明中部組織沒能擴(kuò)增出蟲黃藻特異性ITS條帶,表明該部位沒有蟲黃藻DNA存在,點(diǎn)樣孔3擴(kuò)增出蟲黃藻特異性ITS條帶,表明表層部分存在蟲黃藻DNA.點(diǎn)樣孔4～7分別為短指軟珊瑚特異Col和28s引物在中部組織和表層組織的擴(kuò)增結(jié)果,從中均可以擴(kuò)增出明亮清晰的DNA條帶,證明短指軟珊瑚共肉組織的中部組織和表層組織均能擴(kuò)增出較好的珊瑚組織DNA.以上結(jié)果說明，短指軟珊瑚共肉組織表皮部位有蟲黃藻分布,中間部位沒有蟲黃藻分布.

注：1：Markers；2～3：ITS(蟲黃藻)；4～5：Col(軟珊瑚)；6～7：28S (軟珊瑚).圖3 短指軟珊瑚共肉組織不同部位DNA擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果

2.2 短指軟珊瑚測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

由于短指軟珊瑚共肉組織中部部位沒有有蟲黃藻分布,我們利用其中部組織取樣進(jìn)行了全基因組測(cè)序.經(jīng)過對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的嚴(yán)格過濾,得到高質(zhì)量的clean data.對(duì)產(chǎn)出數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表1),GC 含量比例用于檢測(cè)有無 AT和GC 偏分離現(xiàn)象.測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量的高低主要表現(xiàn)在 Q20的大小,這樣才能保證后續(xù)高級(jí)分析的正常進(jìn)行.從表1中可以看出，樣品原始測(cè)序數(shù)據(jù)量為 36.89 G,測(cè)序質(zhì)量正常(Q20≥90%,Q30≥85%),測(cè)序錯(cuò)誤率正常(<0.05%).

表1 Sinularia ceramensis Verseveldt 測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)

2.3 短指軟珊瑚測(cè)序數(shù)據(jù)污染評(píng)估

取短指軟珊瑚部分有效測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(NT),結(jié)果見表2.選取比對(duì)結(jié)果中的前5個(gè)比對(duì)結(jié)果,均比對(duì)到Sinulariapeculiaris等序列,因此是同源比對(duì),測(cè)序序列均為軟珊瑚基因組序列,表明測(cè)序成功.雖然前5位是同源比對(duì),但在比對(duì)結(jié)果的后面出現(xiàn)少量的菌類污染,其污染可能來自軟珊瑚內(nèi)部共生菌.

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)污染比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.4 K-mer 分析估計(jì)基因組大小和雜合率

在基因組組裝前,可以通過測(cè)序得到的序列估計(jì)基因組特征(表3),我們采用基于 K-mer 的分析方法來估計(jì)基因組大小和雜合率等.其中K-mer為17,短指軟珊瑚修訂全基因組大小約649 Mbp,其中雜合率為1.25,基因組堿基重復(fù)率約為57%.結(jié)果表明，軟珊瑚基因組較小,有一定程度的雜合率,但基因組堿基重復(fù)率較高.雜合率和基因組堿基重復(fù)率高會(huì)給全基因組序列組裝構(gòu)成困難.

表3 基因組特征統(tǒng)計(jì)情況

2.5 組裝結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

Reads拼接后會(huì)獲得一些不同長度的Contigs,將所有的Contig長度相加,能獲得1個(gè)Contig總長度.Contigs拼接組裝獲得一些不同長度的Scaffolds.將所有的Scaffold長度相加,能獲得1個(gè)Scaffold總長度.統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4.采用 kmer=43 進(jìn)行初步組裝,得到 contig N50 為 836 bp,總長為 586.07 Mbp,Scaffold N50 為1 044 bp,總長為 599.11 Mbp.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,光滑短指軟珊瑚的基因組為1個(gè)復(fù)雜的基因組,需要采用相應(yīng)的策略進(jìn)行基因組組裝.

表4 組裝結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 討論

珊瑚線粒體基因組的進(jìn)化通常比相應(yīng)的核基因組慢，MCFADDEN等[18]認(rèn)為，線粒體DNA在八放珊瑚中作為DNA條形碼具有一定的局限性,利用COI+igr1+msh1條形碼對(duì)軟珊瑚進(jìn)行種類鑒定也不夠完美.這就造成傳統(tǒng)分類的許多形態(tài)特征與分子系統(tǒng)發(fā)育證據(jù)不一致,許多種類可能代表同一種.近期我們實(shí)驗(yàn)室通過msh1基因和COI基因分析結(jié)合形態(tài)學(xué)對(duì)肉芝軟珊瑚進(jìn)行種類鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，msh1基因和COI基因?qū)δ承┓N仍然難以區(qū)分[20].因此，挖掘軟珊瑚核基因組信息將有助于該問題的解決.

大部分軟珊瑚都利用與蟲黃藻共生獲得自己所需要的營養(yǎng)物質(zhì).雖然蟲黃藻利用其光合作用功能為珊瑚活體獲取養(yǎng)分提供了幫助,但蟲黃藻的存在為科學(xué)家在研究珊瑚分子水平機(jī)理時(shí)造成麻煩.尤其是在轉(zhuǎn)錄組和基因組水平研究珊瑚基因表達(dá)時(shí)很難排除蟲黃藻基因表達(dá)的污染.HUA等[17]1376在對(duì)多孔鹿角珊瑚全基因組測(cè)序注釋研究中,為了排除蟲黃藻基因的污染,大量收集珊瑚單個(gè)個(gè)體精子及幼胚,該時(shí)期段的珊瑚組織不含蟲黃藻.珊瑚一般1年繁殖1次,但單個(gè)珊瑚個(gè)體產(chǎn)生的精子和卵子量都很少,很難滿足實(shí)驗(yàn)的需求,這給珊瑚科學(xué)研究增添了很多障礙.本實(shí)驗(yàn)利用組織壓片和分子水平PCR擴(kuò)增鑒定表明，短指軟珊瑚共肉組織中部位沒有蟲黃藻分布,因此可利用該部分組織進(jìn)行科學(xué)研究，這樣就能排除蟲黃藻的干擾.短指軟珊瑚個(gè)體基部共肉組織粗壯,可以為珊瑚科學(xué)研究提供足夠的實(shí)驗(yàn)材料.

本研究利用短指軟珊瑚個(gè)體基部共肉組織進(jìn)行全基因組測(cè)序研究,結(jié)果表明，軟珊瑚SinulariaceramensisVerseveldt 基因組大小為649.58 Mbp,雜合率為1.25%,重復(fù)序列比例為57.06%.得到scaffold N50 為1 044 bp,總長為 599.11 Mbp.HUA等[17]1377的研究表明，石珊瑚A.millepora和A.digitifera基因組大小分別為386.60和447.48 Mbp,其 Scaffolds數(shù)目分別為3,876和 2,420,GC%含量分別為38.85 和39.04,基因重復(fù)率(%)分別為34.55和32.31.因此可知，石珊瑚基因組比短指軟珊瑚基因組小很多,重復(fù)序列比率比短指軟珊瑚基因組也小很多.表明光滑短指軟珊瑚的基因組為1個(gè)復(fù)雜的基因組,需要采用相應(yīng)的策略進(jìn)行基因組組裝.因此，在短指軟珊瑚基因組注釋方面今后還需深入研究.