張蓮珠,宋 穎,馬 軍,王藝惟,張 昱,范雪影,李嘉瑋,王義山,宋 宇

(1.海南熱帶海洋學院 a.熱帶海洋生物資源利用與保護教育部重點實驗室; b.海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護與利用重點實驗室;c.水產(chǎn)與生命學院,海南 三亞 572022; 2.長春市寬城區(qū)醫(yī)院,長春 130052;3.吉林大學 動物科學學院,長春 130062)

0 引言

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是炎性腸病中一種難治的、慢性進展且容易復發(fā)的疾病.病程可長達幾十年甚至伴隨終生,嚴重降低了患者的生活質(zhì)量,縮短患者壽命,增加社會經(jīng)濟負擔.由于其長期慢性炎癥的刺激,潰瘍性結腸炎相關性結腸癌的發(fā)病風險也逐漸增高,病程30年的UC患者結腸癌變概率高達30%[1-2].我國UC的發(fā)病率正處在上升階段,若不加以有效防治,UC 將成為一種流行性疾病[3-4].尋找新的有效的UC治療藥物與方法,是當前迫切需要解決的棘手難題.中醫(yī)學認為UC屬于“泄瀉”“赤沃”“大瘕泄”等范疇.泄瀉日久,腎陽虛衰,不能溫運脾陽,運化失常,傷及腸絡,則大便為黏液血樣;陽虛生內(nèi)寒,可見遇寒即發(fā),形寒肢冷.四逆湯是《傷寒論》中的經(jīng)典名方,具有回陽救逆之效.由附子、干姜、甘草組成.其中附子治風寒濕痹、痹痛麻木、脘腹冷痛之癥功效卓著,為君藥.干姜性味辛熱,具有溫中散寒、回陽通脈的功效,在四逆湯中可助附子回陽,為臣藥.甘草和中益氣,既能緩解附子、干姜的暴烈,又能協(xié)助附子、干姜的回陽救逆之功效,為佐使藥.現(xiàn)代臨床療效觀察和動物實驗研究均表明,四逆湯具有強心、升壓、抗休克、提高免疫功能等作用,能保護心腦血管系統(tǒng)和腸黏膜,對冠心病、動脈粥樣硬化等有較好的治療效果[5-8],在臨床上除了更多地用于治療休克、陽虛發(fā)熱、血栓閉塞性脈管炎等病癥外,還常用于治療胃腸炎和腹瀉.例如,角田睦子運用四逆湯治療幾種類型的潰瘍性結腸炎[9].本課題組在對四逆湯的前期研究中發(fā)現(xiàn),該方劑對小鼠UC有顯著的治療效果,本研究進一步探索四逆湯對DSS誘導的小鼠UC的干預作用及作用機制,為四逆湯在預防或治療潰瘍性結腸炎中的應用提供實驗依據(jù),使四逆湯在醫(yī)藥領域發(fā)揮新的用途.

1材料和方法

1.1動物

實驗動物:36只SPF級C57BL/6雄性小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(5周齡,體重17～19 g,合格證號No.11400700312216),本實驗在吉林大學動物倫理福利委員會監(jiān)督下(IACUC)在吉林大學實驗動物中心屏障設施開展,遵守吉林大學及國家對于實驗動物倫理福利的要求(批準號:201802064),飼養(yǎng)條件嚴格依照GB14925進行,實驗過程中小鼠被允許自由采食和飲水.

1.2實驗主要試劑

四逆湯由炙附片、干姜、炙甘草組成,由長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院提供.DSS購自瑞典TdB公司;小鼠IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α ELISA檢測試劑盒購自美國BioLegend公司;組織細胞裂解液、PMSF購自上海碧云天生物技術有限公司;異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司;甲醛溶液購自成都市科隆化學品有限公司.

1.3儀器

酶標儀購自TECAN公司;NANODROP 1000購自Thermo;組織勻漿機購自M.P.Biomedicals;顯微鏡(Ts2)購自日本Nikon公司;KD-3368-Ⅳ電腦病理專用冷凍石蠟兩用切片機購自日本浮山株式會社;ABS型小動物氣體麻醉機購自上海玉研科學儀器有限公司.

1.4UC模型制備與給藥方法

小鼠自購入后于SPF實驗動物設施中適應飼養(yǎng)一周,而后將小鼠隨機分為3組,每組12只:正常對照組(CTL)、DSS模型組(DSS)、四逆湯干預組(SND).正常對照組自由飲用純凈水,灌胃純凈水;DSS模型組分兩個周期進行給藥造模,DSS I 期自由飲用2.5%的DSS 7天,之后自由飲用純凈水7天,DSS II 期自由飲用2.5%的DSS 7天;四逆湯干預組同DSS模型組同步造模,且于造模開始每天1次灌胃給予四逆湯水煎干浸膏粉(四逆湯水煎劑經(jīng)減壓濃縮至相對密度 1.26～1.30(80 ℃)的稠膏,減壓干燥(0.08 MPa,60 ℃)得干燥浸膏,粉碎過80目篩,得干浸膏粉.臨用前以無菌蒸餾水配制,按照《藥理實驗方法學》“不同動物等效劑量折算系數(shù)表”折算,給藥量為60 kg體重成年人用量的8.65倍)至實驗結束,正常組和模型組灌胃予蒸餾水10 mL·kg-1·d-1.實驗過程中,每天記錄小鼠體重、觀察小鼠活動情況,收集小鼠糞便,DAI評分評估小鼠結腸炎患病情況.DSS II 期造模結束后第2、3天處死小鼠并取材.

1.5 HE染色觀察結腸組織

末次給藥后,禁食不禁水24 h,異氟烷麻醉,心臟采血保留血清,處死小鼠.將小鼠置于冰上解剖取材,分離遠端結腸,4 ℃預冷的PBS溶液沖洗結腸,用眼科剪沿腸系膜縱軸剖開腸腔,冷PBS溶液沖洗后觀察結腸黏膜損傷情況.取距小鼠肛門約3 cm處長度約0.5 cm的結腸置于10%甲醛溶液中固定,石蠟包埋,HE染色觀察.

1.6 ELISA法測定結腸組織IL-6、IL-17、IL-10和TNF-α水平

另取一部分結腸組織加入蛋白裂解液裂解完全后離心,上清液即為結腸組織蛋白提取液.定量各組提取液的蛋白濃度,按照ELISA試劑盒說明檢測各組小鼠結腸組織IL-6、IL-17、IL-10和TNF-α的水平.

1.7統(tǒng)計學分析

采用Graphpad Prism 7軟件統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù).以mean±SD表示各組數(shù)據(jù),多組間比較采用One-way ANOVA方差分析,P<0.05為有顯著性差異,P<0.01為差異性極顯著.

2結果

2.1四逆湯對潰瘍性結腸炎小鼠體重變化的影響

實驗期間每天記錄小鼠體重,每組小鼠體重平均數(shù)每日變化的情況見圖1.在兩個DSS周期中,正常對照組小鼠體重變化稍有波動,但總體較為平穩(wěn);DSS模型組小鼠體重在每個DSS飲水處理過程中體重下降明顯,在DSS飲水結束后第2天體重下降率最高,體重下降到最低;四逆湯干預組小鼠體重變化率的變化趨勢和DSS模型組一致,但每日體重下降率均顯著低于DSS模型組,這種差異在慢性期即DSS II 期表現(xiàn)更為顯著.

圖1 各實驗組小鼠體重變化率

2.2小鼠腸炎情況評估

實驗期間每天收集小鼠糞便,并對小鼠糞便性狀、出血狀況等進行雙盲評分,并綜合體重下降率進行DAI評分.DAI評分是由Alex[10]等開發(fā)用于實驗動物結腸炎患病情況的評價體系.評分共分3項,每項滿分為4分,DAI得分為3項得分總和,得分越高說明實驗動物患病情況越嚴重,評分標準如表 1 所示.

表1 DAI評分標準

根據(jù)表1的評分標準,各組小鼠DAI評分每日變化情況見圖2.在兩個DSS周期中,正常對照組小鼠DAI評分在第8天、第11天以及第18天略有波動,DAI評分均為0分,說明小鼠未患炎癥;模型組小鼠DAI評分在第8天和第18天即兩個DSS飲水結束后第2天達到最高,即腸炎患病最嚴重,這與體重變化率改變情況一致;四逆湯干預組DAI評分分別在第7天和第17天比模型組提前1天達到高峰,但得分均顯著低于模型組,且四逆湯干預組炎癥恢復較模型組快,恢復后DAI評分低.以上情況表明四逆湯對DSS誘導模型小鼠潰瘍性結腸炎在急性期DSS I期和慢性期DSS II 期均有顯著改善.

圖2 各實驗組小鼠DAI評分

2.3四逆湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織病理變化的影響

對各實驗組小鼠腸組織HE染色并于光鏡下分別觀察腸黏膜、黏膜下組織及肌層的損傷情況,進行結腸炎組織學評分(評分方法[11]見表2).如圖3-A所示,正常對照組小鼠結腸黏膜上皮組織完整,結構清晰,上皮細胞排列整齊,腺體完整,無病變.模型組小鼠的結腸組織黏膜廣泛缺失,腺體多數(shù)不完整,炎癥細胞廣泛浸潤直至肌層,呈典型炎癥改變,多數(shù)結腸受損面積超過整個結腸的50%,肌層明顯增厚有纖維化表現(xiàn),炎癥程度十分嚴重(圖3-B、C箭頭線及圓圈).而四逆湯干預組黏膜損傷較輕,未見或少見炎癥細胞浸潤及彌漫,肌層略增厚,炎癥程度較輕(圖3-D箭頭線).表3小鼠腸炎病理組織學評分顯示,正常對照組各項得分均為0分,模型組的炎癥嚴重程度、炎癥浸潤范圍及隱窩損傷各項得分均顯著高于正常對照組和四逆湯干預組,四逆湯干預組對炎癥的改善作用明顯.

表2 結腸炎組織學評分方法

a.正常對照組 b.模型組 c.模型組 d.四逆湯組圖3:各組小鼠結腸組織HE染色(×40)

表3 小鼠腸炎病理評分(Mean±SD)

評分項CTLDSSSND炎癥嚴重程度02.7±0.45##1.9±0.22??#炎癥浸潤范圍02.6±0.42##2.1±0.22?##隱窩細胞損傷03.3±0.97##1.7±0.84??#總分08.6±1.64##5.7±0.84??##

注:與模型組比較,*P<0.05,**P<0.005,與正常對照組比較#P<0.05,##P<0.005.

2.4四逆湯對小鼠結腸組織炎癥因子表達水平的影響

在兩個DSS造模過程中,采用ELISA法檢測小鼠結腸組織IL-6、IL-10、IL-17和TNF-α等炎癥因子表達(圖4).如圖4-A所示,IL-6作為腸炎典型炎癥因子在模型組表達量顯著高于四逆湯干預組的表達量.IL-17在各組表達趨勢與IL-6相同,模型組的IL-17表達水平顯著高于四逆湯干預組,四逆湯干預組表達水平與正常對照組接近(圖4-B).IL-10在各組表達趨勢與IL-6和IL-17相反,四逆湯干預組表達水平顯著高于模型組表達水平且接近正常對照組(圖4-C).TNF-α表達量在四逆湯干預組表達水平顯著高于模型組(圖4-D).在急性期即第1個DSS周期,四逆湯干預組和模型組4個細胞因子表達水平無顯著差異,在慢性期即第2個DSS周期,四逆湯干預組明顯降低了炎癥因子的表達.

圖4 小鼠結腸組織細胞因子表達注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.005,與正常對照組比較#P<0.05,##P<0.005.

3討論

潰瘍性結腸炎是一種病因尚不十分清楚的以黏膜和黏膜下層浸潤為主、特發(fā)于結腸和直腸的慢性非特異性炎癥性疾病.病程漫長,常反復發(fā)作.臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液樣膿血便、里急后重等.目前認為UC的發(fā)病主要涉及免疫異常、遺傳、腸道菌群紊亂、黏膜屏障等因素[11-12].傳統(tǒng)治療方案的主要治療目標是通過使用氨基水楊酸類抗炎藥、免疫抑制劑或者結腸切除術等方案,誘導或者維持UC于緩解期,但用后相關并發(fā)癥逐漸增多.尋找新的有效的UC治療藥物與方法,是當前迫切需要解決的棘手難題.

四逆湯源自張仲景的《傷寒論》,由炙附子、干姜、炙甘草3藥組成,為溫里劑,具有回陽救逆之功效.現(xiàn)有研究表明,四逆湯具有抗休克、抗動脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)、保護心血管、保護腸黏膜及治療糖尿病并發(fā)癥等藥理作用.本課題組在對四逆湯的前期研究中發(fā)現(xiàn),該方劑對小鼠UC有顯著的治療效果.為進一步明確四逆湯在預防或治療潰瘍性結腸炎中的作用,本研究通過建立DSS誘導UC疾病小鼠模型,給予四逆湯干預,評估四逆湯的干預效果.DAI評分結果顯示四逆湯可改善腸炎中體重下降、稀便、血便等癥狀,且四逆湯對慢性期腸炎改善效果明顯優(yōu)于急性期;病理評分結果顯示四逆湯能夠保護腸黏膜,維持腸上皮的完整性,減少隱窩細胞的損傷和炎癥細胞的浸潤,減輕炎癥程度.潰瘍性結腸炎腸道炎癥的啟動及其慢性化在很大程度上可能與促炎因子和抗炎因子的失衡有關.UC患者腸黏膜中促炎細胞因子水平升高,抗炎細胞因子水平下降,從而產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)功能紊亂,導致UC的發(fā)病.研究表明,與UC相關的主要促炎細胞因子有IL-6、IL-17、IL-1β[13-15],而主要的抗炎細胞因子有IL-4、IL-10、IL-13等,其中IL-10的抗炎作用已通過基因敲除小鼠得到了證實[16-18].IL-6可通過STAT-3信號途徑激活核因子(NF-κB)誘導細胞因子的表達,血清IL-6水平可反映UC的嚴重程度[19].本研究中,四逆湯顯著降低了結腸組織中IL-6、IL-17的表達水平,這可能與其抑制stat3,JNK等信號通路的表達有關,同時四逆湯也使得腸上皮中抗炎因子IL-10的表達有所增加.抑制促炎因子的表達,促進抗炎因子的表達,這可能是其對UC發(fā)揮改善作用的原因之一.而反常的是與正常對照組比較,四逆湯增加了TNF-α在腸上皮中的表達,這與以往的多數(shù)研究結果相反,通常TNF-α能促使中性粒細胞聚集,啟動炎性反應及免疫應答[20].然而有研究表明,TNF-α雖然會誘發(fā)炎性疾病,但在疾病發(fā)生期間也具有相反的保護作用.因為上皮細胞TNF-α是先天免疫系統(tǒng)不可或缺的一部分,TNF-α的產(chǎn)生,部分是針對腸腔中破壞黏膜完整性的抗原的,這種保護作用是由增加上皮先天免疫介導的,結果使得獲得性免疫系統(tǒng)的細胞不被募集,進而抑制了炎癥級聯(lián)的發(fā)作[21-22].因此,我們推測四逆湯可能通過促進TNF-α的表達,刺激而不是抑制上皮先天免疫而發(fā)揮保護作用,這一推測還需要進一步的研究加以驗證.

本研究中,我們建立了由DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠模型評價中藥復方四逆湯對潰瘍性結腸炎的干預效果并初步探討其作用機制.四逆湯通過改善腹瀉、便血等癥狀保護腸黏膜,抑制促炎因子IL-6、IL-17的表達,促進抗炎因子IL-10的表達,調(diào)節(jié)促炎因子和抗炎因子之間的平衡,并可能通過增加TNF-α的產(chǎn)生誘發(fā)天然免疫從而干預實驗性潰瘍性結腸炎且作用顯著.本研究為四逆湯在預防或治療潰瘍性結腸炎中的應用提供了實驗依據(jù),為經(jīng)典方四逆湯“溫中散寒”的功效與應用提供現(xiàn)代科學內(nèi)涵.