廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021

肝細(xì)胞癌是全世界范圍危害人類生命健康的常見腫瘤，在中國常見惡性腫瘤中發(fā)病率排第4位，死亡率排第2位［1］。雖然肝癌的早期發(fā)現(xiàn)和手術(shù)治療在全世界已經(jīng)取得很大的進(jìn)展，但由于肝癌惡性程度極高，發(fā)展隱匿，進(jìn)展速度快，大多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)入中晚期，預(yù)后都比較差，5年生存率低至12%［2］。晚期肝癌的治療迫切需要尋求新的系統(tǒng)療法來改善患者的預(yù)后，而腫瘤免疫治療是很有潛力的發(fā)展方向之一。

程序性死亡［蛋白］配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，在T細(xì)胞、B細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，通過與程序性死亡［蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）相互作用抑制CD8+T淋巴細(xì)胞增殖和存活并影響腫瘤浸潤性T細(xì)胞的功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸［3］。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中PD-L1過表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲呈正相關(guān)［4］。然而，PD-L1在肝癌中過表達(dá)的具體機(jī)制仍不清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道［5］，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription-3，STAT3）在多種癌癥中與PD-L1的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)，STAT3信號通路的異常激活可誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤逃避免疫監(jiān)視。PTPRD是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的重要成員，參與細(xì)胞內(nèi)許多重要信號的調(diào)控［6］。PTPRD基因缺失或表觀遺傳學(xué)的變化與STAT3信號通路異常激活密切相關(guān)，PTPRD基因沉默可誘導(dǎo)STAT3異常激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和分化，同時(shí)抑制免疫活性［7］。但PTPRD和PD-L1表達(dá)是否存在相關(guān)性，目前鮮見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬檢測肝癌組織中PTPRD和PD-L1基因的表達(dá)，同時(shí)構(gòu)建PTPRD穩(wěn)定表達(dá)的HepG2肝癌細(xì)胞系，旨在觀察PTPRD和PD-L1在肝癌細(xì)胞的表達(dá)相關(guān)性及兩者相互調(diào)節(jié)的潛在機(jī)制，探索肝癌免疫治療的新靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 臨床標(biāo)本收集

收集2018年10月—2019年1月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝二病區(qū)原發(fā)性肝癌手術(shù)治療的16例肝癌患者的腫瘤標(biāo)本及其癌旁標(biāo)本（距腫瘤邊緣＞5.0 cm）。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。標(biāo)本收集在術(shù)前征得患者同意，且通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑

人HepG2肝癌細(xì)胞購自上海美軒科技股份有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Gemini公司，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）擴(kuò)增試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，PTPRD過表達(dá)和陰性對照腺病毒上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。PTPRD、PD-L1和GAPDH引物購自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司，PTPRD、PD-L1、STAT3和p-STAT3抗體購自美國Abcam公司，GAPDH抗體購自北京博奧森生物技術(shù)公司，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購自美國Aboirse公司，ECL超敏發(fā)光顯影液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色與半定量分析

將烤干的切片脫蠟后用枸櫞酸緩沖液進(jìn)行高壓修復(fù)后，3% H2O2溶液溫育15 min，自來水沖洗后，用血清封閉10 min，最后加一抗PTPRD（1∶300）和PD-L1（1∶100），4 ℃溫育過夜。第2天，復(fù)溫后，PBS沖洗切片，加二抗溫育15 min，PBS沖洗，加三抗溫育10 min，PBS沖洗，最后用DAB顯色10 min，蘇木精復(fù)染，脫水，晾干，封片，病理顯微鏡觀察拍照并分析。用IPP軟件分析計(jì)算每例標(biāo)本中PTPRD和PD-L1的陽性細(xì)胞率，每個(gè)標(biāo)本選3個(gè)以上的高倍視野（×200）計(jì)數(shù)，結(jié)合每個(gè)樣本染色強(qiáng)度作為表達(dá)強(qiáng)度的綜合評分。陽性細(xì)胞所占的百分比評分：

①陽性細(xì)胞百分率：0%～5%為0 分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；② 陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度：0為無著色，1為淡黃色，2為棕黃色，3 為棕褐色。兩項(xiàng)乘積作為表達(dá)強(qiáng)度的總分。最后0為陰性（-），1～4為弱陽性（+），5～8為中等陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）［8］。

1.4 RTFQ-PCR檢測肝癌組織PTPRD和PD-L1 mRNA的表達(dá)水平

采用MiniBEST試劑盒提取組織內(nèi)總RNA，純度合格后，通過PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)：PTPRD上游引物為5’-TTTACACGAACACCCGTTGA-3’，下游引物為5’-CGGAGTCCGTAAGGGTTGTA-3；PD-L1上游引物為5’-TGTGGCATCCAAGATACAAACTCAAAG-3’，下游引物為5’-TCCTCCTCTGCTTTCGCCAGGTTC-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物為5’-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3’，下游引物為5’-TGTGGTCATGAG TCCTTCCA-3’。使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行RTFQ-PCR擴(kuò)增。RTFQ-PCR擴(kuò)增過程為：95 ℃預(yù)變性15 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)，收集信號。反應(yīng)體系20 μL，基因相對表達(dá)量用2-ΔΔCt計(jì)算分析。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HepG2細(xì)胞用含10%血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h更換1次培養(yǎng)基。將狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞以每孔5×105的細(xì)胞數(shù)目接種于6孔板中，設(shè)置PTPRD上調(diào)組（HepG2-PTPRD組）、陰性對照上調(diào)組（HepG2-NC組）、空載組（HepG2-CK組）、PTPRD下調(diào)組（HepG2-shRNA-PTPRD）和陰性對照下調(diào)組（HepG2-shRNA-NC），當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)50%～60%時(shí)，根據(jù)病毒轉(zhuǎn)染說明書，以適當(dāng)?shù)母腥局笖?shù)計(jì)算相應(yīng)病毒體積，并感染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染10～12 h后更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48和72 h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，熒光蛋白發(fā)光效率為90%以上，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 RTFQ-PCR檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組PTPRD和PD-L1 mRNA的表達(dá)水平

采用過柱法提取各組細(xì)胞總RNA，提取、反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增反應(yīng)方法同1.4。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

轉(zhuǎn)染72 h后，分別提取各組細(xì)胞總蛋白，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法檢測各組蛋白的濃度。按說明書加蛋白上樣緩沖液，混勻后，高溫煮沸至蛋白變性，冷卻至室溫后將樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）并電轉(zhuǎn)至PⅤDF膜上，經(jīng)5%BSA室溫?fù)u床上封閉1 h后溫育一抗PTPRD（1∶500）、PD-L1（1∶1 000）、STAT3（1∶2 000）、p-STAT3（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000），置于冰箱中4 ℃過夜。二抗（1∶8 000）室溫?fù)u床溫育1 h，ECL顯影并拍照后Image J分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，臨床樣本免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)采用Fisher精確概率法檢驗(yàn)，定量資料以表示，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及單因素方差分析分析差異性，用Spearman等級相關(guān)分析分析相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTPRD和PD-L1的表達(dá)與臨床病理學(xué)因素的關(guān)系

對16例肝癌組織免疫組織化學(xué)的結(jié)果分析顯示，與癌旁組織相比，肝癌癌組織中PTPRD表達(dá)減弱，而PD-L1表達(dá)增強(qiáng)（圖1A）。利用Spearman相關(guān)分析PTPRD和PD-L1在肝癌組織上的表達(dá)評分，顯示PTPRD與PD-L1表達(dá)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（r2=0.275 8，P＜0.05，圖1B）。在這16例病例分析中，肝癌組織中PD-L1的高表達(dá)與乙肝病毒表面抗原（HBsAg）有關(guān)（P＜0.05），與患者年齡、甲胎蛋白值、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和巴塞羅那分期等臨床病理學(xué)特征無關(guān)；同時(shí)，PTPRD的低表達(dá)與患者年齡、HBsAg、甲胎蛋白值、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和巴塞羅那分期等無關(guān)（表1）。

圖1 PTPRD和PD-L1在肝癌組織中蛋白表達(dá)相關(guān)性Fig.1 PTPRD expression correlates with PD-L1 levels in hepatocellular carcinoma

表1 16例肝細(xì)胞肝癌患者PTPRD及PD-L1的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系Tab.1 The relationship among the expressions of PTPRD and PD-L1 in paracancerous tissues and the clinicopathological characteristics of 16 hepatocellular carcinoma patients

2.2 肝癌組織中PTPRD和PD-L1 mRNA表達(dá)水平及相關(guān)性分析

肝癌癌組織中PTPRD基因表達(dá)顯著低于癌旁組織，而PD-L1基因表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2A）。利用Spearman相關(guān)分析顯示，PTPRD與PD-L1 mRNA表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)趨勢，與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果相似（圖2B）。

圖2 RTFQ-PCR檢測肝癌和癌旁組織中PTPRD和 PD-L1 mRNA的表達(dá)Fig.2 PTPRD and PD-L1 mRNA levels in hepatocellular carcinoma and paracancerous tissues evaluated by RTFQ-PCR

2.3 PTPRD基因改變對HepG2細(xì)胞中PTPRD和PD-L1表達(dá)的影響

HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，采用RTFQ-PCR和Western blot檢測PTPRD和PD-L1 mRNA表達(dá)和蛋白水平。結(jié)果顯示，與空白組相比，PTPRD上調(diào)組的PTPRD mRNA（1.00±0.00vs2.17±0.34）和蛋白（0.70±0.28vs1.47±0.13）的表達(dá)水平均增高，PTPRD 沉默組的PTPRD mRNA（1.00±0.00vs0.24±0.07）和蛋白（0.70±0.28vs0.38±0.02）的表達(dá)水平有所下降，PTPRD mRNA的表達(dá)水平增高率或下降率均達(dá)75%以上。與空白組相比，PD-L1 mRNA（1.00±0.00vs0.60±0.08）和蛋白（1.68±0.07vs1.09±0.16）的表達(dá)水平在PTPRD上調(diào)組中下降；在PTPRD下調(diào)組中PD-L1 mRNA（1.00±0.00vs5.91±1.40）和蛋白的表達(dá)水平（1.68±0.07vs1.28±0.03）升高（P＜0.05，圖3）。

圖3 上調(diào)或沉默PTPRD基因后PTPRD、PD-L1 mRNA表達(dá)和蛋白水平的變化Fig.3 The changes of PTPRD and PD-L1 mRNA expressions and protein level after overexpression or knockdown of PTPRD

2.4 PTPRD通過STAT3信號通路抑制肝癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)

為研究PTPRD對PD-L1的表達(dá)是否有調(diào)控作用，本研究進(jìn)一步在PTPRD基因上調(diào)的HepG2細(xì)胞中檢測STAT3和p-STAT3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與空白對照組、陰性對照組相比，PTPRD上調(diào)組中STAT3和p-STAT3蛋白的表達(dá)量顯著下降，與PD-L1蛋白表達(dá)水平變化一致，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

圖4 上調(diào)PTPRD基因后STAT3、p-STAT3和PD-L1蛋白水平的變化Fig.4 The changes of STAT3,p-STAT3 and PD-L1 protein level in HepG2 cell after transfection

3 討 論

肝癌是消化道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，一些臨床前實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)均表明，肝細(xì)胞癌腫瘤內(nèi)微環(huán)境具有高度免疫抑制性，晚期肝細(xì)胞癌中效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)極差［9］。腫瘤免疫逃逸是肝癌進(jìn)一步發(fā)展惡化的重要原因之一，腫瘤細(xì)胞PD-L1的過表達(dá)可促進(jìn)腫瘤免疫逃逸［10］。PD-1/PD-L1抑制劑可以靶向抑制PD-1/PD-L1信號通路，誘導(dǎo)抗原肽-組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）與T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）重新結(jié)合，激活T淋巴細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答，抑制腫瘤細(xì)胞的生長［9］。近年來，使用PD-1/PD-L1抑制劑如納武單抗和派姆單抗等的免疫療法在非小細(xì)胞肺癌和胃癌等多種癌癥的治療中取得了巨大成功［11］。在2019年美國癌癥研究協(xié)會(huì)大會(huì)上，一項(xiàng)關(guān)于pembrolizumab聯(lián)合樂伐替尼治療不可切除肝癌的研究報(bào)道，聯(lián)合療法達(dá)到了50%的有效率和93.3%的控制率，且安全性良好［12］。此研究展現(xiàn)了免疫療法在肝癌治療上的廣闊前景，給不可切除和晚期肝癌患者帶來更多生的希望。

有文獻(xiàn)報(bào)道［13］，PTPRD是多種腫瘤的抑制因子。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［14］，PTPRD的mRNA表達(dá)和蛋白水平在LO2人正常肝細(xì)胞中均顯著高于HepG2和Huh7肝癌細(xì)胞，且PTPRD基因上調(diào)后，可明顯抑制HepG2和Huh7肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。已有大量研究顯示［15-17］，在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胰腺癌和肝癌等惡性腫瘤中PTPRD基因拷貝數(shù)的缺失或突變可以使STAT3活性增高，加快腫瘤細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)PTPRD過表達(dá)后可抑制腫瘤細(xì)胞的生長。研究發(fā)現(xiàn)［18］，腫瘤細(xì)胞異常激活的STAT3與PD-L1的啟動(dòng)子結(jié)合，激活DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1和甲基化啟動(dòng)子區(qū)域，抑制免疫蛋白酶體和MHC分子的表達(dá)，誘導(dǎo)PD-L1上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。在本研究中，我們分別分析了16例肝癌癌組織和16例癌旁組織PTPRD和PD-L1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTPRD在肝癌組織中呈低表達(dá)，PD-L1則過表達(dá)，二者表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性。PD-L1的高表達(dá)與腫瘤HBsAg有關(guān)，與患者年齡、甲胎蛋白值、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和巴塞羅那分期等臨床病理學(xué)特征無關(guān)；同時(shí)，PTPRD的低表達(dá)與患者年齡、HBsAg、甲胎蛋白值、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和巴塞羅那分期等均無關(guān)，這可能與收集樣本例數(shù)較少有關(guān)，這也是本實(shí)驗(yàn)的局限之處，導(dǎo)致在病理學(xué)特征統(tǒng)計(jì)上會(huì)存在偏倚。但從PTPRD和PD-L1存在負(fù)相關(guān)性可說明在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中，PTPRD基因缺失或突變后可能通過某種途徑影響PD-L1的轉(zhuǎn)錄或蛋白表達(dá)過程。為進(jìn)一步驗(yàn)證PTPRD基因?qū)D-L1的調(diào)節(jié)作用，我們分別構(gòu)建PTPRD過表達(dá)和沉默的HepG2肝癌細(xì)胞系，觀察PTPRD基因表達(dá)變化對PD-L1表達(dá)水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTPRD在肝癌細(xì)胞中可負(fù)向調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)，當(dāng)PTPRD基因上調(diào)時(shí)，PD-L1在mRNA和蛋白水平均顯著下降；當(dāng)PTPRD基因靜默后，PD-L1的表達(dá)有所增高。為了闡明PTPRD調(diào)節(jié)PD-L1的分子機(jī)制，我們在PTPRD過表達(dá)的HepG2肝癌細(xì)胞中檢測STAT3和p-STAT3蛋白的變化情況，結(jié)果顯示，當(dāng)PTPRD上調(diào)時(shí)，STAT3和p-STAT3蛋白顯著下降，與PD-L1變化趨勢一致。我們推測，在肝細(xì)胞癌中PTPRD缺失后可能通過STAT3通路調(diào)控PD-L1的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤微環(huán)境的免疫力。

綜上所述，在肝癌中PTPRD與PD-L1 mRNA表達(dá)及蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，PTPRD調(diào)節(jié)PD-L1表達(dá)的機(jī)制可能部分地通過調(diào)節(jié)STAT3信號通路。本研究可望為肝癌免疫治療提供新的靶點(diǎn)，PTPRD基因?qū)D-L1的具體調(diào)控機(jī)制及是否會(huì)影響其下游相關(guān)因子PD-1進(jìn)而影響免疫細(xì)胞T細(xì)胞的活性將是我們接下來的研究重點(diǎn)，我們將結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)深入探討PTPRD的免疫調(diào)控功能，為提高肝癌免疫治療效果尋找突破口。