燕飛虎，鄒 瑞，王一堯，王芳芳，冉浩男，王 燕

1.海南省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結合科，海南 ?？?570100；

2.海南省腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科，海南 海口 570100；

3.海南省腫瘤醫(yī)院放療科，海南 海口 570100；

4.海南省腫瘤醫(yī)院血液腫瘤科，海南 ?？?570100

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率位居中國惡性腫瘤前列［1］，其早期臨床癥狀非常隱匿，一般確診時已是中晚期。找到有效的生物標志物對胃癌進行早期篩查和檢測，有利于對患者及時治療，提高患者的生存率。胃癌的發(fā)病機制較復雜，可能與環(huán)境、幽門螺桿菌感染、遺傳等多種因素有關［2］，其中基因異常表達與腫瘤的關系是近年來的研究熱點。蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5（protein arginine methyltransferase 5，PRMT5）是一種能調(diào)控細胞周期的酶，其定位于哺乳動物細胞的細胞質(zhì)和細胞核，在多種腫瘤中均有異常表達，并能影響患者的預后［3-5］。目前關于PRMT5在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用的相關研究尚少見。本研究觀察PRMT5在胃癌組織中的表達水平，旨在探討其對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移能力的影響，為臨床診療提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2016年5月—2019年1月在海南省腫瘤醫(yī)院確診為胃癌并進行手術治療的患者的胃癌組織及其癌旁組織（距離癌組織＞5 cm）標本88例。其中男性48例，女性40例；年齡45～70歲，平均（54.33±10.47）歲。收集方式：確診患者行胃癌手術時在胃鏡觀察下切下胃癌組織；保存方式：將切下的2～3塊胃癌組織經(jīng)液氮快速冷凍后置-80 ℃保存以備提取基因組DNA。

1.2 納入標準與排除標準

納入標準：符合胃癌的臨床診斷標準［6］，并經(jīng)病理學檢查確診；年齡＞18歲；術前均未進行放化療等相關治療。排除標準：合并其他系統(tǒng)或器官腫瘤者；處于妊娠或哺乳期者；臨床資料不全者。本研究經(jīng)海南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準實施。

1.3 方法

1.3.1 主要材料與試劑

實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）試劑盒、10%胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、磷脂酰絲氨酸結合蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（AnnexinⅤ-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒、細胞轉(zhuǎn)染試劑盒均購自上海滬震生物科技有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，聚丁二酸丁二醇酯［poly（1,4-butylene succinate），PBS］、苯酚購自北京康普匯維科技有限公司，TRIzol 總RNA提取試劑購自合肥博美生物科技有限公司，PRMT5單克隆抗體、內(nèi)參GAPDH抗體、Transwell小室均購自上海安研商貿(mào)有限公司，人胃癌細胞系SGC-7901由海南省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學與腫瘤研究中心提供。

1.3.2 主要儀器

WS-300恒溫培養(yǎng)箱購自上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司，YKDZ-55顯微鏡購自上海永科光學儀器有限公司，DXFLEX流式細胞檢測儀購自美國貝克曼庫爾特公司，酶標儀購自上海纖檢儀器有限公司，DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀購自上虞艾科儀器設備有限公司，DP/ZB紫外線投射儀購自北京亞歐德鵬科技有限公司。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測PRMT5在胃癌組織中的表達

將88例胃癌組織和癌旁正常組織標本放入預冷的研缽中，研磨成粉，加入適量RIPA裂解液，裂解30 min后，離心15 min，取上清液。按照BCA試劑盒說明書上的操作步驟檢測蛋白濃度。將蛋白樣品和上樣緩沖液充分混勻，置于沸水中煮沸變性5 min，將變性的蛋白放入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠上樣孔中，每孔加入25 μL，經(jīng)凝膠電泳分離蛋白組分后，將蛋白轉(zhuǎn)印于聚偏二氟乙烯膜上，加入5%脫脂奶粉封閉2 h；加入PRMT5單克隆抗體（1∶500）于4 ℃低速搖動溫育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000）于37 ℃低速搖動溫育45 min，以GAPDH為內(nèi)參，電化學發(fā)光顯色后膠片曝光并分析結果。PRMT5蛋白在胃癌組織中的表達量以胃癌組織PRMT5條帶灰度值與對應的GAPDH條帶灰度值之比表示。

1.3.4 細胞培養(yǎng)

從液氮中取出細胞系，于37 ℃溶解后加到含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，離心去除上清液，向細胞沉淀物中加入細胞培養(yǎng)液懸浮細胞，接種到細胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、濕度95%、CO2體積分數(shù)為5%的環(huán)境中培養(yǎng)24 h。當細胞融合度達到90%以上時，去除培養(yǎng)液，用胰蛋白酶消化細胞，將對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3.5 細胞轉(zhuǎn)染

將對數(shù)生長期的SGC-7901細胞以105個細胞/mL接種至6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2 mL，培養(yǎng)過夜。按照LipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染分3組：PRMT5小干擾RNA（PRMT5-siRNA）組加入12 μL PRMT5-siRNA轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞；陰性對照無意義siRNA序列（siRNANC）組加入12 μL siRNA空載對照轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞；對照組為未轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞。

靶向PRMT 5 的siRNA 序列順義鏈為5’-GGGACUGGAAUACGCUAAUTT-3’，反義鏈為5’-AUUAGCGUAUUCCAGUCCCTT-3’；陰性對照（si）序列順義鏈為5’-UUCUCCGA ACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈為5’-ACGUG ACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.3.6 轉(zhuǎn)染后細胞中PRMT5 mRNA表達和蛋白水平檢測

轉(zhuǎn)染24 h后，將1.3.5中的3組細胞用TRIzol法提取總RNA，用RTFQ-PCR試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應，將cDNA，產(chǎn)物進行PCR擴增：95 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，72 ℃ 10 min，35個循環(huán)，分別取5 μL RTFQ-PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下拍照，采用Image Pro Plus圖像分析軟件比較電泳條帶相對光密度值，以GAPDH為內(nèi)參基因，分析PRMT5 mRNA相對表達量。取轉(zhuǎn)染48 h后1.3.5中3組細胞，轉(zhuǎn)移細胞至新的離心管，離心5 min，加入TRIzol并進行裂解反應30 min，離心取上清液，BCA蛋白定量試劑檢測蛋白濃度，按照1.3.3方法檢測各組細胞PRMT5蛋白表達水平。

1.3.7 細胞增殖檢測

將轉(zhuǎn)染24 h的上述3組細胞以3×105個/mL分別接種于96孔板細胞培養(yǎng)板中，每孔加入150 μL細胞懸液，置于37 ℃、濕度95%、CO2體積分數(shù)為5%的環(huán)境中分別培養(yǎng)12、24和48 h后，每孔加入細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑10 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h，用酶標儀測定各組450 nm處的光密度（D）值，計算細胞增殖率。細胞增殖率=（D轉(zhuǎn)染組細胞/D對照組細胞）×100%。

1.3.8 細胞凋亡檢測

取培養(yǎng)24 h的1.3.5中各組細胞，將細胞分別重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基中，將重懸后的各組細胞接種于96孔板中，4×103個/孔，于37 ℃、濕度95%、CO2體積分數(shù)為5%的環(huán)境中分別培養(yǎng)12、24和48 h后，胰蛋白酶消化重懸，轉(zhuǎn)移至離心管，調(diào)整每管細胞數(shù)約為1×105個，預冷PBS洗滌2次，按照凋亡試劑盒說明，向細胞中加入AnnexinⅤ10 μL，避光溫育10 min，預冷PBS洗滌2次，向每管中加入PI溶液4 μL，立即采用流式細胞術檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/（正常細胞數(shù)+凋亡細胞數(shù)）×100%。

1.3.9 細胞遷移能力檢測

取培養(yǎng)24 h的1.3.5中各組細胞，將其接種于24孔板內(nèi)培養(yǎng)，待細胞長滿單層后，用滅菌200 μL吸嘴在細胞單層上劃痕，用倒置顯微鏡觀察劃痕區(qū)域?qū)挾炔⑴恼?，然后置于培養(yǎng)箱中溫育24 h后在倒置顯微鏡下觀察劃痕區(qū)域?qū)挾茸兓?，用Image軟件測量劃痕區(qū)域?qū)挾?，計算各組細胞對應細胞的劃痕愈合率，每組細胞設置3個復孔，取平均值為最終結果。

1.3.10 細胞侵襲能力檢測

將Transwell小室進行包被Matrigel基底膠處理。在24孔中加入含10%無雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μL，將小室放在其中進行水化預處理，小室上孔加入含10%血清培養(yǎng)基，于37 ℃、濕度95%、CO2體積分數(shù)為5%的環(huán)境中培養(yǎng)24 h，取出小室，多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色液染色15 min。隨機選取5個視野拍照計數(shù)。

1.3.11 Western blot檢測蛋白水平

取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的1.3.5中各組細胞，按照1.3.3 中方法提取細胞蛋白并檢測培養(yǎng)48 h時cleaved caspase 3、磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）和磷酸化AKT（phosphorylated-AKT，p-AKT）蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計學處理

以Bioimagining System灰度測量系統(tǒng)測量條帶灰度值；采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料用頻數(shù)表示，比較用χ2檢驗，計量資料用（）表示，比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PRMT5在胃癌組織中高表達

Western blot檢測結果顯示，胃癌組織中PRMT5的蛋白相對表達量（0.54±0.64）高于癌旁組織（0.24±0.05）（P＜0.01，圖1）。

圖1 PRMT5在胃癌組織中的表達Fig.1 Expression of PRMT5 in gastric cancer tissues

2.2 胃組織中PRMT5蛋白表達水平與病理學分級及淋巴結轉(zhuǎn)移呈正相關

經(jīng)統(tǒng)計分析可知，PRMT5蛋白表達量在不同胃癌病理分級、TNM分期及是否有淋巴結轉(zhuǎn)移患者中差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），而在不同性別、年齡患者中差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05，表1）。

2.3 siRNA能沉默人胃癌細胞系SGC-7901 PRMT5基因的表達

空脂質(zhì)體、siRNA-NC、PRMT5-siRNA轉(zhuǎn)染人胃癌細胞系SGC-7901 48 h后，RTFQ-PCR和Western blot檢測各組織中PRMT5 mRNA表達和蛋白水平。結果顯示，siRNA-NC組細胞中PRMT5 mRNA和蛋白相對表達量（0.83±0.32）與對照組（0.81±0.40）相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），PRMT5-siRNA組細胞中PRMT5 mRNA（0.21±0.31）和蛋白相對表達量（0.39±0.30）低于對照組和siRNA-NC組（0.41±0.29、0.83±0.32）（P＜0.05，圖2）。

表1 PRMT5表達水平與胃癌臨床特征的關系Tab.1 Relationship between expression level of PRMT5 and clinical features of gastric cancer

圖2 PRMT5在轉(zhuǎn)染后細胞中的表達Fig.2 Expression of PRMT5 in cells after transfection

2.4 沉默PRMT5能抑制人胃癌細胞系SGC-7901增殖

在12 h時，PRMT5-siRNA組細胞增殖率為（8.01±1.00）%，顯著低于siRNA-NC組的（21.10±2.14）%和對照組的（22.21±2.00）%（圖3）。

圖3 沉默PRMT5對人胃癌細胞系SGC-7901增殖的影響Fig.3 Effects of silencing PRMT5 on proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901

2.5 沉默PRMT5能促進胃癌細胞系SGC-7901凋亡

PRMT5-siRNA組Cleaved caspase 3蛋白相對表達量為0.75±0.04，顯著高于對照組的0.21±0.02和siRNA-NC組的0.22±0.02。12 h時PRMT5-siRNA組細胞凋亡率為（12.21±1.01）%，顯著高于對照組的（2.10±0.10）%和siRNA-NC組的（2.30±0.12）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；24 h時PRMT5-siRNA組細胞凋亡率為（17.25±3.01）%，顯著高于對照組的（4.25±0.89）%和siRNA-NC組的（4.15±0.98）%；48 h時PRMT5-siRNA組細胞凋亡率為（20.89±5.21）%，顯著高于對照組的（5.21±1.02）%和siRNA-NC組的（5.20±1.11）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4）。

圖4 沉默PRMT5對人胃癌細胞系SGC-7901凋亡的影響Fig.4 Effects of silencing PRMT5 on apoptosis of human gastric cancer cell line SGC-7901

2.6 PRMT5能抑制人胃癌細胞系SGC-7901遷移和侵襲能力

PRMT5-siRNA組劃痕愈合率為（42.52±5.32）%，顯著低于對照組的（84.88±7.65）%和siRNA-NC組的（84.25±7.52）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；PRMT5-siRNA組細胞侵襲數(shù)（22.21±1.36）個，顯著低于對照組的（240.69±16.98）個和siRNA-NC組的（241.31±17.52）個，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖5）。

圖5 沉默PRMT5對人胃癌細胞系SGC-7901遷移能力和侵襲能力的影響Fig.5 Effects of silencing PRMT5 on migration and invasion abilities of human gastric cancer cell line SGC-7901

2.7 抑制PRMT5的表達對P13K、AKT、p-AKT蛋白水平的影響

各組細胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，Western blot檢測結果顯示，PRMT 5-siRNA 組P13K、AKT、p-AKT蛋白相對表達分別為0.11±0.02、0.2 1±0.01、0.2 3±0.02，顯著低于對照組（0.22±0.02、0.58±0.06、0.57±0.08）和siRNA-NC 組（0.2 3±0.03、0.58±0.05、0.57±0.07），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖6）。

圖6 抑制PRMT5的表達對P13K、AKT、p-AKT蛋白水平的影響Fig.6 Effects of PRMT5 inhibition on level of P13K,AKT and p-AKT

3 討 論

胃癌惡性程度高，生存率低，預后較差［7］。探討胃癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的病理生理機制對胃癌的預防和治療具有重要意義。PRMT5是一種Ⅱ型蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，它可改變生物的遺傳表觀特性，能阻礙抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，還能調(diào)控細胞周期，促進多種腫瘤細胞異常增殖，與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關［8-10］。目前國內(nèi)外關于PRMT5與胃癌細胞增殖、凋亡、遷移關系的研究較少。

基因在癌組織或鄰近正常組織中異常表達，則認為該基因可能具有潛在的調(diào)控癌細胞增殖及凋亡的作用［11-12］。Kanda等［11］研究發(fā)現(xiàn)，PRMT5在胃癌組織中高表達，與胃癌的惡性轉(zhuǎn)移有關。Kong等［13］實驗指出，使用PRMT5抑制劑可抑制胃癌細胞生長。本研究結果顯示，胃癌組織的PRMT5蛋白相對表達量顯著高于癌旁組織。本研究結果與上述研究結果一致，說明PRMT5高表達是胃癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素，可能是潛在調(diào)控胃癌細胞增殖的致癌基因。

腫瘤分化程度的高低、對周圍組織或器官的侵犯與否、侵犯的程度及淋巴結轉(zhuǎn)移是評估腫瘤患者病情嚴重程度及預后的重要指標。Kong等［13］研究表明，PRMT5蛋白相對表達量與胃癌患者的TNM分期、遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關。本研究結果顯示，PRMT5蛋白相對表達量在病理分級、TNM分期更高、有淋巴結轉(zhuǎn)移的患者中更高。本研究觀點與上述研究觀點一致，提示PRMT5高表達與胃癌的轉(zhuǎn)移惡化密切相關。

RNA干擾是指由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA的基因沉默，該技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，可用于基因功能的探索及惡性腫瘤的基因治療［14-15］。如沉默P27RF-Rho基因可降低肝癌細胞的增殖和侵襲能力［16］。胃癌細胞的增殖分化可通過沉默長鏈非編碼RNAUCA1基因?qū)崿F(xiàn)，可作為腫瘤基因靶向治療的依據(jù)［17］。目前關于沉默PRMT5基因?qū)ξ赴┰鲋?、凋亡和遷移影響的研究較少，為進一步研究PRMT5基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究將PRMT5質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至胃癌細胞SGC-7901中，結果顯示，通過沉默PRMT5基因表達，可抑制胃癌細胞系SGC-7901的增殖、遷移并促進其凋亡，說明PRMT5促進胃癌的進展，這可能是因為，一方面PRMT5可能通過上調(diào)細胞周期蛋白和相關調(diào)節(jié)因子，加速癌細胞增殖分裂；另一方面，PRMT5可干擾組蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1甲基化轉(zhuǎn)錄因子E2F1［18］，而甲基化的E2F1是細胞凋亡的促進因子。

細胞凋亡也稱為“固縮壞死”、“程序性細胞死亡”或“細胞自殺”，是由基因介導的一系列的細胞學變化，是存在于細胞中的自毀機制［19］。正常情況下，通過這個過程，機體能清除衰老及異常細胞，并在維持很多細胞功能方面有重要作用，如該過程發(fā)生病理性干擾，腫瘤細胞則會因為存在凋亡缺陷而不斷增殖［20］。Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是細胞毒性T淋巴細胞殺傷機制的重要組成部分，其主要底物多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶與DNA修復、基因完整性監(jiān)護有關，能負調(diào)控使Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶的活性增高，裂解核小體間的DNA，引起細胞凋亡［21-22］。本研究中沉默PRMT5基因后檢測cleaved caspase 3蛋白表達結果顯示，沉默PRMT5能上調(diào)cleaved caspase 3的表達，說明沉默PRMT5的表達導致胃癌細胞系SGC-7901的凋亡率增加可能通過上調(diào)cleaved caspase 3的表達實現(xiàn)。

PI3K/AKT信號通路是腫瘤形成中至關重要的信號通路。該通路主導細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等過程，一旦紊亂會導致癌癥、神經(jīng)病變等［23］。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，與V-SRC和V-RAS等癌基因的產(chǎn)物相關，且PI3K本身具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性，當接受來自酪氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體的信號后，PI3K的p85調(diào)節(jié)亞基即被募集到臨近質(zhì)膜的部位，使AKT從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜上，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶2的輔助下，分別使AKT蛋白上的蘇氨酸磷酸化位點和絲氨酸磷酸化位點磷酸化而使其激活，刺激腫瘤細胞的增殖［24-25］。有研究顯示，胃癌細胞的凋亡可通過抑制PI3K/AKT信號通路實現(xiàn)［26］。也有文獻指出，胃癌細胞的遷移、侵襲能力降低與影響PI3K/AKT信號通路有關［27］。本研究結果顯示，沉默PRMT5能下調(diào)PI3K、p-AKT蛋白水平，且能降低胃癌細胞的遷移和侵襲能力，說明PRMT5促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，抑制其細胞凋亡是通過激活PI3K/AKT信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，PRMT5在胃癌組織中表達明顯升高，其表達水平與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、惡化密切相關，下調(diào)PRMT5的表達可明顯減弱胃癌細胞的增殖、遷移能力，同時促進胃癌細胞的凋亡。