張峰領(lǐng),袁 濤,王 靜,孫婷婷,鄧少麗△

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.肝膽外科，重慶 400042;3.重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心檢驗(yàn)科，重慶 400036)

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2017年大約有1 000萬例新發(fā)結(jié)核病，157萬結(jié)核病患者死亡。而人群中1/3均為結(jié)核桿菌感染者，其中5%～10%會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核[1-3]，我國是排在印度之后的第二大結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國，面臨的結(jié)核病防控形勢非常嚴(yán)峻，缺乏有效的診斷方法是困擾結(jié)核防控的重要原因?，F(xiàn)有的結(jié)核相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查如抗酸染色法、分離培養(yǎng)法是實(shí)驗(yàn)室診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但存在著陽性率低、檢測時(shí)間長等缺陷，結(jié)核菌素試驗(yàn)假陽性、假陰性都較高，γ干擾素釋放試驗(yàn)對結(jié)核桿菌感染具有較高的靈敏度和特異度，但不能區(qū)分潛伏性結(jié)核和活動(dòng)性肺結(jié)核[3-6]，因此，臨床上迫切需要輔助診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的新指標(biāo)。血液分析儀的VCS技術(shù)通過檢測細(xì)胞體積(Volume)、導(dǎo)電率(Conductivity)、多個(gè)角度的光散射(Scatter)，能準(zhǔn)確、快速地對8 000個(gè)白細(xì)胞的形態(tài)做全面評(píng)價(jià)[7-10]。有研究發(fā)現(xiàn)[11-13]，在病毒性感染性疾病及淋巴細(xì)胞相關(guān)白血病中，淋巴細(xì)胞VCS參數(shù)可發(fā)生明顯改變，目前筆者查閱文獻(xiàn)尚未見淋巴細(xì)胞VCS參數(shù)在結(jié)核診斷中的研究。本研究分析淋巴細(xì)胞VCS參數(shù)的變化，以評(píng)估其在活動(dòng)性肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用，包括高中角度光散射(UMALS)、中角度光散射(MALS)、低中角度光散射(LMALS)、低角度光散射(LALS)檢測細(xì)胞顆粒度和膜形貌軸向光損耗測量(AL2)，分析細(xì)胞透明度。同時(shí)獲得與細(xì)胞形態(tài)直接相關(guān)的3個(gè)形態(tài)參數(shù)對白細(xì)胞進(jìn)行檢測分析。在三維空間里，對細(xì)胞體積、大小、顆粒度多少進(jìn)行全方位檢測獲得一系列參數(shù)，準(zhǔn)確、快速地對白細(xì)胞內(nèi)部、外部形態(tài)進(jìn)行全面評(píng)價(jià)[14]。機(jī)體受到結(jié)核分枝桿菌感染后，淋巴細(xì)胞會(huì)被激活并釋放細(xì)胞因子抑制結(jié)核分枝桿菌[15]，其細(xì)胞體積大小及導(dǎo)電率也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年7月至2018年6月重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心及陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院活動(dòng)性肺結(jié)核患者97例，潛伏性結(jié)核113例，體檢健康者101例(健康對照組)，對其淋巴細(xì)胞VCS參數(shù)進(jìn)行檢測。根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 288—2017)，活動(dòng)性肺結(jié)核患者納入標(biāo)準(zhǔn)：痰培養(yǎng)、痰抗酸染色、分子診斷至少有1個(gè)陽性[15]，胸部X線片表現(xiàn)符合結(jié)核病影像學(xué)病變，所選病例均無抗結(jié)核藥物治療史。潛伏性結(jié)核患者納入標(biāo)準(zhǔn)：γ-干擾素釋放試驗(yàn)陽性，痰涂片和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)均陰性，無結(jié)核病的相關(guān)臨床癥狀[16]。健康對照納入標(biāo)準(zhǔn)：無結(jié)核患者接觸史，胸部X線片表現(xiàn)正常，結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)檢測(T-SPOT.TB)實(shí)驗(yàn)陰性，肝功、腎功、乙型肝炎、血常規(guī)檢查均正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡<18歲、孕婦、HIV病毒感染、癌癥、自身免疫性疾病患者，正在接受免疫抑制劑或已接受抗結(jié)核治療者均不入選。

1.2儀器與試劑 UniCel Coulter DxH800全自動(dòng)血液分析儀及原裝配套試劑和質(zhì)控品(美國Beckmanculter公司)；T-SPOT.TB 試劑盒(英國Oxford Immunotec公司)；RPM1640 細(xì)胞培養(yǎng)液(中國天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?；人全血淋巴細(xì)胞分離液和AIM-V?Medium CTS?(AIM-V)培養(yǎng)液(中國天津太平洋生物科技股份有限公司)。所用實(shí)驗(yàn)耗材均需高壓滅菌、干燥后才使用。

1.3方法

1.3.1VCS參數(shù)分析 各研究對象均抽取外周靜脈血3 mL于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)真空采血管，立即顛倒混勻，所有樣本在采集后4 h內(nèi)完成檢測，使用UniCel Coulter DxH800血液分析儀配套試劑和質(zhì)控品，標(biāo)本無凝血及溶血。檢測項(xiàng)目包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞百分比(LY%)、淋巴細(xì)胞VCS參數(shù)。VCS參數(shù)包括淋巴細(xì)胞平均體積(MLV)、淋巴細(xì)胞平均體積標(biāo)準(zhǔn)差(MLV-SD)、淋巴細(xì)胞平均導(dǎo)電率(MLC)、淋巴細(xì)胞平均導(dǎo)電率標(biāo)準(zhǔn)差(MLC-SD)、UMALS、UMALS標(biāo)準(zhǔn)差(UMALS-SD)、MALS、MALS標(biāo)準(zhǔn)差(MALS-SD)、LMALS、LMALS標(biāo)準(zhǔn)差(LMALS-SD)、LALS、LALS標(biāo)準(zhǔn)差(LALS-SD)、AL2、AL2標(biāo)準(zhǔn)差(AL2-SD)。

1.3.2T-SPOT.TB 實(shí)驗(yàn)和結(jié)果判讀 各研究對象使用肝素鈉真空采血管抽取4～8 mL外周靜脈全血，按照試劑說明書，每份標(biāo)本設(shè)置2個(gè)檢測孔和2個(gè)質(zhì)控對照孔，分別為特異性抗原A檢測孔(加入ESAT-6溶液50 μL)、特異性抗原B檢測孔(加入CFP-10溶液50 μL)、陽性質(zhì)控對照孔(加入PHA 50 μL)、空白對照孔(加入AIM-V 50 μL)，每孔加入按照說明書配置的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞液100 μL。加樣后將培養(yǎng)板放在37 ℃含%CO2培養(yǎng)箱孵育16～20 h。用200 μL新鮮準(zhǔn)備的無菌PBS洗板4次。拍干后每孔加入酶標(biāo)抗體50 μL(1∶200倍稀釋)，置2～8 ℃冰箱孵育1 h。取出后再次PBS洗板，拍干后每孔加入顯色液50 μL，室溫避光反應(yīng)7 min，以蒸餾水終止反應(yīng)。置于37 ℃，5% CO2孵箱2～3 h或室溫過夜干燥培養(yǎng)板，使用顯微鏡、放大鏡或自動(dòng)計(jì)數(shù)儀檢測孔內(nèi)結(jié)合在底膜上的特異性斑點(diǎn)數(shù)(清晰的紫色斑點(diǎn)、中間色深、周圍有淺色暈的點(diǎn))。結(jié)果判讀：(1)判讀為“有反應(yīng)性”(陽性)，見于①空白對照孔斑點(diǎn)計(jì)數(shù)為0～5個(gè)時(shí)且抗原A(或B)孔的斑點(diǎn)數(shù)減去空白對照孔的斑點(diǎn)數(shù)后，數(shù)值≥6；②空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)為6～10個(gè)時(shí)且抗原A(或B)孔的斑點(diǎn)數(shù)≥2倍空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)。(2)判讀為“無反應(yīng)性”(陰性)，見于不符合(1)的標(biāo)準(zhǔn)且陽性質(zhì)控對照孔正常時(shí)檢測結(jié)果為“無反應(yīng)性”。

2 結(jié) 果

2.1肺結(jié)核患者中淋巴細(xì)胞VCS參數(shù)的變化 活動(dòng)性肺結(jié)核組97例，年齡21～80歲，平均(49.800±14.500)歲，男性53例，女性44例；潛伏性結(jié)核組113例，年齡21～77歲，平均(50.200±17.700)歲，男性48例，女性65例；健康對照組101例，年齡19～82歲，平均(15.900±19.100)歲，男性51例，女性50例。3組在年齡、性別上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

淋巴細(xì)胞VCS參數(shù)的MLV、MLV-SD、MLC-SD、MALS-SD、UMALS-SD、LMALS-SD、LALS-SD、AL2-SD及LALS在活動(dòng)性肺結(jié)核組顯著高于潛伏性結(jié)核組和健康對照組(P<0.05)，但MALS、LMALS在活動(dòng)性肺結(jié)核組明顯低于潛伏性結(jié)核組和健康對照組(P<0.05)，淋巴細(xì)胞VCS參數(shù)的所有指標(biāo)在潛伏性結(jié)核組與健康對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2淋巴細(xì)胞VCS參數(shù)診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的靈敏度與特異度 根據(jù)約登指數(shù)選擇最佳臨界值，即ROC曲線上所有點(diǎn)的靈敏度和1-特異度之間差異最大時(shí)所取數(shù)值。進(jìn)行多指標(biāo)聯(lián)合診斷時(shí)，有任何一項(xiàng)為陽性即可判斷為陽性結(jié)果。通過對淋巴細(xì)胞VCS參數(shù)區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核與潛伏性結(jié)核感染的靈敏度與特異度分析，MLV-SD、MLC-SD、UMALS-SD、LALS-SD、AL2-SD獲得比其他參數(shù)更高的曲線下面積，分別為0.775、0.900、0.802、0.860、0.785，見表2。同時(shí)測量MLV-SD、MLC-SD、UMALS-SD、LALS-SD、AL2-SD可獲得曲線下面積高達(dá)0.920，并且其區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核與潛伏性結(jié)核感染的靈敏度和特異度分別為79.40%和92.90%。見表2、圖1。

表1 3組淋巴細(xì)胞VCS參數(shù)的變化

注：P1表示活動(dòng)性肺結(jié)核組與潛伏性結(jié)核組比較；P2表示活動(dòng)性肺結(jié)核組與健康對照組比較。

表2 淋巴細(xì)胞VCS參數(shù)診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的靈敏度和特異度

注：-表示無數(shù)據(jù)。

圖1 淋巴細(xì)胞VCS參數(shù)ROC曲線

3 討 論

結(jié)核病位列傳染病死因第1位，缺乏有效的診斷方法是其重要原因之一。γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)可有效診斷結(jié)核感染，但不能有效區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核與潛伏性結(jié)核。人體受到結(jié)核分枝桿菌感染后會(huì)啟動(dòng)巨噬細(xì)胞和致敏的淋巴細(xì)胞參與免疫反應(yīng)，激活的T淋巴細(xì)胞釋放出γ干擾素、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素12等細(xì)胞因子抑制結(jié)核桿菌的生長[17]，淋巴細(xì)胞形態(tài)在抗結(jié)核免疫過程中發(fā)生明顯的改變。本研究通過DxH800血液分析儀的VCS技術(shù)直接對活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血中淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征進(jìn)行檢測，結(jié)果證實(shí)活動(dòng)性肺結(jié)核組中MLV、MLV-SD、MLC-SD、UMALS-SD、LALS-SD、AL2-SD顯著高于潛伏性結(jié)核組和健康對照組。這些變化提示結(jié)核感染后，激活的淋巴細(xì)胞體積增大，體積異質(zhì)性增加。細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)比例偏高(核幼稚程度更高)，部分淋巴細(xì)胞參與抗結(jié)核免疫反應(yīng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，膜形態(tài)等發(fā)生顯著改變，這與本研究結(jié)果相吻合，細(xì)胞受到結(jié)核分枝桿菌感染后，MLV及MLV-SD與潛伏性結(jié)核感染相比，明顯增大。MLC雖然沒有變化，但其MLC-SD已經(jīng)提示細(xì)胞存在異質(zhì)性，由于受感染細(xì)胞被激活，分泌各種細(xì)胞因子，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，從而導(dǎo)致細(xì)胞各角度的光散射不同程度地在活動(dòng)性肺結(jié)核組與潛伏性結(jié)核組、健康對照組間有顯著的差異，其異質(zhì)性如UMALS-SD、LALS-SD、AL2-SD明顯增加。并且通過ROC曲線分析顯示，MLC-SD、UMALS-SD、LALS-SD 的曲線下面積均達(dá)0.800以上，同時(shí)測量這5個(gè)參數(shù)，獲得曲線下面積高達(dá)0.920，靈敏度為79.40%，特異度為92.90%，可以作為潛在的參考指標(biāo)用于輔助診斷活動(dòng)性肺結(jié)核，且該指標(biāo)可用于區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核與潛伏性結(jié)核。

研究提示，在膿毒血癥、菌血癥等細(xì)菌性感染中，中性粒細(xì)胞VCS參數(shù)發(fā)生顯著變化[18-20]，結(jié)核感染主要通過激活巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞發(fā)揮抗結(jié)核免疫作用，本研究結(jié)果提示淋巴細(xì)胞參與抗結(jié)核免疫，其細(xì)胞體積及內(nèi)部結(jié)構(gòu)、所含顆粒均在結(jié)核病患者與健康人群中差異顯著，淋巴細(xì)胞VCS參數(shù)可區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核和潛伏性結(jié)核感染，對臨床診斷不同感染狀態(tài)的結(jié)核有重要意義。

本研究受到樣本量小和選擇范圍很大的限制，這些限制可能導(dǎo)致?lián)饺肫钸^高估計(jì)所研究參數(shù)的診斷能力。因此，需要更大規(guī)模的前瞻性隊(duì)列研究來進(jìn)一步驗(yàn)證VCS參數(shù)。

4 結(jié) 論

淋巴細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)通過血常規(guī)分析儀很容易獲得，檢測成本低，并且這些參數(shù)能快速、準(zhǔn)確、客觀地反映細(xì)胞的內(nèi)在生物學(xué)特征，有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。特別是在γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)陽性結(jié)果的基礎(chǔ)上，聯(lián)合淋巴細(xì)胞VCS參數(shù)分析，為臨床輔助診斷活動(dòng)性肺結(jié)核提供有意義的參考。