惠 毅，閆曙光，王 倩，李京濤，魏海梁，單宇鵬

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，咸陽 712000；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院腫瘤科，陜西 西安710038)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種以結(jié)腸粘膜損傷為主要病理表現(xiàn)的腸道免疫炎癥性疾病，其中結(jié)腸粘膜持續(xù)性損傷是導(dǎo)致該病反復(fù)發(fā)作，遷延難愈的主要原因，而持續(xù)性炎癥又是誘發(fā)結(jié)腸癌的重要高危因素，流行病學(xué)顯示，我國結(jié)腸炎和結(jié)腸炎相關(guān)腸癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢[1-2]，因此，促進(jìn)受損結(jié)腸粘膜的修復(fù)是治療UC并防止其癌變的關(guān)鍵。Notch信號通路是參與胃腸道粘膜修復(fù)的經(jīng)典細(xì)胞間信號通路，Notch通過其下游的Hes-1、Math-1蛋白調(diào)節(jié)著結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖和分化，在粘膜屏障的維護(hù)方面發(fā)揮著重要的作用[3]。有研究表明干姜的有效成分6-姜烯酚具有促進(jìn)胃腸道受損粘膜修復(fù)的作用[4-5]，那么其修復(fù)腸粘膜的作用是否與Notch相關(guān)，尚無相關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬以6-姜烯酚為研究對象，探究其對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Notch信號通路中關(guān)鍵蛋白Notch-1、Hes-1、Math-1及其mRNA相對表達(dá)量的變化，闡明6-姜烯酚基于Notch信號通路修復(fù)受損腸粘膜治療UC的藥效作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

柳氮磺吡啶腸溶片(上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司，批號：180601)；6-姜烯酚(純度98%，寶雞市辰光生物科技有限公司，批號：17073001)；DSS葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium salt, DSS，美國MP Biomedicals 批號：160110)；RNA提取試劑盒、cDNA合成SuperMix試劑盒、qPCRSuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；Notch-1、Hes-1、Math-1抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司)；引物合成(南京金斯瑞生物科技有限公司)；SuperMiro SM-100超微量分光光度計(jì)(英國biochrom有限公司)；IANLONG Real Time PCR System(西安天隆科技有限公司)；4℃離心機(jī)(湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司)。

1.2 動物分組及造模

清潔級雄性昆明小鼠40只，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，體重(20±5)g，許可證號：SCXK(陜)2012-003。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周(室溫20℃～25℃，常規(guī)食水)。小鼠隨機(jī)分為2組：即空白組(Normal)10只，造模組30只，小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型參考文獻(xiàn)方法[6]：將分子量為36 000～50 000 DSS配置成2%的混懸液，造模組小鼠自由飲用，約10 d后小鼠逐漸出現(xiàn)腹瀉，粘液膿血便，飲食量減少等癥狀，繼續(xù)飲用至15 d，模型復(fù)制成功。隨后再次隨機(jī)法將30只造模小鼠分為模型組(Model)，陽性對照組(柳氮磺吡啶，Sulfasalazine)，6-姜烯酚組(6-Shogaol)。

1.3 給藥方式

模型復(fù)制成功后，開始灌胃給藥，6-姜烯酚組劑量為每次100 mg/(kg·d)；柳氮磺吡啶組劑量為每次100 mg/(kg·d)；模型組和正常組均給予等量生理鹽水灌胃每日1次，給藥20 d，隨后動物處死，取材，檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.4 病理學(xué)組織觀察

取病變部位結(jié)腸組織，10%甲醛固定24 h，梯度酒精脫水，浸蠟，組織切片，脫蠟，HE染色，光鏡下觀測組織形態(tài)學(xué)改變。

1.5 免疫熒光雙標(biāo)法檢測結(jié)腸粘膜Hes-1、Math-1蛋白的共表達(dá)

冰凍切片血清 1∶20 室溫封閉20～30 min 后，分別加入抗Hes-1抗體(1∶50)，抗Math-1抗體(1∶50)4℃過夜；熒光二抗(1∶100，F(xiàn)ITC標(biāo)記，呈綠色；1∶100，CY3 標(biāo)記，呈紅色)，37℃孵育1 h；90%甘油(PBS)封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 RT-PCR方法檢測結(jié)腸粘膜Notch-1、Hes-1、Math-1 mRNA

刮取結(jié)腸粘膜組織，按照RNA試劑盒說明書步驟提取結(jié)腸上皮組織中總RNA，超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA純度；根據(jù)RNA濃度以O(shè)ligo(dT)為引物將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并檢測cDNA濃度，按照RT-PCR試劑盒說明書條件(表1)檢測Notch-1、Hes-1、Math-1 mRNA的表達(dá)量，相對定量法計(jì)算各指標(biāo)mRNA的ΔCt值。

Tab. 1 Primer sequences used for real time-polymerase chain reaction

1.7 Western blot法檢測結(jié)腸上皮組織Notch-1、Hes-1、Math-1蛋白表達(dá)

刮取結(jié)腸上皮組織，制備組織勻漿，裂解結(jié)腸組織標(biāo)本，提取總蛋白，BAC定量，SDS-PAGE 電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，5%干粉牛奶封膜 4℃過夜，抗Notch-1抗體(1∶50)、抗Hes-1抗體(1∶50)、抗Math-1抗體(1∶50)4℃過夜，二抗(1∶100)常溫1 h，化學(xué)發(fā)光法檢測目的條帶，壓X光片曝光，ImageJ軟件分析相應(yīng)蛋白條帶的灰度值，計(jì)算蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠結(jié)腸組織的病理改變

正常組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，腺體排列整齊，粘膜上皮組織完整，黏液層光滑；模型組小鼠腸組織結(jié)構(gòu)異常，粘膜表面出現(xiàn)缺損，黏液層部分丟失，大量炎細(xì)胞聚集，浸潤，腺體破壞甚至丟失；柳氮磺吡啶組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)部分紊亂，粘膜缺損有所改善，部分腺體遭到破壞，炎細(xì)胞明顯減少；6-姜烯酚組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，粘膜缺損明顯減輕，受損部位可見少量炎癥細(xì)胞(圖1，見彩圖頁Ⅰ)。

2.2 6-姜烯酚對小鼠結(jié)腸粘膜Hes-1、Math-1蛋白共表達(dá)的影響

免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果(圖2)顯示，正常組小鼠結(jié)腸粘膜中Hes-1(紅色)、Math-1(綠色)蛋白均呈現(xiàn)低表達(dá)；模型組小鼠結(jié)腸粘膜固有層腸腺中Hes-1蛋白表達(dá)明顯增多，可深達(dá)隱窩，而Math-1蛋白的表達(dá)量顯著降低；與模型組比較，柳氮磺吡啶組小鼠結(jié)腸粘膜固有層腺體中Hes-1蛋白表達(dá)降低、Math-1蛋白表達(dá)升高；與柳氮磺吡啶組比較，6-姜烯酚組小鼠結(jié)腸粘膜固有層腺體中Hes-1蛋白表達(dá)顯著降低，Math-1蛋白表達(dá)則明顯升高(圖2見彩圖頁Ⅱ)。

2.3 6-姜烯酚對小鼠結(jié)腸粘膜Notch-1、Hes-1、Math-1 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果(表2)顯示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸上皮組織Notch-1、Hes-1mRNA相對表達(dá)量明顯增高(P<0.01)、Math-1 mRNA相對表達(dá)量降低(P<0.01)；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和6-姜烯酚組小鼠結(jié)腸上皮組織Notch-1、Hes-1mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，Math-1 mRNA相對表達(dá)量顯著增高(P<0.01)；與柳氮磺吡啶組比較，6-姜烯酚組小鼠結(jié)腸上皮組織Notch-1、Hes-1mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；Math-1 mRNA相對表達(dá)量顯著增高(P<0.01)。

GroupNotch-1Hes-1Math-1Normal0.86±0.011.25±0.021.29±0.03Model1.72±0.03??1.77±0.03??1.21±0.04??Sulfasalazine1.52±0.04##1.55±0.02##1.39±0.03##6-Shogaol1.14±0.04##▲▲1.23±0.3##▲▲1.58±0.05##▲▲

**P<0.01vsnormal group；##P<0.01vsmodel group；

▲▲P<0.01vssulfasalazine group

2.4 6-姜烯酚對小鼠的結(jié)腸粘膜Notch-1、Hes-1、Math-1蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果(表3，圖3)顯示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸上皮組織Notch-1、Hes-1蛋白相對表達(dá)量明顯增高(P<0.01)、Math-1蛋白相對表達(dá)量降低(P<0.01)；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和6-姜烯酚組小鼠結(jié)腸上皮組織Notch-1、Hes-1蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，Math-1 蛋白相對表達(dá)量顯著增高(P<0.01)；與柳氮磺吡啶組比較，6-姜烯酚組小鼠結(jié)腸上皮組織Notch-1、Hes-1mRNA蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；Math-1 蛋白相對表達(dá)量顯著增高(P<0.01)。

GroupNotch-1Hes-1Math-1Normal0.77±0.081.27±0.071.28±0.03Model1.26±0.07??1.49±0.05??1.21±0.03??Sulfasalazine1.09±0.04##1.42±0.03##1.36±0.05##6-Shogaol0.78±0.06##▲▲1.29±0.06##▲▲1.47±0.04##▲▲

**P<0.01vsnormal group；##P<0.01vsmodel group；

▲▲P<0.01vssulfasalazine group

Fig. 3 Changes of Notch-1, Hes-1 and Math-1 proteins in mice colonic epithelium

A：Normal；B：Model；C：Sulfasalazine；D：6-Shogaol

3 討論

Notch信號通路是調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞增殖和分化的主要通路，是維護(hù)腸粘膜屏障、保持其抗菌活性的關(guān)鍵[7]。Notch信號通路由Notch受體、Notch配體和DNA結(jié)合蛋白三部分組成。在哺乳動物體內(nèi)，有四種Notch受體(Notch1-4)，其中Notch-1主要分布在腸道中，Notch-1受體一旦被激活，腸道干細(xì)胞開始大量增殖，而后Notch-1受體和配體結(jié)合后通過其下游靶基因Hes-1(促進(jìn)腸道干細(xì)胞向吸收細(xì)胞系轉(zhuǎn)化)和Hath-1(促進(jìn)腸道干細(xì)胞向分泌細(xì)胞系轉(zhuǎn)化，在小鼠為Math-1)在促進(jìn)腸道干細(xì)胞增殖和分化方面發(fā)揮著重要的作用，Notch-1活化后會促進(jìn)Hes-1表達(dá)，從而抑制Hath-1的表達(dá)，因此適度的活化能促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞的不斷更新，又保持著吸收細(xì)胞和分泌細(xì)胞之間正常的分化平衡，但過度活化則導(dǎo)致了吸收細(xì)胞增多，分泌細(xì)胞減少特別是杯狀細(xì)胞的數(shù)量明顯減少[3]。在UC患者的結(jié)腸粘膜中，表達(dá)Hath-1的細(xì)胞消失了，而表達(dá)Hes-1的陽性細(xì)胞則延伸到絨毛的頂端，杯狀細(xì)胞明顯減少，這表明Notch信號通路的活化增強(qiáng)，過度激活的Notch信號通路促進(jìn)大量的結(jié)腸上皮細(xì)胞向吸收細(xì)胞系分化，影響了上皮細(xì)胞的分化平衡，導(dǎo)致大量杯狀細(xì)胞消失(正常結(jié)腸粘膜固有層腸腺是由大量杯狀細(xì)胞構(gòu)成)，杯狀細(xì)胞的大量缺失不但造成粘膜的缺損，腸道通透性升高，導(dǎo)致腸道細(xì)菌易位，免疫功能改變及腸源性感染等發(fā)生[8]，同時其分泌的粘蛋白、三葉因子多肽、抵抗素樣因子等具有防御作用的物質(zhì)減少，進(jìn)一步引起粘膜屏障功能的缺失[9]。因此這一通路被認(rèn)為是促進(jìn)結(jié)腸粘膜修復(fù)的重要靶點(diǎn)，這為我們研究6-姜烯酚促進(jìn)受損腸粘膜的修復(fù)治療UC提供了思路。

干姜具有溫中散寒、回陽救逆，溫肺化飲的功效，是治療胃腸道疾病的臨床常用中藥，其中含有姜烯酚類、姜二醇、姜二酮、揮發(fā)油、胡蘿卜苷、棕櫚酸等多種活性成份。實(shí)驗(yàn)表明6-姜烯酚類能夠顯著抑制潰瘍性結(jié)腸炎動物模型體內(nèi)腫瘤壞死因子，白介素-1等促炎癥因子的釋放，促進(jìn)結(jié)腸受損部位粘膜的修復(fù)而被廣泛用于潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)研究[10-12]，這些研究主要從抗炎的角度揭示了6-姜烯酚的作用機(jī)制。抗炎和促受損粘膜修復(fù)是潰瘍性結(jié)腸炎治療中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過檢測6-姜烯酚對小鼠結(jié)腸炎模型結(jié)腸粘膜Notch信號通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子表達(dá)部位和表達(dá)水平的變化，明確了6-姜烯酚抑制Notch信號通路過度活化的作用，具體機(jī)制為抑制Notch信號通路中Notch-1、Hes-1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制增殖的結(jié)腸上皮干細(xì)胞向吸收細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)Math-1蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸干細(xì)胞向分泌細(xì)胞系特別是杯裝細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，最終維持吸收細(xì)胞系與分泌細(xì)胞系之間的平衡，促進(jìn)受損粘膜組織的修復(fù)，治療潰瘍性結(jié)腸炎。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為6-姜烯酚治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床應(yīng)用和藥物開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。越來越多的證明表明Notch不但能促進(jìn)受損粘膜組織的修復(fù)，還可調(diào)節(jié)多種固有免疫細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞的活性和功能[13]，而巨噬細(xì)胞超活化所導(dǎo)致的非可控性炎癥是UC反復(fù)發(fā)作以及結(jié)腸炎-癌惡性轉(zhuǎn)化的重要原因[14]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為通過干預(yù)Notch信號通路進(jìn)而抑制慢性潰瘍性結(jié)腸炎的惡性進(jìn)展并最終降低腫瘤的發(fā)生率提供了新的研究思路。