朱曉婷，陳志強

(1.河北中醫(yī)學院 石家莊 050200；2.河北省中醫(yī)院，石家莊 050200；3.唐山市人民醫(yī)院，河北 唐山 063000)

腎臟纖維化是慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)的病理改變，是腎小球、腎間質(zhì)在損傷情況下的形態(tài)學表現(xiàn)。隨著纖維化的進展，腎功能逐漸喪失至衰竭，而發(fā)展成為終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)[1]。研究證實[2]，CRF患者存在促氧化狀態(tài)(pro-oxidant state)，氧化應(yīng)激在病情進展，加重纖維化進程中起關(guān)鍵作用。Hoffman[3]等發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腎病患者存在線粒體功能障礙，隨之產(chǎn)生氧化應(yīng)激，致組織損傷，進展為CRF。氧化應(yīng)激還可引起TGF-β1的表達增加[4]，而TGF-β1蛋白是一種可以通過多種途徑促進Ι型和Ⅲ型膠原分泌而增加細胞外基質(zhì)(ECM)合成，引起腎小球硬化的促纖維化因子。Keap1-Nrf2-ARE信號通路[5]是重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，具有潛在的抗氧化治療的臨床研究價值。本實驗將探討Nrf2/Keap1信號通路、TGF-β1蛋白與CRF氧化應(yīng)激、纖維化進程的關(guān)系及可能的分子機制。

目前關(guān)于CRF患者的臨床治療方法，診療指南指出[6]：聯(lián)合用藥及飲食控制。在CRF早、中期主要是保守治療及針對并發(fā)癥的治療等，當發(fā)展到GFR﹤15 ml/(min·1.73 m2)時，應(yīng)實施透析及腎移植等腎臟替代治療。但臨床療效并不理想。YHT是根據(jù)臨床經(jīng)驗擬定的經(jīng)驗方，能夠有效改善CRF患者癥狀并延緩其進入透析及腎移植等晚期階段的進程[7]。本研究采用5/6腎切除大鼠創(chuàng)建的CRF模型，是考慮臨床患者腎衰發(fā)生發(fā)展的整個病理進程與此模型造成的腎功能損傷、病理形態(tài)學改變具有高度相似性[8]，對此模型的干預(yù)具有臨床針對性和實際意義。YHT對此腎衰大鼠模型的殘存腎臟功能損傷的改善作用及對腎臟纖維化的治療作用的機制探討，為傳統(tǒng)醫(yī)學治療CRF及其并發(fā)癥提供了進一步可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

益氣化濕通絡(luò)方：黃芪25 g、當歸12 g、川芎10 g、紅花10 g、地龍10 g、水蛭3 g、仙茅10 g、仙靈脾12 g、藿香6 g、佩蘭6 g、陳皮12 g、白豆蔻6 g、土茯苓30 g、積雪草30 g組成。中藥顆粒劑(廣東一方制藥有限公司)；鹽酸貝那普利片(商品名:洛丁新，購于北京諾華制藥有限公司)；HE試劑盒和SOD、MDA試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；BCA法蛋白定量試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；Keap1、Nrf2、NOX4、TGF-β1、collagenl抗體，均購自美國Abcam公司；其余試劑均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；酶標檢測儀(Rayto)、冷凍離心機(heal force)、掃描儀(EPSON)、雙垂直電泳儀(北京六一儀器廠)、轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 實驗動物及分組

50只雄性SD成年大鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體重(240±20)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機分成兩組：造模組40只、假手術(shù)組10只。在動物正常休息的白天進行造模，采用Platt法建立5/6腎切除慢性腎衰大鼠模型。用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，使大鼠俯臥從距左脊骨1.5 cm處做外上方切口約1 cm，經(jīng)后腹膜暴露腎臟，分離腎周脂肪，剝離腎包膜，迅速切除上下極及左腎外側(cè)緣約2/3腎組織，用明膠海綿壓迫止血、復(fù)位、縫合，1周后切除整個右腎，兩次手術(shù)共切除5/6腎組織。假手術(shù)組只進行剝離兩側(cè)腎包膜操作，不切除腎臟。造模后每周大鼠目內(nèi)眥取血，分離血清檢測Scr、BUN含量，其均值顯著高于假手術(shù)組均值(P<0.01)認為造模成功。(文獻顯示一般在造模后2周造模成功)[8]。本實驗在造模后第二周抽檢模型組和假手術(shù)組血清Scr、BUN時，模型組均值明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)，造模成功。造模過程中死亡18只，造模組剩余24只，假手術(shù)組剩余8只，將24只模型大鼠隨機抽樣分為3組(n=8)，Model組、YHT組、BH組。YHT組：將免煎顆粒加入80℃去離子水制成水溶液灌胃，(0.276 g/100 g/d，按1 ml/100 g的劑量,以中藥藥理研究方法學的大鼠與人藥物劑量折算方法折算給藥劑量)；BH組去離子水溶解貝那普利片(0.09 mg/100 g，1 ml/100 g)灌胃；Sham和Model生理鹽水灌胃(1 ml/100 g)。分組后次日即開始灌胃治療，每天1次，連續(xù)12周為療程結(jié)束。治療結(jié)束后代謝籠留取24 h尿液，所有大鼠均麻醉(水合氯醛)腹主動脈取血分離血清，摘取左側(cè)腎臟一部分保存于-80℃冰箱中，一部分保存于4%多聚甲醛中固定，留待檢測。

1.3 尿液中24 h尿蛋白測定

第12周治療結(jié)束時收集24 h尿液，計量尿量，通過BCA法蛋白定量試劑盒測定24 h尿蛋白含量。

1.4 血清中腎功能指標測定

第12周治療結(jié)束，麻醉大鼠后，腹主動脈取血(不抗凝)，離心分離出血清，通過生化分析儀測定血清中BUN、SCr含量。

1.5 組織病理學觀察

第12周治療結(jié)束留取血清后，剖殺大鼠取出左腎并用4%多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片，進行HE、Masson染色，光鏡下觀察組織病理學變化。

1.6 腎組織勻漿抗氧化酶(SOD)活性和MDA含量測定

第12周治療結(jié)束后取左腎臟組織、加入適量冷裂解液行研磨勻漿，離心(12 000 r/min 15 min)取上清液，按試劑盒說明，通過比色法測定腎臟組織SOD活性和MDA含量。

1.7 Western blot檢測Nrf2、Keap1、Nox4、TGF-β1、Collagen1的蛋白表達

取左腎組織，按100 mg/ml加入蛋白裂解液，經(jīng)組織研磨儀破碎組織后，離心(15 min,4℃)取上清液，用BCA測定蛋白濃度。以50 μg蛋白加入2.5 μl的sample buffer,振蕩均勻,置于水浴槽，100℃水浴5 min變性，留待電泳。電泳(電泳儀設(shè)置電泳條件80 V，40 min；160 V，90 min)完成后，進行濕轉(zhuǎn)(濕轉(zhuǎn)儀設(shè)置濕轉(zhuǎn)條件300 mA,90 min)。按Maker裁剪相應(yīng)目的蛋白的條帶，放置于孵育盒中，5%脫脂牛奶封閉蛋白條帶90 min，用TBST清洗三次，每次15 min,加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜。次日，TBST清洗三次，每次15 min，加入相應(yīng)二抗(1∶5 000)孵育90 min。TBST清洗三次，每次15 min，應(yīng)用Fusion FX5 Spectra多功能成像系統(tǒng)(法國Viber公司)發(fā)光顯色并拍照。采用Quantity One分析軟件對每個蛋白的含量進行灰度測定分析。

1.8 熒光檢測Nrf2在細胞核內(nèi)的表達

石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度酒精復(fù)水后，抗原修復(fù)、然后漂洗、濕盒內(nèi)封閉，一抗染色：過夜。加熒光標記的二抗，防熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 益氣化濕通絡(luò)方對腎衰模型大鼠腎功能的影響

與Sham組相比，Model組大鼠腎功能明顯受損。與Model組相比，YHT組腎功能得到改善，能夠明顯降低大鼠的BUN、SCr、24 h尿蛋白水平，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。YHT組與BH組比較，BUN、SCr、24h尿蛋白未表現(xiàn)出顯著差異(表1)。

GroupScr(μmol/L)BUN(mg/dl)24hurineprotein(mg/24h)Sham38.67±5.525.98±1.150.010±0.003Model70.00±11.52##10.47±2.11##0.030±0.009##BH53.20±54.29?8.94±0.90??0.020±0.010??YHT48.00±4.85??6.66±0.96??0.020±0.012??

YHT: Yiqi huashi tongluo Formula; BH: Benazepril hydrochloride

*P<0.05，**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vssham group

2.2 益氣化濕通絡(luò)方對5/6腎切除慢性腎衰大鼠殘存腎臟組織病理學的影響

HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)及病理無明顯異常，少量炎癥細胞浸潤，腎小球結(jié)構(gòu)正常。Model組顯示局部腎小球不同程度階段性萎縮、硬化，系膜細胞及系膜基質(zhì)增生明顯，膜細胞及系膜基質(zhì)增生明顯，并有大量炎癥細胞浸潤。與Model相比YHT組、BH組有明顯改善，病灶區(qū)域減少，系膜細胞及系膜基質(zhì)增生程度和腎小球硬化程度減輕(圖1，見彩圖頁Ⅰ)。

Masson染色結(jié)果顯示，Sham組沒有明顯纖維化的表現(xiàn)，膠原染色呈淡藍色。Model組大鼠腎臟膠原沉積于腎小球、腎間質(zhì)，彌漫性分布。與Model組相比，YHT組、BH組腎小球、腎間質(zhì)有絲狀膠原沉積(圖2，見彩圖頁Ⅰ)。

2.3 益氣化濕通絡(luò)方對腎臟組織SOD活性和MDA含量的影響

與Sham組相比，Model大鼠腎組織中SOD活性降低和MDA含量升高，與Model組相比，YHT組大鼠的腎臟組織SOD活性增加和MDA含量下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。YHT組與BH組比較，未表現(xiàn)出顯著差異(表2)。

GroupSOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)Sham216.3±16.41.76±0.22Model144.3±7.0##3.80±0.44##BH180.2±6.4??2.20±0.18??YHT184.7±13.4??2.16±0.64??

**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vssham group

2.4 益氣化濕通絡(luò)方對腎組織中Nrf2、Keap1、Nox4的蛋白表達水平的影響

與Sham組相比，Model組大鼠腎組織中，Nrf2蛋白表達水平降低，Keap1、Nox4蛋白表達水平升高；與Model組相比經(jīng)過YHT處理后能使Nrf2蛋白表達水平升高，Keap1、Nox4蛋白表達水平減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖3，表3)。YHT組與BH組比較，未表現(xiàn)出顯著差異。

Fig. 3 Effects of Yiqi Huashi Tongluo Formula on the protein expression levels of Nrf2 Keap1 and Nox4 in renal tissue of rats

GroupNrf2/HistoneH3Keap1/ActinNOX4/ActinSham0.84±0.050.22±0.030.07±0.03Model0.13±0.05##0.88±0.02##0.67±0.06##BH0.56±0.03??0.53±0.06??0.36±0.02??YHT0.58±0.05??0.55±0.08??0.33±0.03??

**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vssham group

2.5 益氣化濕通絡(luò)方對腎組織中TGF-β1、Collagen1的蛋白表達水平的影響

與Sham組相比，Model組大鼠腎組織中，TGF-β1、Collagen1蛋白表達水平升高；與Model組相比，經(jīng)過YHT處理后能使TGF-β1、Collagen1的蛋白表達水平下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖4，表4)。YHT組與BH組比較，未表現(xiàn)出顯著差異。

Fig. 4 Effects of Yiqi Huashi Tongluo Formula on the protein expression levels of TGF-β1 and collagenl inrenal tissue of rats

**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vssham group

2.6 熒光檢測Nrf2在細胞內(nèi)的表達

免疫熒光結(jié)果(圖5)顯示，與Sham組相比較Model組腎組織細胞核內(nèi)Nrf2蛋白的表達明顯減少，YHT組、BH組較Model組Nrf2的表達增多明顯(圖中放大的小圖指示為Nrf2入核的熒光表現(xiàn)，圖5見彩圖頁Ⅱ)。

3 討論

腎臟纖維化是ECM過度積累的結(jié)果，是CRF發(fā)展的主要病理變化之一。伴隨ECM大量沉積、腎固有細胞消失，腎小球濾過功能下降、代謝紊亂等病情出現(xiàn)并不斷加重，最終整個腎臟出現(xiàn)不可逆損傷，直至衰竭，發(fā)展成為CRF[1]。本研究建立5/6腎切除慢性腎衰大鼠模型，殘腎出現(xiàn)腎小球、腎小管，間質(zhì)的增生、纖維化、萎縮、硬化等病理改變。殘腎高灌注、高濾過和高壓力,超負荷運作,致使殘存腎單位進行性喪失，出現(xiàn)腎臟不可逆損傷直至衰竭，與臨床患者腎衰發(fā)生發(fā)展的整個進程相符合[8]。

益氣化濕通絡(luò)方以中醫(yī)辨證結(jié)合CRF的病理特征論治，將氧化應(yīng)激的產(chǎn)物與中醫(yī)濕濁、邪毒、瘀積相聯(lián)系。運用泄?jié)峄局兴?藿香、佩蘭、陳皮、白豆蔻、土茯苓、積雪草)治療。CRF患者腎臟纖維化引起功能代謝下降的復(fù)雜病癥，以瀉濁化瘀通絡(luò)中藥(當歸、川芎、紅花、地龍、水蛭)治療。CRF患者久病體虛，以益氣健脾補腎中藥(黃芪、仙茅、仙靈脾)治療。YHT有效地改善CRF患者因病理變化、功能代謝下降等引起的臨床癥狀。

氧化應(yīng)激是CRF病情進展的一項重要誘因，貫穿疾病始終。研究證明[9]氧化應(yīng)激可直接使腎小球基底膜過氧化，通透性增加，誘導足細胞凋亡，增加細胞外基質(zhì)累積，加快腎臟纖維化。CRF病程中存在活性氧(ROS)的損傷，ROS使脂質(zhì)分解而形成MDA，MDA隨著過氧化反應(yīng)增多而升高，引起氧自由基增多，氧自由基損傷腎臟。ROS還可影響內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞(EMT)，從而使得成纖維細胞表達增加，進而損傷腎小球系膜細胞，加速腎臟纖維化。SOD可阻斷ROS造成的損害[10]。但CRF中SOD等抗氧化作用顯著降低。本研究檢測腎衰模型大鼠殘腎，發(fā)現(xiàn)MDA產(chǎn)生增多，SOD活性下降，提示此模型存在氧化應(yīng)激反應(yīng)增強而抗氧化反應(yīng)減弱。

抗氧化應(yīng)激是影響腎臟纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)反應(yīng)[11-12]。激活抗氧化應(yīng)激的重要通路，Nrf2-Keap1通路，可影響ROS的表達,從而減輕腎損傷，減緩腎纖維化的進程。Nrf2是重要的氧化還原轉(zhuǎn)錄因子。其活性主要受Keap1的調(diào)控[13]。正常條件下，Nrf2通過keap1介導的cullin-3(Cul3)，依賴泛素化持續(xù)降解并向蛋白酶體轉(zhuǎn)移而保持穩(wěn)定。然而，在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2脫離Keap1的控制，進入細胞核，增加抗氧化反應(yīng)元件(ARE)靶基因的表達，這些靶基因編碼調(diào)控下游抗氧化蛋白的表達[14]。Nox4[15]是下游抗氧化蛋白中的一種，當機體遭受損傷，Nrf2上調(diào)Nox4，增加機體抗氧化損傷的能力，從而減輕損傷，減緩CRF進程。另外，Nrf2、Nox4均可通過阻抑TGF-β1的表達而減輕纖維化[16-17]。TGF-β1被公認是導致CRF、腎纖維化的一個強有力的中介。TGF-β1與EMT在腎小管細胞的表達及腎組織中ECM積累密切相關(guān)，TGF-β1誘導EMT及直接刺激ECM蛋白質(zhì)如膠原、纖粘連蛋白的表達,加劇了腎臟損傷及纖維化的進程。激活Nrf2-Keap1信號通路不但減輕氧化應(yīng)激帶來的直接損傷，并使TGF-β1表達減少，達到阻抑腎臟損傷及纖維化進程的效果。因此激活Nrf2-Keap1通路是保護腎臟的有效方法[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)YHT或BH治療后腎衰竭模型大鼠腎臟損傷、纖維化程度均明顯減輕(圖1,2)。BUN、SCr、24 h尿蛋白水平明顯降低(表1)。SOD活性增加、MDA含量降低(表2)。這些結(jié)果表明殘余腎臟腎功能得到改善，氧化應(yīng)激現(xiàn)象得到緩解。YHT治療后Nrf2在細胞核內(nèi)表達水平升高，說明組織抗氧化能力增強，Keap1、Nox4、TGF-β1、Collagen1的蛋白表達水平明顯下降(圖3，4，5)，表明YHT有效地減輕了殘腎的氧化應(yīng)激反應(yīng)及纖維化進程，機制可能是YHT激活了抗氧化應(yīng)激通路Nrf2-Keap1及下調(diào)TGF-β1蛋白的表達。

本實驗結(jié)果還顯示YHT與BH治療效果相當。有研究指出[19,20]，ACEI類藥物可通過抑制腎衰模型大鼠的NAD(P)H氧化酶，繼而上調(diào)Nrf2，而改善腎臟的氧化應(yīng)激和腎功能，減緩CRF進展。本研究從分子機制層次證實YHT有類似于ACEI類藥物的作用機制，可通過影響Nrf2/Keap1信號通路減輕殘腎組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強抗氧化能力，減輕腎纖維化，為尋找YHT的臨床療效作用的分子靶點提供依據(jù)。

綜上所述，本研究證實5/6腎切除慢性腎衰大鼠模型存在氧化應(yīng)激及腎纖維化，腎功能障礙。YHT可能是通過影響Nrf2/Keap1信號通路,下調(diào)TGF-β1蛋白表達,從而改善CRF大鼠因氧化應(yīng)激及腎臟纖維化引起的結(jié)構(gòu)功能損傷，改善腎功能保護腎臟，為CRF及并發(fā)癥的中醫(yī)藥防治提供新的思路與試驗依據(jù)。