許逸嵐，趙鏝娜，朱詩(shī)涵，韓瑜穎，章佳瑜，沈鑠恒，俞樟森，張 衡

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，浙江 紹興 312000)

近年來，納米材料由于其獨(dú)特的表面效應(yīng)、小粒徑、高反應(yīng)活性、強(qiáng)吸附能力等倍受關(guān)注[1]，其抗氧化性是新型抗氧化藥物研發(fā)的一大關(guān)注點(diǎn)。其中，二氧化鈰(Ceria，CeO2)納米材料因優(yōu)異的氧化還原能力在生物抗氧化領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛。它獨(dú)特的螢石立方結(jié)構(gòu)，使鈰離子可以在+3和+4兩種價(jià)態(tài)間可逆轉(zhuǎn)換, 從而實(shí)現(xiàn)氧的儲(chǔ)存和釋放[2-4]。將CeO2的尺寸從體相減小至納米尺度后，能使其催化活性增強(qiáng)，成為具有良好水溶性和生物相容性的高效抗氧化材料[5]。

然而納米CeO2能否應(yīng)用于治療疾病卻一直存在較大爭(zhēng)議。Azari等[6]人發(fā)現(xiàn)，納米CeO2能夠減輕丙烯酰胺誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷。Wang等[7]人研究證明，CeO2納米顆?？梢员Ｗo(hù)INS-1細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，表明其在糖尿病治療中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。Wahba等[8]人發(fā)現(xiàn)，GAL@Ce-HAp可以下調(diào)阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)大鼠腦中的氧化應(yīng)激標(biāo)記物，抑制其海馬中的神經(jīng)元退化。然而，俞淼等[9]人研究發(fā)現(xiàn)，CeO2-SFPM能夠?qū)е滦∈髥魏司奘杉?xì)胞發(fā)生凋亡。Monika等[10]人發(fā)現(xiàn)，納米CeO2能夠誘發(fā)IMR32細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生一定的毒性。歐陽璐等[11]人研究發(fā)現(xiàn)，納米CeO2對(duì)大鼠具有一定的肺毒性，能夠?qū)е缕浞伟l(fā)生纖維化。之前有報(bào)道表明，納米二氧化硅(SiO2)能夠通過抑制海馬齒狀回長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，導(dǎo)致大鼠的學(xué)習(xí)記憶損傷[12]。因此，對(duì)納米材料的毒性研究至關(guān)重要。本研究選用模擬神經(jīng)細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞與PC12細(xì)胞為研究樣本，探討納米CeO2對(duì)兩細(xì)胞系的細(xì)胞活力的影響，為今后進(jìn)一步修飾納米CeO2，從而運(yùn)用于神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病的治療提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)，熒光倒置顯微鏡(MODEL IX70-S1F2，日本OLYMPUS公司)，磁力攪拌器(河南愛博特科技發(fā)展有限公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO RAD公司)，透射電子顯微鏡(日本電子公司)，X-射線衍射儀(荷蘭帕納科公司)

1.2 試劑

胎牛血清(Gibco公司)，DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone公司)、胰蛋白酶(biosharp公司)，青霉素及鏈霉素(上海吉諾公司)，DMSO(碧云天公司)，噻唑藍(lán)溴化四唑(MTT試劑，阿拉丁公司)，活性氧檢測(cè)試劑盒(碧云天公司)，硝酸鈰六水合物(阿拉丁公司)，聚乙二醇(阿拉丁公司)，乙二醇(阿拉丁公司)，氫氧化鈉(阿拉丁公司)

1.3 納米CeO2的合成及表征

稱取0.326 g(0.75 mmol)Ce(NO3)3·6H2O、1.0 g PEG置于燒杯中，加入15 ml乙二醇，磁力攪拌器攪拌并加熱至60℃溶解，直至反應(yīng)液完全澄清。然后加入0.06 g(1.5 mmol)NaOH，繼續(xù)攪拌30 min。再加入25 ml乙二醇繼續(xù)攪拌10 min，將全部溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜置于180℃的烘箱中反應(yīng)24 h。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)12 000 r/min離心20 min，并用去離子水洗滌，離心、洗滌3次后，將產(chǎn)物分散于PBS溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩＠猛干潆娮语@微鏡(TEM)和X-射線衍射儀(XRD)對(duì)得到的納米CeO2進(jìn)行表征。利用納米CeO2與3%H2O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)，溶液顏色是否發(fā)生變化，進(jìn)行其抗氧化性能初步評(píng)估。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y和大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12(來源于浙江大學(xué)孫秉貴教授實(shí)驗(yàn)室)分別接種于含有10% 胎牛血清和 1% 雙抗(青霉素 105U/L，鏈霉素 105U/L)的 DMEM培養(yǎng)基中，放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到 80%～90% 后用胰蛋白酶消化傳代至新的培養(yǎng)瓶中。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SY5Y和PC12細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌，經(jīng)胰酶消化后，用含有 10% 胎牛血清和 1% 雙抗的DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，并將細(xì)胞的密度調(diào)整為1×105cells/ml，分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(每孔100 μl)，將細(xì)胞置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞過夜培養(yǎng)至合適密度，分別用不同濃度的納米CeO2(終濃度為1、2.5、5、10、25、50、75、100、150 μg/ml)處理細(xì)胞，每個(gè)濃度分別設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，另設(shè)對(duì)照組(加入等量培養(yǎng)液處理細(xì)胞)。加藥后24 h時(shí)，向各個(gè)培養(yǎng)孔中加入MTT溶液(5 mg/ml)10 μl /孔，37℃孵育4 h，棄去上清后，每孔加入150 μl DMSO，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度值(OD)。

1.6 DCFH-DA探針法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y和PC12細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌，經(jīng)胰酶消化后，用含有 10% 胎牛血清和 1% 雙抗的DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，并將細(xì)胞的密度調(diào)整為2×104cells/ml，分別接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(每孔500 μl)，將細(xì)胞置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞過夜培養(yǎng)至合適密度，分別用不同濃度的納米CeO2(終濃度為25、50、75、100 μg/ml)作用于細(xì)胞，每個(gè)濃度分別設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，另設(shè)對(duì)照組(加入等量培養(yǎng)液處理細(xì)胞)、CeO2(終濃度為100 μg/ml)+活性氧清除劑NAC(5 mmol/L)共同處理組，加藥24 h后，吸去孔板中培養(yǎng)液，并在每孔中加入濃度為10 μmol/L的 DCFH-DA探針150 μl，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min后，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，最后置于熒光顯微鏡下觀察，并選定26～33個(gè)視野觀察區(qū)域統(tǒng)計(jì)分析不同組別單個(gè)視野觀察區(qū)域細(xì)胞的平均數(shù)目用于表征細(xì)胞活力，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)處理用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析，各組采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，并用Newman-Keuls檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 納米CeO2的表征

透射電子顯微鏡檢測(cè)納米CeO2的形態(tài)及粒徑分布，其顆粒近似圓球形，有凝集現(xiàn)象，粒徑大小均勻(圖1)。然后分別加入5 μl、10 μl和20 μl的濃度為3%H2O2與納米CeO2反應(yīng)，可見顏色明顯發(fā)生改變，表明兩者之間發(fā)生了氧化還原反應(yīng)，CeO2具有一定的抗氧化能力(圖2)。利用X-射線衍射儀對(duì)納米CeO2進(jìn)行物相鑒定(圖3)，所制備納米CeO2的衍射峰主要位于立體螢石結(jié)構(gòu)的(111)、(200)、(220)、(311)晶面，無其他雜峰存在，表明樣品為純CeO2顆粒，無其他雜質(zhì)存在。

Fig. 1 TEM micrograph of CeO2nanoparticles

Fig. 2 The effect of CeO2nanoparticles on H2O2

Fig. 3 XRD patterns of CeO2nanoparticles

2.2 納米CeO2對(duì)SH-SY5Y和PC12細(xì)胞活力的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示(表1)，納米CeO2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的活力有明顯的抑制作用，在一定范圍內(nèi)，納米CeO2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的抑制作用與它的濃度成正比，在納米CeO2濃度達(dá)到25 μg/ml時(shí)，它對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用不再隨濃度的增加而增強(qiáng)。

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示(表1)，納米CeO2對(duì)PC12細(xì)胞的活力有類似于SH-SY5Y細(xì)胞的明顯抑制作用，不同濃度的納米CeO2對(duì)PC12細(xì)胞活力的抑制與對(duì)照組相比差異明顯，但各濃度組之間作用無明顯差異。

2.3 納米CeO2對(duì)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響

用不同濃度的納米CeO2(終濃度為25、50、75、100 μg/ml)作用于細(xì)胞，并設(shè)置對(duì)照組(加入等量培養(yǎng)液處理細(xì)胞)、活性氧清除劑NAC預(yù)孵育100 μg/ml CeO2處理組，處理24 h后，經(jīng)過DCFH-DA探針染色后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度(圖4)，結(jié)果表明，隨著納米CeO2濃度的增加，SH-SY5Y細(xì)胞熒光的強(qiáng)度不斷增加，而加入活性氧清除劑NAC后，熒光強(qiáng)度明顯下降，表明在CeO2處理細(xì)胞的過程中,誘導(dǎo)了ROS的產(chǎn)生。

CellControl 12.5510255075100150SH-SY5Y97.33±2.22 -83.65±4.89??77.69±5.88??#75.38±4.02??##70.43±1.99??##69.17±3.60??69.72±2.29??65.42±2.89??65.57±1.30??PC1294.82±3.6778.14±3.50??73.27±5.59??74.70±4.25??71.37±1.18??73.46±8.36??69.79±3.24??75.55±5.43??70.83±1.42??78.76±1.47??

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs2.5

Fig. 4 ROS fluorescent staining of SH-SY5Y cells(DCFH-DA staining ×100)

A: Control; B: 25 μg/ml CeO2; C: 50 μg/ml CeO2; D: 75 μg/ml CeO2; E: 100 μg/ml CeO2; F: 100 μg/ml CeO2+NAC

經(jīng)過DCFH-DA探針染色后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度(圖5)，隨著納米CeO2濃度的增加，PC12細(xì)胞熒光的強(qiáng)度不斷增加，加入活性氧清除劑NAC，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度有一定程度下降。顯微鏡下顯示，不同濃度的納米CeO2對(duì)PC12細(xì)胞的形態(tài)有影響，且濃度越大，細(xì)胞形態(tài)的改變程度越大。加入活性氧清除劑NAC后，PC12細(xì)胞形態(tài)在一定程度上恢復(fù)正常。

Fig. 5 ROS fluorescent staining of PC12 cells(DCFH-DA staining ×100)

A: Control; B: 25 μg/ml CeO2; C: 50 μg/ml CeO2; D: 75 μg/ml CeO2; E: 100 μg/ml CeO2; F: 100 μg/ml CeO2+NAC

2.4 活性氧清除劑NAC不影響納米CeO2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力抑制

經(jīng)過不同濃度納米CeO2處理后，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)SH-SY5Y細(xì)胞的數(shù)目，選定26～31個(gè)視野觀察區(qū)域統(tǒng)計(jì)分析不同組別單個(gè)視野觀察區(qū)域細(xì)胞的平均數(shù)目用于表征細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)納米CeO2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力有明顯抑制作用(表2)。CeO2超過50 μg/ml抑制作用達(dá)到平臺(tái)期。NAC與納米CeO2共同處理后，統(tǒng)計(jì)分析后，發(fā)現(xiàn)SH-SY5Y細(xì)胞數(shù)量與單獨(dú)CeO2100 μg/ml組沒有差異。

2.5 活性氧清除劑NAC減弱了納米CeO2對(duì)PC12細(xì)胞的活力抑制

經(jīng)過不同濃度納米CeO2處理后，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)PC12細(xì)胞的數(shù)目，選定30～33個(gè)視野觀察區(qū)域統(tǒng)計(jì)分析不同組別單個(gè)視野觀察區(qū)域細(xì)胞的平均數(shù)目用于表征細(xì)胞活力，納米CeO2對(duì)PC12細(xì)胞活力有明顯抑制作用(表2)。當(dāng)加入NAC與納米CeO2共孵育處理時(shí)，PC12細(xì)胞數(shù)量相對(duì)于單獨(dú)CeO2100 μg/ml組明顯增加。

3 討論

納米材料在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用一直備受關(guān)注，有關(guān)納米CeO2是否能應(yīng)用于治療疾病的問題報(bào)道不一。本研究顯示納米CeO2能夠抑制神經(jīng)細(xì)胞的活力，其機(jī)制極有可能是誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了過量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，從而損傷細(xì)胞線粒體等重要結(jié)構(gòu)，加速細(xì)胞的損傷。我們的研究表明，在沒有經(jīng)過修飾的情況下，納米CeO2在比較低的濃度時(shí)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞PC12和SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用，并且誘導(dǎo)了ROS的產(chǎn)生，表現(xiàn)出氧化損傷細(xì)胞的特性。然而，加入活性氧清除劑后，兩種神經(jīng)細(xì)胞的反應(yīng)明顯不同。與納米CeO2單獨(dú)處理組相比，納米CeO2與活性氧清除劑共孵育處理組PC12的細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目都明顯恢復(fù)，而SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目均沒有明顯差異。有研究表明，納米CeO2進(jìn)入細(xì)胞后有兩種去向，一方面是進(jìn)入溶酶體體現(xiàn)出氧化毒性[13-15]，另一方面是進(jìn)入線粒體表現(xiàn)出抗氧化的特性[16-21]，這有可能是導(dǎo)致兩類神經(jīng)細(xì)胞不同表現(xiàn)的原因。我們推測(cè)，納米CeO2處理時(shí)，PC12細(xì)胞中CeO2可能有部分進(jìn)入線粒體，部分進(jìn)入溶酶體；而SH-SY5Y細(xì)胞中，CeO2可能全部進(jìn)入溶酶體導(dǎo)致細(xì)胞毒性過大，導(dǎo)致活性氧清除劑NAC無法有效清除全部ROS。然而，其中的機(jī)制有待于將來進(jìn)一步的研究。

Tab. 2 Effects of different concentrations(μg/ml)of CeO2 nanoparticles on the number of SH-SY5Y and PC12 cells

*P<0,05，**P<0.01vscontrol;##P<0.01vs25;△△P<0.01vs50;▲▲P<0.01vs75;○○P<0.01vs100

阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease，AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，目前仍無有效藥物可治愈該疾病。其典型病理特征為細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein, Aβ)沉積導(dǎo)致的老年斑(senile plaques，SPs)[22,23]。雖然目前關(guān)于Aβ誘導(dǎo)的AD病理變化機(jī)制尚不明確，許多研究表明，Aβ 的積累會(huì)加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)[24]，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，ROS能夠直接損傷蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)等生物大分子，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和缺失[25]。陳建國(guó)等發(fā)現(xiàn)，Deoxygedunin可通過激活TrkB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路顯著抑制Aβ沉積,減少氧化應(yīng)激損傷，從而改善D-半乳糖聯(lián)合AlCl3誘導(dǎo)的認(rèn)知缺陷,為Deoxygedunin用于減輕AD樣病理功能障礙提供理論基礎(chǔ)[26]。因此，通過減少AD發(fā)病過程中ROS的產(chǎn)生有可能會(huì)減緩AD的發(fā)病進(jìn)程，從而達(dá)到治療AD的目的，但是仍需要進(jìn)一步的研究。

Hyek等人發(fā)現(xiàn)TPP修飾的納米CeO2定向進(jìn)入線粒體，，可以有效地清除線粒體中的ROS，減緩氧化應(yīng)激反應(yīng)。將TPP修飾的納米CeO2使用腦立體定位儀注射到AD大鼠的腦中，發(fā)現(xiàn)AD大鼠的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量有明顯的恢復(fù)[18]。Kim等人發(fā)現(xiàn)，錳鐵氧體/二氧化鈰共同修飾的納米粒子也能夠有效清除ROS[27]。Samai等發(fā)現(xiàn)，葉酸和聚丙烯酸功能化的納米氧化鈰具有顯著的抗淀粉蛋白活性，表明它能夠有效抑制AD等神經(jīng)退行性疾病中Aβ的形成，從而抑制ROS的形成，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[28]。以上研究表明對(duì)納米CeO2進(jìn)行修飾后，能夠改變其作用性質(zhì)，從誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生損傷細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榍宄齊OS提高細(xì)胞活力。通過上述分析可知，經(jīng)過修飾的納米CeO2在清除ROS方面具有巨大的潛力，這為尋求AD的新型治療藥物提供了新方向。同時(shí)，納米材料在越來越多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，如機(jī)械、紡織、化工、家用電器、化妝品和醫(yī)藥衛(wèi)生等與我們?nèi)粘Ｉ蠲芮邢嚓P(guān)的領(lǐng)域，其毒性對(duì)人類身體健康的影響不容小覷[12]。因此，本研究主要研究了納米CeO2對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活力的影響及其機(jī)制，為進(jìn)一步修飾CeO2，使其表現(xiàn)出抗氧化特性的研究打下基礎(chǔ)，同時(shí)為預(yù)防由納米CeO2引起的神經(jīng)疾病提供科學(xué)依據(jù)。