劉 冉，花亮亮，陳 娟，蔡 飛，李彩蓉**

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年人最常見的神經(jīng)退行性疾病，其臨床特點(diǎn)主要表現(xiàn)為進(jìn)行性的認(rèn)知功能障礙[1]。AD的病因是多因素的，一般認(rèn)為遺傳、環(huán)境和飲食因素之間的相互作用在AD的發(fā)病機(jī)制中起著一定的作用。大量的流行病學(xué)研究表明，富含飽和脂肪的飲食會(huì)增加患AD的風(fēng)險(xiǎn)[2]；大量實(shí)驗(yàn)室研究也發(fā)現(xiàn)飽和脂肪酸飲食可增加血漿中飽和游離脂肪酸、棕櫚酸和硬脂酸的水平，導(dǎo)致嚙齒動(dòng)物模型出現(xiàn)認(rèn)知障礙以及學(xué)習(xí)和記憶缺陷。

SH-SY5Y細(xì)胞衍生于人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，具有神經(jīng)元的某些特性，可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制研究。棕櫚酸(palmitic acid，PA)可造成脂毒性損傷，是用來制作各種損傷模型的常見飽和脂肪酸之一。本實(shí)驗(yàn)以SH-SY5Y細(xì)胞為研究對(duì)象，采用PA作為致病因子，研究磷酸二酯酶抑制劑洛利普蘭(rolipram，Rol)對(duì)PA作用下SH-SY5Y細(xì)胞的影響，并探究相關(guān)機(jī)制，為研究AD的發(fā)病機(jī)制和藥物防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞與相關(guān)試劑

SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(武漢華聯(lián)科技生物有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清 (FBS，Gibco公司)；青/鏈霉素(P/S，Hyclone公司)；0.25% EDTA 胰酶(Gibco公司)；Rol(Solarbio公司)；棕櫚酸(Solarbio公司)；Anti- Cleaved-Caspase3(Cell Signaling Technology)；Anti-GAPDH(Cell Signaling Technology)；MTT(大連美侖生物科技有限公司)；超氧化物陰離子熒光探針(DHE，碧云天公司)；DAPI(武漢科瑞有限公司)；其它為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含有10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，水平放置在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度80%～90%時(shí)，用0.25% EDTA 胰酶進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

給予0.2、2、20、100、200μmol/L的Rol作用細(xì)胞，培養(yǎng)24h，進(jìn)行細(xì)胞存活率的檢測(cè)；給予不同濃度Rol(2.5、5、10、20μmol/L)進(jìn)行預(yù)處理1h，然后給予 PA(150μmol/L)作用24h，檢測(cè)不同濃度Rol對(duì)PA作用下SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響；選取濃度10 μmol/L Rol觀察其對(duì)150μmol/L PA作用下SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS以及凋亡蛋白Cleaved-caspase-3表達(dá)的影響。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率

取出生長(zhǎng)至融合度為80%～90%的細(xì)胞，將其傳代消化，并種于96孔板中，每孔中細(xì)胞數(shù)量約為8×103。種板結(jié)束后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待孔板中細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度為70%～80%時(shí)，吸出原有培養(yǎng)基并加入不同濃度的Rol和PA作用于細(xì)胞。作用24 h后，避光操作，每孔加入預(yù)先配置好的MTT溶液20μL ，作用4h，避光操作。小心吸出孔內(nèi)液體，每孔加入150μL DMSO，490nm吸光度檢測(cè)每孔OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 DHE染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS

在超凈臺(tái)中，將細(xì)胞爬片加入到24孔板中，待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%，開始種板，細(xì)胞數(shù)目約為5×104，注意種板時(shí)不要?jiǎng)×一蝿?dòng)。24 h后，孔板中細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%后開始給藥，分別給藥24h后，PBS清洗3遍，洗去死細(xì)胞。避光配置DHE試劑溶液，每孔加250μL(覆蓋孔板即可)，培養(yǎng)箱放置30min。在培養(yǎng)箱取出，PBS清洗3遍，將配置好的DAPI試劑溶液均勻的滴加在爬片上15μL左右，作用10min。在培養(yǎng)箱取出，PBS清洗3遍， 取出爬片，放置在已經(jīng)加好抗熒光萃取劑的載玻片上。將玻片放入熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度及照相。

1.5 Western blot檢測(cè)凋亡蛋白Cleaved-caspase3的表達(dá)

各組取30μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用60V電泳30min后轉(zhuǎn)120V電泳1h左右；在300 mA下轉(zhuǎn)印160min后將膜放在5%脫脂奶粉中室溫封閉1.5h；加入適當(dāng)用TBST按比例(1∶1000)稀釋的Antibody Cleaved-caspase3，并 4℃孵育過夜。一抗孵育過后，用TBST 洗滌3次后加入適當(dāng)用TBST按比例(1∶5000)稀釋的二抗，孵育1h。二抗孵育過后，用TBST 洗滌3次后避光顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度Rol對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

給予0.2、2、20、100、200μmol/L 的Rol作用SH-SY5Y細(xì)胞24h，采用MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.2μmol/L和2μmol/L 的Rol對(duì)細(xì)胞存活率沒有明顯影響，20μmol/L、100μmol/L及200μmol/L 的Rol可降低細(xì)胞存活率(P<0.05)，見圖1。

與Con組比較，**P<0.05

2.2 不同濃度Rol對(duì)PA作用下SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

給予不同濃度Rol(2.5、5、10、20μmol/L)進(jìn)行預(yù)處理1h，然后給予 PA(150μmol/L)作用24h，采用MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2.5μmol/L和5μmol/L 的Rol稍微增加PA作用下細(xì)胞存活率，但與PA組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；10μmol/L與20μmol/L的Rol可增加PA作用下細(xì)胞存活率，與PA組相比有顯著性差異(P均<0.05)，結(jié)合前面不同濃度Rol對(duì)細(xì)胞存活率的影響，我們選擇10μmol/L的Rol進(jìn)行后面的實(shí)驗(yàn)，見圖2。

與Con組比較，**P<0.01；與PA組比較，##P<0.01

2.3 Rol對(duì)PA作用下SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

將圓形載玻片置于6孔板中，然后種入SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為正常(Con)組、PA組、PA+Rol組、Rol組。預(yù)先給予Rol，然后給予PA作用24h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后給予熒光染色，觀察各組細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PA處理后，細(xì)胞內(nèi)的ROS熒光染色明顯增加，表現(xiàn)為粉紅色點(diǎn)狀變多；預(yù)先給予Rol預(yù)處理，可以減輕PA所導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)，與PA組相比，有顯著性差異(P<0.01)；Rol組對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS無(wú)明顯影響。見圖3(封二)。

2.4 Rol對(duì)PA作用下SH-SY5Y細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase3的影響

將SH-SY5Y細(xì)胞在6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分為正常(Con)組、PA組、PA+Rol組、Rol組。預(yù)先給予Rol，然后給予PA作用24h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后提取總蛋白，用Western blot檢測(cè)凋亡蛋白Cleaved-Caspase3的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PA可導(dǎo)致Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)升高，與Con相比有明顯差異(P<0.01)；預(yù)先給予Rol預(yù)處理，可以減輕PA所導(dǎo)致的凋亡蛋白表達(dá)，與PA組相比，有顯著性差異(P<0.01)；Rol組對(duì)Cleaved-Caspase3蛋白無(wú)明顯影響。見圖4(封二)。

3 討 論

隨著社會(huì)人口的老齡化，AD的發(fā)病率越來越高，飽和脂肪和富含棕櫚酸鹽的飲食會(huì)誘發(fā)AD和輕度認(rèn)知障礙。AD的病理特征包括細(xì)胞內(nèi)聚集的超磷酸化tau蛋白形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，細(xì)胞外聚集的淀粉樣蛋白形成老年斑，而BACE1 是淀粉樣蛋白形成的核心因素。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，在許多AD嚙齒動(dòng)物模型中，高脂肪飲食可增加BACE1活性和促進(jìn)淀粉樣蛋白形成[3]。因此，利用PA制作脂毒性損傷模型可為體外研究AD的發(fā)病提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。大量的研究表明，氧化?yīng)激及細(xì)胞凋亡在AD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)制和藥物防治是目前研究的熱點(diǎn)問題。

磷酸二酯酶抑制劑通過抑制磷酸二酯酶活性，增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，增加鈣離子內(nèi)流，產(chǎn)生正性肌力的作用，在心衰、哮喘及勃起功能障礙等疾病中使用較為廣泛[4]。Rol是一種磷酸二酯酶4的抑制劑[5]，其對(duì)AD認(rèn)知功能障礙的作用及作用機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y為研究對(duì)象，采用PA制作脂毒性損傷模型，觀察Rol的防治作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1～10 μmol/L Rol對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響，20～200μmol/L的Rol對(duì)細(xì)胞的損傷逐漸增大；MTT檢測(cè)顯示10μmol/L的Rol可增加150μmol/L PA作用下SH-SY5Y細(xì)胞存活率；研究發(fā)現(xiàn)PA可致SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS增加，導(dǎo)致Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)上調(diào)，預(yù)先給予Rol可逆轉(zhuǎn)上述改變。以上結(jié)果提示Rol對(duì)PA所致細(xì)胞脂毒性損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡有關(guān)，該研究可為Rol用于AD的防治提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。