高偉年，趙曙光，郭 娜，陳子英，張文立，閆 芳

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心臟大血管外科，石家莊 050000；2.石家莊市中醫(yī)院心病一科，石家莊 050051）

心臟主要由心肌細(xì)胞，非心肌細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞）以及細(xì)胞外基質(zhì)組成［1-2］。心肌肥厚是常見的心臟病理表現(xiàn)，長期心肌肥厚最終會導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生［3-4］。心肌肥厚是一個復(fù)雜的病理生理過程，雖然目前發(fā)現(xiàn)許多生物學(xué)過程都與心肌肥厚的發(fā)展密切相關(guān)［5-6］，但是心肌肥厚發(fā)生的機制尚不清楚。泛素特異性蛋白酶2（ubiquitin specific protease 2，USP2）是去泛素化酶家族中的重要一員，所編碼的蛋白活性對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)核因子-κB（NF-κB）信號通路的持續(xù)激活是必須［7-8］。已有研究表明，USP2可與脂肪酸合酶（FAS，抑制細(xì)胞凋亡蛋白），小鼠雙微體基因（MDM2），細(xì)胞周期蛋白D1等蛋白相互結(jié)合，并使這些蛋白去泛素化從而抑制其降解［9-11］。已有研究表明，USP2可以與心肌細(xì)胞膜上的鈣通道蛋白KCNQ1相互結(jié)合，調(diào)節(jié)心肌節(jié)律［12］。但直到目前為止，USP2在心肌肥厚中的作用尚不清楚，因此，本研究旨在研究USP2在心肌肥厚中的作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

無特定病原體（SPF）級的C57BL/6雄性小鼠10只，鼠齡9～11周，體質(zhì)量22～25 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（SCXK（京）-2018-004）。無特定病原體級Sprague-Dawley（SD）大鼠20只，出生時間為72 h，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（SCXK（冀）-2018-004）。無菌手術(shù)在河北省實驗動物中心進行［SYXK（冀）2018-008］。實驗過程對實驗動物按照3R原則給與人道的關(guān)懷。實驗試劑：異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）（濟南科匯藥業(yè)有限公司），干擾USP2腺病毒（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京天根生物），SuperReal熒光定量預(yù)混試劑（北京天根生物），極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京天根生物），RIPA Lysis and Extraction Buffer（美國賽默飛），蛋白酶抑制劑（美國賽默飛），TRIzol（美國賽默飛），磷酸酶抑制劑（美國賽默飛），USP2鼠抗人單克隆抗體（上海艾博抗），GAPDH鼠抗人單克隆抗體（上海艾博抗），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天），辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（上海碧云天）。

1.2 主要儀器

實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國Bio-Rad），高速冷凍離心機（德國Eppendorf），冷凍冷藏兩用冰箱（中國海爾），-80℃超低溫冰箱（美國賽默飛），轉(zhuǎn)膜儀（北京六一），電泳儀（北京六一）。

1.3 異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠模型的建立

實驗分為心肌肥厚組及對照組。將配置好的ISO（8.7 mg·kg-1·d-1）注入滲透壓微泵，放置于心肌肥厚組小鼠背部皮下，持續(xù)處理7 d。對照組小鼠持續(xù)給予0.9%氯化鈉溶液處理7 d。

1.4 分離大鼠原代心肌細(xì)胞

根據(jù)參考文獻［13］，取新生乳大鼠心臟，眼科剪將心臟剪成小碎塊，0.2%胰蛋白酶中重復(fù)消化，1 200 r/min離心，15%胎牛血清的DMEM（Dulbecco Eagle's minimum essential medium）培養(yǎng)基懸浮沉淀，300目網(wǎng)過濾，預(yù)貼壁1 h后，將上清重新轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中。

1.5 ShRNA腺病毒感染

將USP2干擾及其對照腺病毒加入原代心肌細(xì)胞中，感染48 h后收集細(xì)胞進行后續(xù)實驗。USP2干擾序列為：5'-GGAGGCAGTGGATTTCCTTAT-3'，對照干擾序列為：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。

1.6 熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA。PCR擴增檢測目的基因mRNA的表達水平，GAPDH為內(nèi)參基因，分別設(shè)3個復(fù)孔。本研究中所用引物如表1所示。

表1 本研究中所用引物

1.7 Western blot檢測方法

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解液RIPA（radio immunoprecipitation assay）冰上裂解20 min。4℃，12 000 r/min離心15 min后收集上清。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)印于聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入一抗和二抗孵育，顯影。

1.8 細(xì)胞面積的計算

原代心肌細(xì)胞使用α-actinin免疫熒光染色后，Image J軟件分析心肌細(xì)胞的面積。每組隨機測量10個細(xì)胞計算面積，取均值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠心肌肥厚模型建立的檢測結(jié)果

與對照組相比，ISO處理后的小鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值顯著升高（圖1A），可見ISO誘導(dǎo)的小鼠心臟質(zhì)量增加，發(fā)生心肌肥厚。熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測心肌肥厚關(guān)鍵基因表達水平的結(jié)果顯示，與對照組相比，ISO處理組心臟組織中ANP（t=27.11，P＜0.001）、BNP（t=17.75，P＜0.001）及MYH7（t=15.34，P＜0.001）基因的mRNA水平顯著增加（圖1B）。說明小鼠心肌肥厚模型建立成功［14］。

2.2 對照組與異丙腎上腺素處理組小鼠泛素特異性蛋白酶2表達比較

與對照組小鼠比較，ISO處理組小鼠的USP2的mRNA及蛋白表達水平均顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2，t=5.83，P＜0.01）。

2.3 對照組和干擾組大鼠泛素特異性蛋白酶2基因mRNA及蛋白表達量比較

腺病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)對USP2基因的干擾效果如圖3所示，與對照組大鼠比較，USP2干擾組大鼠USP2基因mRNA和蛋白的表達量顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.53，P＜0.001）。

2.4 干擾泛素特異性蛋白酶2的表達抑制異丙腎上腺素引起的心肌肥厚反應(yīng)

在ISO刺激的原代心肌細(xì)胞中，抑制USP2的表達可以顯著減小心肌細(xì)胞的面積（圖4A，AdshCtrl PBSvs.ISO，t=32.23，P＜0.001；ISO Ad-shCtrlvs.ISO Ad-shUSP2，t=24.23，P＜0.001），同時也可以抑制ISO上調(diào)的心肌肥厚標(biāo)志基因ANP（圖4B，Ad-shCtrl PBSvs.ISO，t=21.42，P＜0.001；ISO AdshCtrlvs.ISO Ad-shUSP2，t=14.56，P＜0.001）和BNP（圖4C，Ad-shCtrl PBSvs.ISO，t=22.67，P＜0.001；

圖1 對照組與ISO處理組小鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值及ANP，BNP和MYH7表達的比較（A：對照組與ISO處理組小鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值比較；B：對照組與ISO處理組小鼠qRT-PCR檢測的ANP，BNP和MYH7表達比較）

圖2 對照組與ISO處理組小鼠USP2表達的比較（A：對照組與ISO處理組小鼠qRT-PCR檢測USP2的mRNA表達量比較；B：對照組和ISO處理組小鼠Western blotting檢測的USP2蛋白表達量比較）

圖3 對照組和USP2干擾組大鼠USP2基因mRNA及蛋白表達量比較（A：對照組和USP2干擾組大鼠qRT-PCR檢測的USP2 mRNA表達量比較；B：對照組和USP2干擾組大鼠Western blotting檢測USP2的蛋白表達量比較）

ISO Ad-shCtrlvs.ISO Ad-shUSP2，t=18.62，P＜0.001）基因表達。在對照組中干擾USP2的表達對細(xì)胞大小，ANP、BNP及MYH7基因的表達并無顯著影響。這些結(jié)果表明干擾USP2的表達能夠顯著抑制ISO誘導(dǎo)的心肌肥厚反應(yīng)。

3 討論

圖4 干擾USP2可以抑制心肌肥厚的發(fā)生（A：干擾USP2可以顯著抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大；B：干擾USP2可以顯著抑制ISO誘導(dǎo)的ANP基因的上調(diào)；C：干擾USP2可以顯著抑制ISO誘導(dǎo)的BNP基因的上調(diào)）

心肌肥厚是心肌細(xì)胞應(yīng)對內(nèi)外刺激而增加心臟泵血功能和減少心室壁張力的一種適應(yīng)性生長［15-16］。心肌肥厚包括生理性肥厚和病理性肥厚，雖然兩者均表現(xiàn)為心臟大小的增加，但是病理性肥厚伴隨心肌細(xì)胞的凋亡和壞死，細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積導(dǎo)致心肌纖維化，心臟功能障礙和心力衰竭乃至猝死風(fēng)險的增加［17-18］。

本研究發(fā)現(xiàn)，USP2在ISO誘導(dǎo)的肥厚小鼠中的表達顯著增加，用腺病毒敲低USP2的表達能夠抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞大小，抑制ISO誘導(dǎo)的肥厚基因的表達。心肌肥厚過程中會發(fā)生蛋白合成的增加和基因表達模式的改變。心肌肥厚過程中胚胎期基因，包括ANP，β-肌球蛋白重鏈等，表達顯著增加。同時心肌肥厚過程中也會伴隨著一些蛋白表達水平的下調(diào)。本研究使用ANP，BNP和MYH7作為判斷心肌肥厚的基因指標(biāo)，ISO誘導(dǎo)可以促進上述3種基因的表達水平顯著升高，而干擾USP2可以抑制ISO對上述3種基因的誘導(dǎo)作用，提示USP2參與心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展。

USP2定位于人的11q23.3號染色體上，共有17個外顯子。USP2基因可以產(chǎn)生7個選擇性剪接變體，其中5個可以編碼蛋白［19］。已有研究表明，USP2可與多種蛋白相互作用并對其進行去泛素化，影響蛋白的穩(wěn)定性；例如USP2可以與脂肪酸合成酶相互作用，從而促進脂肪酸合酶的半衰期，穩(wěn)定脂肪酸合酶［9］，而沉默USP2導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［20］。而作為機體耗能最多的一個器官，心肌肥厚過程中心肌代謝模式發(fā)生轉(zhuǎn)變，脂肪酸利用減少，葡萄糖攝取及糖酵解增加［21］，因此干擾USP2可能通過降低脂肪酸合酶的穩(wěn)定性，降低心肌脂肪酸的合成，從而參與心肌肥厚過程中心肌的代謝方式。心肌細(xì)胞肥厚過程中，心肌細(xì)胞會發(fā)生凋亡和壞死，由于絕大多數(shù)的心肌細(xì)胞在出生后就失去增殖能力，死亡的心肌細(xì)胞會由大量的細(xì)胞外基質(zhì)替代［22］，過量的細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致瘢痕或纖維化的形成，最終導(dǎo)致心律失常［23］。已有研究表明，USP2可以與心肌細(xì)胞膜上的鈣通道蛋白KCNQ1相互結(jié)合，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞節(jié)律［12］，提示USP2可能通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞節(jié)律參與心肌肥厚的發(fā)生。雖然本研究發(fā)現(xiàn)USP2參與心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展，但USP2如何發(fā)揮功能尚待進一步探討。USP2作為去泛素蛋白酶家族成員，是否通過調(diào)控上述蛋白穩(wěn)定性或者調(diào)節(jié)其他靶蛋白的泛素化發(fā)揮功能尚待進一步探討。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)ISO誘導(dǎo)心肌肥厚過程中，USP2表達上升，靶向敲低USP2可以有效的抑制ISO誘導(dǎo)的心肌肥厚。但USP2參與心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展的詳細(xì)作用機制有待深入研究。心肌肥厚的發(fā)生與多種因素有關(guān)，但機制尚不清楚。目前，對于心肌肥厚導(dǎo)致的心力衰竭臨床上缺乏高效的防治方法。因此，本研究將為防治心肌肥厚以及心肌肥厚所致的心力衰竭提供實驗室工作基礎(chǔ)和理論依據(jù)，并為防治心力衰竭提供新的藥物作用靶點。