黃建溶 彭武建 陳燁

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種以免疫性炎癥為最主要臨床表現(xiàn)的彌漫性結締組織,病因不明確,發(fā)病機制復雜。本研究采用Hiseq-2500 測序SLE 患者及健康者外周血單個核細胞micro RNAs,并進行生物信息學分析,為SLE 的早期診斷與治療尋找新的線索?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017～2018 年本院及深圳市第三人民醫(yī)院收治的20 例SLE 患者作為SLE 組,均符合美國風濕病協(xié)會1997 年修訂的SLE 診斷標準［1］,采用SLE 疾病活動度(SLEDAI)評分評估疾病活動度,均≥5 分,患者平均年齡(37.25±9.70)歲。選取同期20 例健康體檢者作為對照組,平均年齡(37.90±9.56)歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。該研究計劃經(jīng)本院倫理會批準,所有研究對象均對本研究知情。

1.2 總RNA 的提取、構建文庫以及測序 抽取受試者外周抗凝血10 ml,于采血后1 h 使用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(PBMCs),加入Trizol 裂解,提取總RNA 用于小 RNA 建庫。樣品檢測合格后,使用Small RNA Sample Pre Kit 構建文庫。運用Illumina Hiseq-2500 高通量測序平臺測序。高通量測序在北京諾禾致源公司協(xié)助下完成。

1.3 測序的初步分析 測序所得小RNA 序列經(jīng)過去污染、去低質量、去接頭一系列過程,獲得長度區(qū)間為18～35 nt 干凈小RNA 序列,用bowtie 將長度篩選后的sRNA 定位到參考序列上,分析small RNA 在參考序列上的分布情況。將上述mapped 到參考序列上的reads 與miRBase 中指定范圍序列進行比對,得到各樣品匹配上的sRNA 的詳細情況,包括匹配上的已知miRNA 的二級結構,各樣本中miRNA 的序列、長度、出現(xiàn)的次數(shù)等信息。

1.4 microRNAs 表達及差異分析 對各樣本中microRNAs行表達量的統(tǒng)計,并用TPM 進行表達量歸一化處理。microRNAs 在兩組樣本間的倍比值≥2 且P<0.05,則認為該microRNAs 在兩組樣本間的表達差異顯著。

1.5 生物信息學分析 對每組差異性表達microRNAs的靶基因的集合分別進行GO 和KEGG 富集分析。

2 結果

2.1 兩組差異性表達microRNAs 用火山圖可以推斷差異microRNAs 的整體分布情況,對差異miRNA 進行篩選,結果見圖1。SLE 組與對照組比較,表達有差異microRNAs 共有282 種,其中表達上調的有 206 種,表達下調的有76 種。表達上調及下調顯著差異的10 例microRNAs 見表1。

2.2 差異性表達microRNAs 靶基因GO 分析 GO富集主要生物學過程、細胞組成、分子功能3 種分類。生物學過程靶基因主要富集在cellular component organization or biogenesis 條目中。細胞組成主要富集在cytoplasm 中。分子功能主要富集在binding 中。顯著富集的各個GO term 中的基因數(shù)見圖2。

2.3 差異性表達microRNAs 靶基因KEGG 分析 差異性表達microRNAs 靶基因共有20 條顯著性KEGG信號通路,主要包括Pathways in cancer、PPAR signaling pathway 等信號通路。靶基因KEGG 富集散點圖見3。PPAR signaling pathway 信號通路圖見圖4。

圖1 顯著差異性表達microRNAs 分析火山圖

表1 SLE 組與正常對照組差異性表達的microRNAs

圖2 差異性表達microRNAs 靶基因的GO 富集分類

圖3 差異性表達microRNAs 靶基因主要聚集的KEGG 通路散點圖

圖4 PPAR 信號通路的KEGG 通路信號圖

3 討論

本研究采用Illumina Hiseq-2500 測序技術研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞microRNAs 與正常對照組差異性表達microRNAs,表達上調的有206 種,表達下調的有76 種。有研究表明miR-127 是影響女性乳腺癌預后的獨立因素,miR-127 高表達可以抑制乳腺癌腫瘤細胞的生長及減少其遷移轉移［2］,研究表明SLE 患者中乳腺癌的發(fā)病率低［3］。miR-4732-5P 在乳腺癌患者中高表達,可以促進乳腺癌細胞的增值、遷移和侵襲［4］,本研究miR-4732-5P 在乳腺癌患者中低表達。Wen 等［5］研究表明miR-889-3p 上調與結核病患者CD1c 呈負相關,而CD1c 在抗結核免疫中發(fā)揮重要作用,而SLE 患者是結核病的高發(fā)人群［6］。

KEGG 通路分析結果提示靶基因主要聚集Pathways in cancer、PPAR signaling pathway 等信號通路。Oxer DS 等研究發(fā)現(xiàn)PPARγ 可激活CD40,為促炎信號,在活動性的SLE 患者中高表達［7］。

綜上所述,SLE 的發(fā)生發(fā)展機制十分復雜,microRNAs 研究可以作研究SLE 發(fā)病機制、尋找特性生物學標志物重要手段之一。