孔 瓊，袁盛勇，李 珣，薛春麗，李林倩，余朝陽，楊紅玉

(1.紅河學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 蒙自 661100； 2.昆明學(xué)院，云南 昆明 650214)

灰葡萄孢(Botrytiscinerea)是一種常見的植物病原真菌，危害200多種植物，侵染植物的花、葉、莖稈等不同器官，造成腐爛和萎蔫[1]，主要通過殺死宿主細(xì)胞、分解宿主組織以及阻礙宿主防御反應(yīng)等方式引起寄主植物發(fā)病[2]。大量文獻(xiàn)研究表明，灰葡萄孢可通過產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶(纖維素酶、蛋白酶、內(nèi)源多聚半乳糖醛酸酶)、激素(脫落酸)、毒素(倍半萜類毒素、草酸)[3-6]等侵染寄主植物，殺死細(xì)胞，從而使植物組織發(fā)生壞死。

病原真菌產(chǎn)生的毒素、激素和酶類往往是引發(fā)寄主植物生病的主要因子[7]?；移咸焰弋a(chǎn)生的毒素根據(jù)其分子質(zhì)量不同分為大分子毒素和小分子毒素，其中有關(guān)有機(jī)類小分子毒素的研究報(bào)道較多。有機(jī)類小分子毒素主要有botrydial、dihydrobotrydial、2,3-dihydroxyprenylisoflavone、β-(1,3)(1,6)-D-glucan、botcinolide、7-O-menthylluteone等[8-10]，可引起細(xì)胞裂解，從而造成寄主植物枯黃。根據(jù)寄主范圍不同可將真菌毒素分為寄主選擇性毒素和非寄主選擇性毒素。寄主選擇性毒素對(duì)寄主植物具有特異生理活性和高度?；宰饔梦稽c(diǎn)，對(duì)寄主外的植物無致病性，如維多利亞長蠕孢(Helminthosporiumvictoriae)產(chǎn)生的HV毒素侵染燕麥引起疫病，作用于細(xì)胞膜；鏈格孢番茄致病型(Alternariaalternatetomato pathotype)產(chǎn)生的AAL脂類毒素能引起番茄發(fā)生莖枯病，作用于線粒體[11]。非寄主選擇性毒素對(duì)寄主和非寄主植物都具有一定致毒活性和非特異性作用位點(diǎn)，在一定濃度下才能引起植物的敏感性反應(yīng)，如黃曲霉(Aspergillusflavus)分泌的AFV毒素會(huì)引起玉米、花生葉片褪綠或種子腐爛；串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)、禾谷鐮刀菌(F.gramnearum)和花腐鐮刀菌(F.anthophilum)產(chǎn)生的串珠鐮刀菌毒素(M-toxin)能引起小麥赤霉病、玉米穗腐病和馬腦白質(zhì)軟化癥等[12]。真菌毒素可通過破壞寄主植物葉片細(xì)胞膜、線粒體、葉綠體等結(jié)構(gòu)，從而引起光合作用、核酸代謝和蛋白質(zhì)合成等生理生化過程發(fā)生紊亂，最終導(dǎo)致植物表現(xiàn)出不同的發(fā)病癥狀[13]。鑒于此，分別測定灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素對(duì)23種不同植物葉片的致病性和對(duì)7種植物種子的寄主?；?，為了解灰葡萄孢致病因子和病原真菌毒素的致病機(jī)制提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素的制備 灰葡萄孢菌種分離于番茄灰霉病株，保存于紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。將灰葡萄孢菌接種于PSA平板，25 ℃暗培養(yǎng)4 ～ 5 d。將菌絲塊接種到PS液體培養(yǎng)基，于25 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)20 d，分別通過快速、中速和慢速抽濾，取出菌絲，將濾液于4 ℃、5 000 r/min 離心 20 min。取上清液裝入截留分子質(zhì)量為14 ku的透析袋內(nèi)，于4 ℃條件下雙蒸水透析5 d(每天換3 ～ 4次雙蒸水)。用0.22 μm微孔膜過濾，冷凍干燥，使其呈粉末狀，再配制成所需濃度備用。夏紹嫘[14]前期對(duì)該粉末成分進(jìn)行了分離分析，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)占75.8%，因此，將該大分子毒素命名為蛋白質(zhì)毒素?；移咸焰叩鞍踪|(zhì)毒素(該蛋白質(zhì)毒素能引起煙草懸浮細(xì)胞發(fā)生程序化死亡)的質(zhì)量濃度為0.022 6 mg/mL。

1.1.2 供試植物選取 選取健康無病蟲害的16科23種植物葉片作為灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素致病性測定的試驗(yàn)材料。其中，BY-2煙草、桂花、美人蕉、枇杷、菊花、番茄、花葉鴨腳木、仙羽蔓綠絨、朱頂紅、芒果、金葉女貞、三角梅、連翹、雞蛋花等14種植物采自紅河學(xué)院校園，葉用萵苣、葡萄、橘子、辣椒、梔子花、蘆薈、蠶豆、豌豆、四季豆等9種植物購于市場?；移咸焰叩鞍踪|(zhì)毒素非寄主專化性測定所用大白菜、蘿卜、辣椒、番茄、豌豆、蠶豆、四季豆等7種供試植物種子購于農(nóng)資公司。

1.2 灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素對(duì)不同植物致病性測定

采用針刺滲入法對(duì)23種植物葉片進(jìn)行離體接種。接種前先將離體葉片用75%乙醇擦拭，再用無菌水清洗表面3次，用一次性注射器針頭于供試植物葉片表面(避開葉脈)刺1個(gè)小孔，去掉針頭，從小孔處滲入蛋白質(zhì)毒素，每片10 μL，以無菌水為對(duì)照，5次重復(fù)。接種24 h遮光保濕培養(yǎng)后，于人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行光照與黑暗交替培養(yǎng)(L∶D=12 h∶12 h)，每天觀察發(fā)病情況，7 d后統(tǒng)計(jì)葉片病斑面積大小。

1.3 灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素對(duì)不同寄主的專化性測定

選取大白菜、蘿卜、辣椒、番茄、豌豆、蠶豆、四季豆種值物大小和飽滿程度相似的種子，經(jīng)5%次氯酸鈉溶液浸泡20 min后，用無菌水沖洗2～3次，再用灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素浸種5 h，最后進(jìn)行保濕培養(yǎng)(含有5 mL蛋白質(zhì)毒素)，3 ～ 8 d觀察結(jié)果。培養(yǎng)條件：溫度為26 ℃、濕度為80%，暗培養(yǎng)。以無菌水處理作為對(duì)照，測定毒素對(duì)種子萌發(fā)及胚芽生長的影響(胚芽長度超過種子長軸長度1/2時(shí)計(jì)為萌發(fā)，從胚芽與種子的連接處到胚芽尖端的長度計(jì)為胚芽長度)。

萌發(fā)抑制率=(對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率)/對(duì)照萌發(fā)率×100%；

生長抑制率=(對(duì)照胚芽長度-處理胚芽長度)/對(duì)照胚芽長度×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013整理后，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，用單因素新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性區(qū)分(P<0.05)，數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素致病性分析

2.1.1 植物發(fā)病表型觀察 通過滲透離體接種試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)被灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素侵染的植物葉片可出現(xiàn)斑點(diǎn)、黃化、萎蔫和腐爛等病狀。其中，蠶豆、豌豆、四季豆(豆科)，番茄、辣椒、煙草(茄科)，菊花、葉用萵苣(菊科)，連翹、桂花(木犀科)，葡萄(葡萄科)，雞蛋花(夾竹桃科)，仙羽蔓綠絨(天南星科)，枇杷(薔薇科)，朱頂紅(石蒜科)，芒果(漆樹科)和花葉鴨腳木(五加科)這17種供試植物葉片均在接種部位出現(xiàn)軟化、變褐、變黃甚至腐爛的現(xiàn)象。滲入無菌水的葉片培養(yǎng)7 d后無任何癥狀出現(xiàn)(圖1B、1D)，葉片顏色正常；而滲入灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素后的朱頂紅葉片于第3天開始發(fā)病，起初為水漬狀和淡黃色斑塊，面積較小，隨后病斑擴(kuò)大，第7天時(shí)葉片表現(xiàn)為褪綠、變褐、變黃，接種處邊緣有明顯的水漬狀且病斑易腐爛(圖1A)。相似的現(xiàn)象也出現(xiàn)于番茄葉片上(圖1C)。

而蘆薈(百合科)、三角梅(紫茉莉科)、金葉女貞(木犀科)、橘子(蕓香科)、梔子花(茜草科)和美人蕉(美人蕉科)6種供試植物葉片滲入灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素7 d后，植物葉片無任何病狀(圖1E、1G)，與無菌水處理無差異(圖1F、1H)。

A.滲入灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素的朱頂紅葉片；B.滲入無菌水的朱頂紅葉片；C.滲入灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素的番茄葉片； D.滲入無菌水的番茄葉片；E.滲入灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素的梔子花葉片；F.滲入無菌水的梔子花葉片；G.滲入灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素的三角梅葉片；H.滲入無菌水的三角梅葉片

2.1.2 灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素致病性測定 從表1可看出，在供試的23種植物中，灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素能引起17種植物葉片發(fā)病，且出現(xiàn)癥狀，占全部供試植物的73.91%。其中，石蒜科的朱頂紅葉片發(fā)病較嚴(yán)重，其病斑面積最大，為(2.18±0.44)cm2，顯著高于其他處理；其次為茄科的辣椒和五加科的花葉鴨腳木2種植物，病斑面積分別為(0.81±0.33)cm2、(0.80±0.13)cm2，但二者差異不顯著。之后，分別是菊科的菊花和萵苣、茄科的番茄和煙草、豆科的蠶豆和豌豆。木犀科的連翹和四季桂、天南星科的仙羽蔓綠絨、漆樹科的芒果發(fā)病最輕，病斑較小。綜上，灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素對(duì)石蒜科、茄科、五加科、菊科和豆科植物葉片的致病性較強(qiáng)，而對(duì)百合科的蘆薈、紫茉莉科的三角梅、木犀科的金葉女貞、蕓香科的橘子、茜草科的梔子花、美人蕉科的美人蕉無致病性。

表1 灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素對(duì)不同植物的致病情況Tab.1 Pathogenicity of protein toxin secreted from Botrytics cinerea on different plants

注：“+”表示發(fā)病，“-”表示不發(fā)病。同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: “+” means pathogenic; “-” means non-pathogenic.Data with different letters in the same column mean significantly different(P<0.05),the same below.

2.2 灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素寄主?；苑治?/h3>

通過種子萌發(fā)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素對(duì)7種非寄主植物種子萌發(fā)具有抑制作用。用灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素處理的豌豆種子于處理后第6天才開始萌發(fā)，而空白對(duì)照則第3天就開始萌發(fā)，其萌發(fā)率明顯低于空白對(duì)照；相似的結(jié)果也表現(xiàn)于大白菜種子萌發(fā)試驗(yàn)中。在處理的7種供試植物種子中，灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素對(duì)十字花科大白菜種子抑制影響尤為明顯，萌發(fā)抑制率最高，達(dá)84.21%，其次分別是蠶豆(79.61%)、豌豆(79.44%)、四季豆(68.09%)、番茄(64.83%)、蘿卜(58.92%)，對(duì)辣椒的抑制作用最小，萌發(fā)抑制率僅為41.08%(表2)。經(jīng)灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素處理后，7種植物種子的胚芽生長也受到抑制。其中，對(duì)大白菜胚芽生長抑制作用最明顯，生長抑制率達(dá)到86.55%，其次是四季豆，生長抑制率為 80.03%，對(duì)番茄胚芽生長的抑制作用最小，生長抑制率為58.36%。

表2 灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素對(duì)7種植物種子萌發(fā)和胚芽生長的影響

3 結(jié)論與討論

植物病原真菌在引起寄主發(fā)生病害過程中，往往通過代謝產(chǎn)生的毒素破壞寄主細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、線粒體和葉綠體等器官，從而導(dǎo)致寄主植物生理生化失調(diào)，影響寄主植物水分、蛋白質(zhì)、核酸、酶類和酚類代謝紊亂，最終致使寄主植物死亡[11]。毒素的化學(xué)組分較復(fù)雜，主要有多糖及糖苷類化合物[棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)分泌的糖類毒素][15]、肽和蛋白質(zhì)類化合物[大麥條紋病菌(Pyrenophoragraminea)分泌的糖肽類毒素、煙草黑脛病菌(Pytophthoranicotianae)分泌的糖蛋白質(zhì)類毒素][16-17]、酯類化合物[甜菜尾孢菌(Cercosporabeticola)產(chǎn)生的甘油三酯毒素][18]、芳環(huán)和雜環(huán)類化合物[大蒜白斑病菌茄匍柄霉(Stemphyliumsolani)分泌的酚類毒素、百日草鏈格孢菌(Alternariazinniae)產(chǎn)生的酚類毒素][18-19]、萜和甾類[尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和串珠鐮刀菌(F.moniliforme)分泌的菲醌甾類毒素和單端孢霉烯、類胡蘿卜素萜類毒素][20]、氨基酸衍生物類化合物[細(xì)極鏈格孢菌(Alternariatenuissima)分泌的細(xì)鏈格孢酮酸毒素][21]等，這些化合物對(duì)寄主植物都有一定的毒性，只是強(qiáng)弱程度不同。本研究從灰葡萄孢培養(yǎng)濾液中所提取的毒素是胞外大分子物質(zhì)，為蛋白質(zhì)。

前人研究發(fā)現(xiàn)，灰葡萄孢分泌產(chǎn)生的大分子毒素能引起擬南芥(十字花科)、番茄和辣椒(茄科)、朱頂紅(石蒜科)等17種植物發(fā)生病害，但不能危害百合科的百合、冬青科的傘花冬青和紫茉莉科的三角梅[22]。本研究中，灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素能引起供試植物葉片褪綠、變黃、變褐、逐漸腐爛的現(xiàn)象；同時(shí)通過毒素滲入接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該毒素能引起供試的17種植物發(fā)生癥狀，占供試植物的73.91%，而對(duì)百合科的蘆薈、紫茉莉科的三角梅和木犀科的金葉女貞等6種植物無致病性；對(duì)供試7種農(nóng)作物種子萌發(fā)和胚芽生長均有一定的抑制作用。研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了灰葡萄孢蛋白質(zhì)毒素具有致病性且寄主范圍廣，是一種非寄主?；远舅?，但其理化性質(zhì)、作用位點(diǎn)及毒素鈍化劑的研發(fā)還有待進(jìn)一步研究，以期為灰葡萄孢致病機(jī)制和由其引起的病害防治提供新的策略。