陳玉梅，周景明，劉東民，馬麗萍，馮 景，劉運超

(1.鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450001； 2.河南中澤生物工程有限公司，河南 鄭州 450000)

豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)為無囊膜的單鏈線狀DNA病毒，二十面體等軸立體對稱結(jié)構(gòu)(T=1)，病毒粒子呈六角形或圓形，平均直徑20～26 nm，分子質(zhì)量為5.3×106u，主要引起母豬的繁殖障礙，導致懷孕母豬的死胎和木乃伊胎、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征等[1-2]。PPV在我國流行極為廣泛，豬場檢測病毒陽性率極高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[3]。PPV 基因組包括2個開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2 和NS3；ORF2 主要編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2 和VP3，它們的分子質(zhì)量依次是83 ku、64 ku和60 ku[4-6]。VP1和VP2是從一組嵌套的編碼序列中翻譯出來的，較小的VP2是從與較大的VP1相同的RNA模板中剪接產(chǎn)生的，只是它們的氨基末端不同，而VP3是VP2的翻譯后修飾產(chǎn)物。VP1蛋白大約占病毒粒子10%，主要在病毒復制和感染細胞時發(fā)揮作用，VP2蛋白是PPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占病毒衣殼蛋白總量的60%以上，包含PPV主要的B細胞和T細胞抗原表位[7]。

目前，接種PPV疫苗仍是預防豬細小病毒感染的主要手段之一[8]。PPV疫苗的發(fā)展經(jīng)歷了弱毒苗到滅活苗的過程，出于對疫苗本身安全性的考慮，弱毒疫苗的毒株和滅活疫苗的滅活手段也在不斷改進，但是弱毒疫苗毒力返強和滅活疫苗滅活失敗的危險，始終是困擾現(xiàn)有PPV疫苗防治策略的一個重要問題[7]。同時，長期、大劑量、多頻次PPV疫苗免疫給豬場的生產(chǎn)帶來很大的經(jīng)濟和勞動量負擔。通過系統(tǒng)研究野外分離株中VP蛋白的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)了PPV新的變異株，傳統(tǒng)的PPV疫苗株的抗血清不能有效中和這些病毒[9]。PPV的變異給豬場PPV的防控帶來新的壓力，而一種安全、高效的疫苗對PPV的清除工作尤其關鍵。重組表達的VP2蛋白能自我裝配成病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)，是良好的抗原轉(zhuǎn)運載體，并且能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，因此，VP2蛋白對研究PPV疫苗具有很高的價值[6-7]。ANTONIS等[10]將PPVVP2基因成功克隆至桿狀病毒表達系統(tǒng)，并在體外成功獲得PPV VLPs，其免疫豚鼠和豬均能產(chǎn)生免疫保護反應。另外，國內(nèi)外多個研究機構(gòu)采用桿狀病毒表達系統(tǒng)制備了VLPs，且該VLPs能夠保護豚鼠抵抗PPV感染[11-15]。可見，PPV VP2在真核表達系統(tǒng)中能夠順利地形成VLPs結(jié)構(gòu)，但是表達量較低，難以產(chǎn)業(yè)化應用。而采用原核表達系統(tǒng)表達VP2量較高，卻難以實現(xiàn)可溶性表達，更難于形成VLPs結(jié)構(gòu)。目前在原核表達系統(tǒng)中獲得高活性的PPV VP2蛋白仍然是一個重大挑戰(zhàn)，司艷紅等[16]將PPVVP2基因克隆到pET32a上，在E.coli中成功表達了以包涵體形式存在的VP2與Trx-His-tag的融合蛋白，經(jīng)復性處理后未能得到VLPs。鑒于此，采用改進的大腸桿菌表達系統(tǒng)體外表達獲得可溶性PPV VP2蛋白，經(jīng)體外裝配形成VLPs，通過進一步研究VLPs疫苗刺激昆明鼠產(chǎn)生免疫應答效果，分析VLPs刺激機體產(chǎn)生特異性抗體、血凝抑制抗體及中和抗體的情況，比較PPV VLPs疫苗與商品化滅活疫苗的免疫效果，為PPV VLPs疫苗的研制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 載體、細胞、病毒及供試動物

pET28a等質(zhì)粒和菌種均由鄭州大學生命科學學院抗體工程與分子免疫學實驗室保存。伴侶蛋白Tf16表達質(zhì)粒購自TaKaRa公司。

PK-15細胞及PPV-7909標準毒株由鄭州大學生命科學學院抗體工程與分子免疫學實驗室培養(yǎng)并保存。

供試動物：20只4周齡健康雌性昆明鼠購買自河南省鄭州市實驗動物中心。

1.2 試劑

Prime STAR Max DNA Polymerase、BamH Ⅰ、XhoⅠ、T4 DNA Ligase等分子生物學試劑均購自TaKaRa公司；Anti-6×His-tag antibody購自Proteintech公司；HRP標記的羊抗鼠IgG購自Abcam公司；IPTG、卡那霉素(Kan)、氯霉素(Cm)、L-阿拉伯糖等試劑均購自索萊寶科技有限公司；Ni-NTA親和層析填料(Ni2+柱)購自Norvagen公司；Universal DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司；BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自Thermo公司；胰酶、FBS購自Gibco公司，弗氏完全/不完全佐劑購自Sigma公司。

1.3 PPV VP2原核表達載體的構(gòu)建

以PPV的疫苗株WH-1株為研究對象，在GenBank中查詢PPV VP2蛋白序列(China株，AY5883318)，分析PPV VP2的基因和氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性，同時兼顧GC含量、mRNA的二級結(jié)構(gòu)、核糖體結(jié)合位點和chi位點、限制性酶切位點等信息，優(yōu)化并合成PPV VP2蛋白的基因。設計1對特異性引物，F(xiàn)：GGATCCATGTCGGAAAATGTGGAACA(BamH Ⅰ)。R：CCTCGAGTTAATACAGTTTCCGTGGAATGA(XhoⅠ)。將優(yōu)化合成的PPVVP2基因經(jīng)BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切后亞克隆至原核表達載體pET28a中，經(jīng)菌液PCR、雙酶切鑒定后送樣測序，測序結(jié)果用DNAStar軟件進行分析。將測序正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，用于重組蛋白表達。

1.4 分子伴侶共表達菌株的構(gòu)建

將含有陽性重組載體pET28a-VP2的BL21菌株制成感受態(tài)細胞，將伴侶蛋白質(zhì)粒pTf16轉(zhuǎn)化上述感受態(tài)細胞，涂布含Kan+/Cm+雙抗性的固體LB培養(yǎng)基上，倒置37 ℃恒溫過夜。挑選6個單克隆接種于含Kan+/Cm+雙抗性液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，篩選共表達陽性轉(zhuǎn)化子。

1.5 重組蛋白初步表達與可溶性分析

分別將含pTf16與不含pTf16的pET28a-VP2表達菌體按 1∶1 000比例接種于Kan+/Cm+LB培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r/min 過夜培養(yǎng)活化，將活化菌體按 1∶100比例接種于含Kan+/Cm+雙抗性的LB培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r/min 培養(yǎng)2 h。當OD600為0.6～0.8，將含pTf16質(zhì)粒的pET28a-VP2表達菌中加入終質(zhì)量濃度為 2 mg/mL的L-阿拉伯糖和0.5 mmol/L的IPTG，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；不含pTf16的表達菌只加入IPTG進行誘導。收集誘導后菌體并分別進行超聲破碎，SDS-PAGE及Western blot分析表達產(chǎn)物。

1.6 重組蛋白表達條件優(yōu)化

分別從誘導溫度、誘導時間、IPTG濃度、質(zhì)量濃度等方面進行了優(yōu)化，誘導溫度分別設為16、25、30、37 ℃，0.5 mmol/L IPTG 誘導表達10 h；IPTG濃度分別選擇0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L 5個梯度(在最佳溫度條件下誘導8 h篩選)；共設置6、12、16、20 h 4個誘導時間收獲菌體(在IPTG濃度為0.5 mmol/L、最佳溫度下誘導)。分別用12%分離凝膠進行SDS-PAGE鑒定，以確定重組蛋白的最佳誘導表達條件。

1.7 重組表達蛋白的純化

樣品前處理：收集誘導表達菌體，用pH值8.0的50 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl緩沖液重懸后，進行超聲破碎，12 000 r/min離心30 min，取超聲上清用于純化；分別用20%、30%、40%及50%的(NH4)2SO4沉淀對表達的重組PPV VP2蛋白進行粗純，經(jīng)SDS-PAGE分析粗純效果；經(jīng)透析除去(NH4)2SO4，再選用Ni2+柱進行親和層析純化，采用咪唑濃度梯度洗脫法，用SDS-PAGE、Western blot檢測重組蛋白純度，BCA法測定重組蛋白含量。

1.8 PPV VLPs組裝及檢測

1.8.1 組裝 在獲得高純度PPV VP2蛋白的基礎上優(yōu)化VLPs裝配緩沖液條件，研究 VP2蛋白在體外組裝成VLPs的條件，用pH值8.0的50 mmol/L Tris-HCl作為基礎緩沖液，分別選擇NaCl濃度為50、100、150、200、250 mmol/L 5個梯度，探討鹽離子濃度對VLPs結(jié)構(gòu)組裝效率、穩(wěn)定性的影響。

1.8.2 形成情況檢測 通過透射掃描電鏡(TEM)以及動態(tài)光散射技術(DLS)觀察VLPs形成情況。

1.8.3 血凝活性檢測 采用血凝試驗測定VLPs的血凝活性，取96孔V型板，每孔加入PBS 25 μL，將VLPs進行系列倍比稀釋，至11孔后吸取25 μL棄去，第12孔為PBS對照組，稀釋后每孔再加入PBS 25 μL，最后每孔加入25 μL 1%小鼠紅細胞懸液，微量振蕩器輕微振蕩搖勻，置于室溫(20～25 ℃)，靜止1 h后判定結(jié)果，以能使100%紅細胞凝集的VLPs最高稀釋倍數(shù)作為判定終點。

1.9 VLPs的免疫評價

1.9.1 免疫程序 選取20只健康的昆明鼠隨機分成4組，每組5只： A組免疫30 μg VLPs；B組免疫15 μg VLPs；C組免疫PPV滅活苗100 μL；D組為PBS對照組，免疫100 μL PBS。與佐劑分別配比后乳化免疫鼠(皮下多點注射)，首免用弗氏完全佐劑，加強免疫選用弗氏不完全佐劑，首免后14 d加強免疫一次。免疫后0、7、14、21、28、35、42、49、56 d斷尾采血收集血清，采用ELISA、血凝抑制試驗(HI)和病毒中和試驗(VN)檢測小鼠的抗體應答情況。

1.9.2 ELISA測定抗體效價 用碳酸鹽緩沖液(CBS)將純化的VLPs稀釋成2 μg/mL，按50 μL/孔的量加入96孔ELISA板內(nèi)，4 ℃包被過夜； PBST洗3次，含5%脫脂奶粉的封閉液37 ℃封閉2 h；PBST洗3次，一抗用待檢血清，以1∶100開始按2倍倍比稀釋(1∶100、1∶200……1∶102 400)，二抗用HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)，測定抗體效價。

1.9.3 HI檢測 配制4個100%血凝單位(即4HA100)VLPs與倍比稀釋的待檢血清(1∶100、1∶200……1∶102 400)等體積混勻，每孔50 μL加入96孔血凝板，再加入50 μL 1%小鼠紅細胞懸液，搖勻，室溫放置1 h；判定結(jié)果：HI效價即為完全抑制4HA100單位抗原凝集的血清最高稀釋度。

1.9.4 病毒中和試驗 提前將PK15細胞接種于96孔培養(yǎng)板中；隨即稀釋PPV懸液至200個TCID50；將待檢血清每孔按50 μL在新的96孔板上做2倍連續(xù)倍比稀釋(1∶10、1∶20……1∶5 120)，隨后與稀釋好的病毒懸液1∶1混合，放置1 h；將病毒與血清混合液感染PK15細胞；觀察細胞病變情況，計算血清的中和抗體效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPV VP2蛋白原核表達載體的構(gòu)建及重組蛋白的表達分析

以優(yōu)化合成的VP2基因為模板，應用高保真預混酶Prime STAR Max DNA Polymerase對VP2序列進行擴增，將其插入pET28a載體構(gòu)建重組表達載體pET28a-VP2，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞；經(jīng)菌液PCR、雙酶切鑒定及測序證實后的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)并制成感受態(tài)細胞，將伴侶蛋白質(zhì)粒pTf16轉(zhuǎn)化上述感受態(tài)細胞，涂布于含Kan+/Cm+雙抗性固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑選6個單克隆于Kan+/Cm+雙抗LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)篩選共表達陽性轉(zhuǎn)化子。共表達菌經(jīng)IPTG及L-阿拉伯糖初步誘導后，收集菌體經(jīng)超聲破碎后用SDS-PAGE及Western blot進行檢測，結(jié)果顯示，在可溶性上清和沉淀中均檢測到大小約64 ku的目的蛋白(圖1A)，當與伴侶蛋白Tf16共表達時，VP2蛋白的可溶性表達量明顯增加(圖1B)，其中圖1B中第3孔在約56 ku位置的蛋白是伴侶蛋白Tf16。

2.2 重組VP2蛋白的表達條件優(yōu)化

為了進一步提高重組VP2蛋白的可溶性表達量，分別從誘導時間、溫度、IPTG濃度對表達條件進行優(yōu)化，SDS-PAGE結(jié)果顯示，25 ℃和30 ℃誘導時重組VP2蛋白可溶性表達量最高，選擇30 ℃進行誘導表達(圖2A)；而IPTG濃度變化對目的蛋白可溶性表達量的影響并不大，故選擇低劑量的0.1 mmol/L作為最佳濃度(圖2B)；誘導表達12 h時重組VP2蛋白可溶性表達量已達最高，繼續(xù)培養(yǎng)目的蛋白的含量并沒有明顯提高(圖2C)。綜上，最終得出目的蛋白最佳誘導表達條件：0.1 mmol/L IPTG在 30 ℃誘導表達12 h,可獲得較高表達量的可溶性VP2蛋白。

2.3 重組蛋白VP2的純化

采用硫酸銨沉淀法進行第一步純化，SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組VP2蛋白在硫酸銨含量為20%時已經(jīng)開始出現(xiàn)沉淀，到40%時可完全沉淀(圖3A)，所以本研究采用40%硫酸銨對重組VP2蛋白進行純化。用Tris-HCl緩沖液溶解后，透析除去硫酸銨，再進行Ni2+親和層析純化，經(jīng)咪唑梯度洗脫分離純化重組VP2蛋白，SDS-PAGE及Western blot檢測結(jié)果表明，經(jīng)二步法純化獲得的重組VP2蛋白的純度約為90%(圖3B)。

A：M.Marker； 1、3、5、7分別為16、25、30、37 ℃誘導表達后的超聲上清；2、4、6、8分別為16、25、30、37 ℃誘導表達后的超聲沉淀。B：M.Marker； 1、3、5、7分別為IPTG濃度為0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L誘導表達后的超聲上清；2、4、6、8分別為IPTG濃度為0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L誘導表達后的超聲沉淀。C：M.Marker； 1、3、5、7分別為誘導6、12、16、20 h的超聲上清; 2、4、6、8分別為誘導6、12、16、20 h的超聲沉淀A：M.Marker; 1,3,5,7 represent ultrasonic supernatant induced at 16 ℃,25 ℃,30 ℃ and 37 ℃,respectively; 2,4,6,8 represent ultrasonic precipitation induced at 16 ℃,25 ℃,30 ℃ and 37 ℃,respectively. B：M.Marker; 1,3,5,7 represent ultrasonic supernatant induced at the IPTG concentration of 0.1,0.3,0.5,0.7 mmol/L,respectively; 2,4,6,8 represent ultrasonic precipitation induced at the IPTG concentration of 0.1,0.3,0.5,0.7 mmol/L,respectively. C：M.Marker; 1,3,5,7 represent ultrasonic supernatant induced at 6 h,12 h,16 h and 20 h,respectively; 2,4,6,8 represent ultrasonic precipitation induced at 6 h,12 h,16 h and 20 h,respectively

A:硫酸銨沉淀初步純化VP2蛋白。M.Marker；1—4.分別為20%、30%、40%及50% (NH4)2SO4沉淀。B: Ni2+親和層析純化VP2蛋白。 M.Marker；1—2.Ni2+純化的VP2蛋白A: (NH4)2SO4 purification of VP2 protein. M.Marker; 1—4.20%,30%,40% and 50% (NH4)2SO4 precipitation. B: Ni2+ affinity chromatography.M.Marker; 1—2.Ni2+purification of VP2 protein

2.4 PPV VLPs組裝和檢測

分析NaCl濃度對VP2組裝形成VLPs的影響，通過透射掃描電鏡(TEM)(圖4A)以及動態(tài)光散射技術(DLS)(圖4B)觀察VLPs形成情況，結(jié)果顯示，從大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得的重組VP2蛋白可以在體外組裝形成結(jié)構(gòu)相對較均一、大小約20 nm的VLPs，pH值8.0的Tris緩沖液中，當NaCl濃度為150 mmol/L時VLPs組裝效率最高。檢測VLPs的血凝活性，證實制備的VLPs血凝效價為1∶1 024(圖4C)，說明該VLPs正確展示了PPV的血凝活性表位，結(jié)構(gòu)接近天然PPV病毒。

A：電鏡結(jié)果；B：動態(tài)光散射結(jié)果；C：血凝試驗結(jié)果(VLPs稀釋倍數(shù)分別從1∶8到1∶1 024)A:The results of electron microscopy; B:The results of dynamic light scattering; C:The results of Hemagglutination test(Dilution ratio of VLPs is from 1∶8 to 1∶1 024,respectively)圖4 PPV VLPs組裝和檢測 Fig.4 Assembly and inspection of PPV VLPs

2.5 PPV VLPs免疫效果

采用ELISA檢測昆明鼠的抗體應答情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VLPs組免疫血清特異性抗體效價最高可達1∶25 600，高劑量組略高于低劑量組；無論是高劑量還是低劑量組,抗體水平均略高于滅活疫苗組(圖5)。

圖5 免疫血清效價ELISA測定 Fig.5 The immunity serum titer measured by ELISA

病毒中和試驗顯示，VLPs能有效刺激小鼠產(chǎn)生較高效價的中和抗體，在免疫后35 d，A組高劑量免疫組(VLPs 30 μg)的抗體水平略高于B組低劑量組(VLPs 15 μg)，而在免疫后42 d時低劑量組中和抗體水平則略高于高劑量組；PPV滅活疫苗組和PBS免疫組都幾乎沒有中和抗體的產(chǎn)生(圖6A)。VLPs免疫后，15 μg VLPs比30 μg VLPs免疫組的HI抗體水平高，而PPV滅活苗免疫組幾乎沒有HI抗體產(chǎn)生，PBS免疫對照組在整個免疫期都沒有HI抗體的產(chǎn)生(圖6B)。

圖6 免疫血清中和抗體和HI抗體檢測 Fig.6 Detection of neutralizing antibody and HI antibody

3 結(jié)論與討論

原核表達系統(tǒng)可以實現(xiàn)目的蛋白的高效表達、降低生產(chǎn)成本，在獸用疫苗市場有廣泛應用前景。PPV VP2蛋白在體外經(jīng)重組表達后能自我裝配成VLPs結(jié)構(gòu)，能刺激機體產(chǎn)生中和抗體。因此，實現(xiàn)VP2蛋白在原核表達系統(tǒng)的高效可溶性表達對PPV VLPs疫苗研究具有重要意義。國內(nèi)外學者在原核表達PPV VP2 蛋白上開展了一系列研究，司艷紅等[16]在E.coli中成功表達了以包涵體形式存在的VP2融合蛋白，經(jīng)復性處理后未能得到VLPs；宋品等[17]在E.coli中獲得與SUMO標簽融合表達的PPV VP2蛋白，經(jīng)切除標簽獲得VLPs。司艷紅等[16]雖然在原核表達系統(tǒng)中表達獲得重組VP2蛋白，但是卻難以實現(xiàn)可溶性表達，更難于形成VLPs結(jié)構(gòu)；宋品等[17]在原核表達系統(tǒng)中獲得帶有較大融合標簽的重組VP2蛋白，但在后續(xù)組裝VLPs過程中，需要切除標簽，增加操作難度，提高了VLPs制備成本。本研究采用原核表達系統(tǒng)成功獲得可溶性PPV VP2蛋白，用DNAStar軟件分析PPV VP2蛋白氨基酸序列，VP2蛋白共含有579個氨基酸，其分子質(zhì)量約為64.3 ku。SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組VP2蛋白在約64 ku處有明顯目的條帶，通過與伴侶蛋白共表達的方式可以明顯增加目的蛋白的可溶性表達量，提高重組蛋白活性。經(jīng)硫酸銨鹽析沉淀和Ni2+柱親和層析2步純化法獲得純度約90%的重組VP2蛋白。由于PPV VLPs形成效率顯著影響VLPs疫苗的免疫保護效果，經(jīng)VLPs組裝條件的優(yōu)化，本研究發(fā)現(xiàn)，PPV VP2蛋白在pH值 8.0的Tris緩沖液、150 mmol/L NaCl濃度條件下VLPs形成率最高，最終獲得與天然PPV病毒結(jié)構(gòu)類似的VLPs結(jié)構(gòu)，透射電鏡和動態(tài)光散射檢測結(jié)果表明，制備的VLPs大小約20 nm，結(jié)構(gòu)均一、形狀規(guī)則，且具有血凝活性，說明該VLPs能夠正確展示PPV的血凝活性表位，與前述桿狀病毒表達系統(tǒng)中獲得的VLPs結(jié)構(gòu)類似[10-15]。進一步用PPV VLPs疫苗免疫昆明鼠進行動物試驗，證明制備的VLPs疫苗刺激機體產(chǎn)生的特異性抗體效價高達1∶25 600，說明制備的VLPs疫苗能有效刺激機體B淋巴細胞活化，產(chǎn)生明顯優(yōu)于PPV滅活疫苗特異性抗體，有良好的應用前景。