宋輝 張婷 禹文峰

摘? 要：目的 針對ACTB基因設(shè)計引物，并在醫(yī)學本科分子生物實驗教學中通過聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）讓學生認識真核基因內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)的特點。方法 通過在線軟件Primer-BLAST設(shè)計針對ACTB基因的引物，通過改變退火溫度，優(yōu)化PCR體系，同時，結(jié)合實驗教學結(jié)果評價引物的特異性。結(jié)果 針對ACTB基因外顯子3和外顯子4設(shè)計了兩對引物，引物1和引物2。引物1在退火溫度68℃時，表現(xiàn)出較高的特異性和PCR產(chǎn)量。以基因組DNA（gDNA）和cDNA為模板，PCR產(chǎn)物大小相差441bp。以此條件，引物1在實驗教學中也表現(xiàn)出較好的效果，目的基因擴增成功率達到90%以上。結(jié)論 引物1在退火溫度68℃時，利用PCR技術(shù)結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，學生們可以形象的理解真核生物基因的結(jié)構(gòu)特點，值得在醫(yī)學本科分子生物學實驗教學中推廣。

關(guān)鍵詞：ACTB;PCR;真核基因結(jié)構(gòu);分子生物學;實驗教學

Abstract： Objective To design specific primer for ACTB and apply it in the molecular biology experiment teaching for medical undergraduate to help them understand the structure characteristics of eukaryotic genes with intron and exon through PCR. Methods ACTB primers were designed using online tool Primer-BLAST. PCR system was optimized by different annealing temperatures. Primer specificity was evaluated based on experiment teaching results. Results Two ACTB primers （primer 1 and primer 2） were designed spanning exon 3 and exon 4. Primer 1 showed high specificity and PCR yield at annealing temperature of 68 ℃. There was 441 bp difference of PCR product between genomic DNA （gDNA） and cDNA as template. Under this condition， we also obtained a satisfied experiment teaching result for primer 1， with more than 90% successful amplification rate of target gene. Conclusion Students can easily understand the structural characteristics of eukaryotic genes by PCR using primer 1 at annealing temperature of 68 ℃， which is worth popularizing in the molecular biology experiment course for medical undergraduates.

聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外酶促擴增特定DNA片段的分子生物學技術(shù)，由變性、退火和延伸三步反應(yīng)組成，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便的特點[1]。目前，PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病診斷、微生物檢測、法醫(yī)鑒定和基因工程等領(lǐng)域[2-5]。在醫(yī)學本科分子生物學實驗教學中，開設(shè)PCR實驗課有助于學生們將理論與實踐相結(jié)合，增強動手能力。本實驗以ACTB基因為例，從引物設(shè)計、PCR條件優(yōu)化、產(chǎn)物檢測、教學實踐等多個環(huán)節(jié)，讓學生們認識真核基因中內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)的特點。

一、材料和方法

（一）材料

HEK-293T細胞（ATCC），DMEM培養(yǎng)基（Hyclone），血清（四季青）。TRIzol（Invitrogen），基因組提取試劑盒（天根，#DP348-02），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific，#K1622），Taq 酶（TaKaRa，#R001BM），引物合成（上海生工）。

（二）細胞培養(yǎng)

EK-293T細胞接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿中，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。48h后PBS沖洗一次，胰蛋白酶消化2min，加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，離心收集細胞，分裝成6管，直接或加入1ml TRIzol后，-80℃保存。

（三）基因組DNA提取

在所收集的細胞沉淀中加入300μl PBS，輕輕吹打，成細胞懸液。按照基因組提取試劑盒說明書，提取基因組DNA，NanoDrop 2000分光光度計測定DNA的濃度，-20℃保存。

（四）總RNA的提取和cDNA的合成

利用TRIzol法提取HEK-293T細胞的總RNA，NanoDrop 2000分光光度計測定RNA的濃度。取3μl RNA，按照表1配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，反應(yīng)條件42℃ 60min，70℃ 5min，-20℃保存。

（五）引物設(shè)計

從NCBI中獲取ACTB基因（NM_001101.5）的mRNA序列，利用在線軟件Primer-BLAST設(shè)計引物，送至上海生工進行合成。

（六）PCR

按照表2配制反應(yīng)體系，混合均勻，在ABI PCR ProFlex儀上進行PCR。反應(yīng)條件：預變性95℃ 5min;變性95℃ 30s，退火68℃ 30s，延伸72℃ 40s，30個循環(huán);終末延伸72℃ 5min。

表2 PCR體系（25μl）

（七）瓊脂糖凝膠電泳

配制1%的瓊脂糖凝膠，加熱使融解，待冷卻至50℃左右，加入10mg/ml溴化乙錠（5μl/100ml 1%的瓊脂糖凝膠），混勻，倒入制膠板中，室溫放置45min，向25μl PCR產(chǎn)物中加入6×加樣緩沖液5μl，混勻后取8μl，點樣。120V，電泳45min，在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）下拍照，記錄結(jié)果。

二、實驗結(jié)果

（一）引物設(shè)計

通過NCBI查找基因ACTB的mRNA序列，發(fā)現(xiàn)該基因含有6個外顯子和5個內(nèi)含子，其中外顯子3和外顯子4間隔441bp（圖1A）。因此，跨外顯子3和外顯子4設(shè)計引物，可以很好地鑒別內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)。依據(jù)引物的特性，我們利用Primer-BLAST針對外顯子3和外顯子4的序列設(shè)計引物，我們獲得兩對引物，Primer 1（Forward primer：GGCATCCTCACCCTGAAGTA;Reverse primer：TAGCACAGCCTGGATAGCAA）和Primer 2（Forw

ard primer：CTGAAGTACCCCATCGAGCA;Reverse primer：AGCCTGGATAGCAACGTACA）（圖1B）。

（二）PCR條件優(yōu)化

我們所提取的總RNA濃度為1054.1ng/μl，gDNA濃度為440.7ng/μl。在不同退火溫度（56℃、60℃、64℃、68℃和70℃）條件下，對引物的特異性進行了檢測。如圖2所示，以cDNA為模板，引物1和引物2均顯示出了較高的特異性;以gDNA為模板，引物1和引物2在68℃和70℃時表現(xiàn)出較高的特異性，但是在相同溫度下，引物1的目的DNA片段的擴增效率高于引物2。因此，我們選擇引物1和退火溫度68℃，作為實驗教學的PCR條件。

（三）實驗教學效果

本科生物技術(shù)和化學生物學專業(yè)學生合計153人，兩人一組，合計77組，分為7個班進行授課。在實驗教學中，RNA濃度最低267.1ng/μl，最高2283.4ng/μl，800-1200ng/μl組數(shù)最多，占31.2%（23/77）（圖3A）;gDNA濃度最低25.5ng/μl，最高512.7ng/μl，200-300ng/μl組數(shù)最多，占27.3%（21/77）（圖3B）。如圖4所示，引物1在實驗教學中顯示出較好的效果，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，以cDNA為模板，目的DNA片段擴增正確率92.2%（71/77），以gDNA為模板，目的DNA片段擴增正確率90.9%（70/77），僅1組cDNA的PCR產(chǎn)物大小不正確，大小在400bp左右。通過瓊脂糖凝膠電泳，學生觀察到分別以gDNA和cDNA為模板，PCR產(chǎn)物大小相差400bp左右，與預期結(jié)果一致。

三、討論

人ACTB基因位于第7號染色體p22.1，長度36，637bp，所編碼的蛋白β-actin大小約42kDa，屬于肌動蛋白家族[6]。β-actin高度保守，分布廣泛，表達水平高，常用作內(nèi)參基因。然而，受一些生化刺激或在疾病狀態(tài)下，β-actin的表達水平也會發(fā)生變化[7]。研究發(fā)現(xiàn)，β-actin參與多種生物學過程，包括：細胞骨架形成，細胞生長、運動和遷移，組蛋白修飾和基因表達調(diào)控等[8-10]。ACTB表達異?；蛲蛔兣c腫瘤的發(fā)生，Baraitser-Winter綜合癥，血小板缺少癥以及貝克痣綜合征等密切相關(guān)[11-14]。

與原核生物不同，大多數(shù)真核生物基因都是斷裂基因，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需要去除內(nèi)含子，將外顯子拼接成連續(xù)的序列。我們在設(shè)計引物時考慮到本實驗的目的是認識真核生物的結(jié)構(gòu)，因此上、下游引物必須跨外顯子。其次，為了更直觀的觀察到內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)，最好只跨一個內(nèi)含子，這樣便于學生理解。再次，內(nèi)含子的大小，太大會延長上課時間，太短無法直觀區(qū)分PCR產(chǎn)物大小的差異。因此，我們針對外顯子3和外顯子4設(shè)計上、下游引物。

PCR的溫度控制十分關(guān)鍵，尤其退火溫度。退火溫度主要影響PCR的特異性和產(chǎn)量：退火溫度過低，會出現(xiàn)非特異性雜帶;提高溫度可以提高引物特異性，但溫度過高，引物不能與模板的結(jié)合，PCR產(chǎn)量降低。在預實驗中，我們也觀察到隨著退火溫度的提高，非特異性雜帶減少。對引物1和引物2來說，當采用68℃和70℃的退火溫度時，非特異性條帶明顯減少，但70℃的PCR產(chǎn)量低于68℃。在同一溫度（68℃或70℃）下，引物2的PCR產(chǎn)量明顯低于引物1。因此，在實驗教學中，我們采用引物1和退火溫度68℃。

從教學結(jié)果來看，90%以上學生的結(jié)果與預期一致。在對電泳結(jié)果進行分析時，我們發(fā)現(xiàn)漏加試劑成為實驗失敗的主要原因。由于每個學生操作的個體差異，總RNA和gDNA的濃度差異較大，成為影響PCR產(chǎn)量的重要原因。而在科學研究中，實驗結(jié)果必須具有良好的可重復性，應(yīng)盡量避免人為因素對實驗結(jié)果的干擾。在未來的實驗教學中，除了講解實驗原理和步驟，應(yīng)在操作的規(guī)范方面加強訓練。

四、結(jié)束語

從教學效果來看，我們所設(shè)計的ACTB引物1和本文所采用的PCR條件可以很好地讓學生理解真核生物基因的結(jié)構(gòu)特點;同時，將PCR技術(shù)引入到醫(yī)學本科分子生物學實驗教學中，可以培養(yǎng)學生的科研思維，提高分析問題和解決問題的能力，值得在醫(yī)學本科分子生物學實驗教學中推廣。

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