趙娜 苗艷梅 趙敏

摘要：植物的真菌病原菌可以通過核糖體RNA或者其他通用引物進(jìn)行鑒定，植物病毒缺乏通用引物，這給植物未知病毒病的鑒定帶來較大挑戰(zhàn)。隨著分子生物學(xué)及測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了很多直接從植物病料中檢測(cè)未知病毒的方法，這些方法推進(jìn)了植物病毒的發(fā)掘和病原鑒定，取得了非常好的效果。本文主要闡述近年來應(yīng)用于檢測(cè)未知植物病毒的分子生物學(xué)方法。

關(guān)鍵詞：未知植物病毒：分子生物學(xué)：檢測(cè)方法

中圖分類號(hào)：$432.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-4440（2019）01-0224-05

對(duì)植物而言，植物病毒是僅次于真菌的第二大病原，由于其流行和爆發(fā)對(duì)糧食危害極大，且防治困難，故有植物癌癥之稱。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，受植物病毒影響，全世界每年糧食總產(chǎn)量損失約10%。有關(guān)植物病毒的研究已有100多年歷史，但大多數(shù)研究?jī)H限于農(nóng)作物中的疾病，有很多植物病毒未被發(fā)現(xiàn)。植物病毒結(jié)構(gòu)特殊，而且沒有通用的編碼序列，這增加了植物病毒研究的難度，植物病毒的多樣性仍是未知的，有待新的研究方法去揭秘。

植物病毒的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要包括指示植物鑒別法、血清學(xué)試驗(yàn)法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）]、分子雜交技術(shù)法、電鏡技術(shù)法。最近，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)、基因芯片等已廣泛應(yīng)用于植物病原的鑒定中。但是，利用這些常用試驗(yàn)方法進(jìn)行鑒定的前提是必須了解病原物的生物學(xué)特性和基因組特征。譬如，基因芯片技術(shù)可以一次性檢測(cè)10種病毒，但只能檢測(cè)未知病害植物中的已知病毒。這些方法對(duì)于植物未知病毒的挖掘以及植物新病害的診斷研究有很強(qiáng)的限制性，在實(shí)際工作中不易推廣。由此可見，未知植物病毒的檢測(cè)方法在新病毒發(fā)現(xiàn)方面發(fā)揮著十分重要的作用。本文重點(diǎn)闡述利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)未知植物病毒的研究現(xiàn)狀。

1基于傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)的未知病毒檢測(cè)方法

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了很多針對(duì)未知植物病毒的檢測(cè)技術(shù)。由于植物病毒基因組結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，多為1個(gè)或者2個(gè)開放閱讀框，且核酸會(huì)殘存在發(fā)病植物病料中，故可以通過追蹤、放大基因組本身的方法鑒定核酸序列，再與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知病毒序列進(jìn)行比對(duì)，利用生物軟件分析病毒生物學(xué)特征，確診病原。現(xiàn)階段，基于傳統(tǒng)分子生物學(xué)的未知植物病毒檢測(cè)方法主要有雙鏈RNA（dsRNA）技術(shù)、cDNA代表性差異分析（RDA）技術(shù)、核酸序列非依賴性引物擴(kuò)增技術(shù)等。

1.1 dsRNA技術(shù)

植物病毒基因組以RNA為主，占90%以上。雙鏈RNA是RNA病毒、類病毒等在寄主體內(nèi)形成單鏈核糖核酸（ssRNA）的特異復(fù)制中間型產(chǎn)物，具有病毒特異性，且性質(zhì)穩(wěn)定，不隨寄主改變而改變。因此，提取植物組織或者病毒粒子中的dsRNA，可用于病毒種類鑒別，病毒侵染診斷。1986年Dale等首次從表現(xiàn)出典型癥狀的香蕉病株中分離得到dsRNA，并在以后的研究中確定存在于寄主植物韌皮部組織的病毒粒體為香蕉束頂病毒（BBTV）?，F(xiàn)階段，越來越多的研究者通過提純dsRNA，提高樣品中核酸的有效率，結(jié)合二代測(cè)序方法來檢測(cè)未知病毒。同時(shí)，dsRNA的提取方法也在不斷更新、完善，為植物病毒各個(gè)領(lǐng)域的研究提供技術(shù)保障。

1.2CDNA代表性差異分析技術(shù)

cDNA代表性差異分析技術(shù)建立在cDNA文庫的基礎(chǔ)上，通過提取患病和健康植物的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，對(duì)比患病植物與健康植物cDNA的差異，進(jìn)行消減，減小文庫規(guī)模，進(jìn)而得到差異的cDNA序列，進(jìn)行多次雜交，去除相同核酸，降低二次擴(kuò)增背景的影響。戰(zhàn)晴晴在構(gòu)建柴胡全長(zhǎng)cDNA文庫時(shí)，雖然首次發(fā)現(xiàn)蠶豆萎蔫病毒2（BB—WV-2）可以侵染柴胡，但沒有發(fā)現(xiàn)新病毒。總之，cDNA代表性差異分析方法較為繁瑣、費(fèi)時(shí)，且發(fā)現(xiàn)新病毒的幾率較小。

此外，Cooper等利用高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）方法，通過分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)來鑒定植物感染的未知病原體。這種利用質(zhì)譜法分析差異蛋白質(zhì)的方法類似于cDNA代表性差異分析技術(shù)，但由于其數(shù)據(jù)的缺失值較多，獲得結(jié)果的質(zhì)量好壞以及可靠性高低參差不齊，給差異蛋白質(zhì)的篩選造成了很大阻力。

1.3核酸序列非依賴性單引物擴(kuò)增技術(shù)

核酸序列非依賴性單引物擴(kuò)增技術(shù)（sISPA）是一種平末端連接擴(kuò)增技術(shù)，原理如圖1顯示，起初僅用于檢測(cè)DNA病毒，后來有學(xué)者采用改良的DNase-SISPA技術(shù)測(cè)定未知DNA和RNA病毒的序列，證實(shí)了該擴(kuò)增方法對(duì)RNA病毒檢測(cè)的有效性。由于該方法不需要提純病毒，可以直接從病樣中提取核酸，所以近年來越來越多的實(shí)驗(yàn)室通過此方法檢測(cè)未知植物病毒。趙西梅通過提取dsRNA病毒，并以其為模板進(jìn)行非序列依賴性PCR擴(kuò)增，成功從有病癥的地黃中分離到油菜花葉病毒（ORMV）和地黃花葉病毒（ReMV），從有病癥的白術(shù)中分離出香豆萎葛病毒2號(hào)（BBWV2）。

1.4簡(jiǎn)并核苷酸引物擴(kuò)增技術(shù)

簡(jiǎn)并核苷酸引物擴(kuò)增技術(shù)（DOP）是通過巧妙設(shè)計(jì)引物來進(jìn)行序列非依賴性擴(kuò)增的，原理如圖2顯示，以3’端和5’端的特異性核苷酸序列以及中間6個(gè)核苷酸構(gòu)成的隨機(jī)引物為引物群.起初的引物是很隨機(jī)的，但隨著3’端引物上特異性核苷酸的結(jié)合，在隨后的反應(yīng)過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸匹配度越來越高，產(chǎn)物通過測(cè)序比對(duì)，即可找到未知的植物病毒序列。Badillo等對(duì)葉脈有條紋狀壞死而且頂梢和葉側(cè)脈部變黃的番茄植株進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，利用等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬（I/arv/rus）簡(jiǎn)并引物的方法進(jìn)行擴(kuò)增，最終獲得番茄壞死條紋病毒（TomNSV）全基因組，基因組分析結(jié)果表明，該病毒是亞組2的新成員。Ciuffo等在調(diào)查葉片具有病毒樣癥狀（花葉、畸形和壞死）的萵苣時(shí)，利用馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）外殼蛋白（CP）所設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物成功擴(kuò)增出1種新病毒，暫命名為意大利萵苣壞死病毒（LINV），該病毒可以通過桃蚜非持久性方式進(jìn)行傳播。

Shahid等在鑒定黑莓黃脈病病原時(shí)，利用簡(jiǎn)并引物檢測(cè)到一種新的雙鏈DNA病毒，暫時(shí)稱為黑莓病毒F（BVF），該病毒為桿狀DNA病毒屬（Bad-navirus）新成員。一種暫命名為金盞花花葉?。ˋd-MV）的香石竹斑駁病毒屬（Carmovirus）新成員是科研人員通過簡(jiǎn)并引物方法發(fā)現(xiàn)的。由于簡(jiǎn)并引物技術(shù)可操作性較強(qiáng)，耗時(shí)短、費(fèi)用低，近年來在很多植物的未知病原鑒定中發(fā)揮重要作用。

2基于新型測(cè)序技術(shù)的未知病毒檢測(cè)方法

上述幾種未知病毒檢測(cè)的最終結(jié)果都必須依靠核酸的Sanger測(cè)序技術(shù)，通過NCBI網(wǎng)站Blast比對(duì)最終確定病毒種類。第二代測(cè)序技術(shù)（NGS）的推出，打破了Sanger測(cè)序技術(shù)的瓶頸，進(jìn)入高通量測(cè)序技術(shù)時(shí)代，為挖掘新的未知病毒提供了新思路。

NGS從2009年開始應(yīng)用于植物病毒領(lǐng)域，該領(lǐng)域包括植物病毒的發(fā)現(xiàn)，基因組序列測(cè)定以及生態(tài)學(xué)和流行病毒學(xué)的研究。這種新檢測(cè)技術(shù)的流程主要包括樣品核酸的準(zhǔn)備，核酸文庫的構(gòu)建，上機(jī)測(cè)序，生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析等基本過程。根據(jù)核酸樣品的不同來源，可以將NGS技術(shù)分為2大類，其中一類以宏基因組為研究對(duì)象，另一類以siRNA（Small interfering RNA）為研究對(duì)象。

2.1基于宏基因組學(xué)的NGS

宏基因組學(xué)以特定生態(tài)環(huán)境中全部微生物的遺傳信息為研究對(duì)象，來研究部分微生物的功能基因篩選以及微生物與環(huán)境或者個(gè)體之間的關(guān)系，樣品中病毒核酸如何富集，即核酸的有效性是保證序質(zhì)量的關(guān)鍵。利用NGS的宏基因組學(xué)對(duì)植物病毒的最早研究來自于英國(guó)學(xué)者Adams等，為了保證NGS測(cè)序質(zhì)量，提高樣品核酸的有效性，先將從蛇鞭菊中獲得的病原分離物摩擦接種到千日紅，再通過對(duì)宿主核酸消減雜交，構(gòu)建cDNA，進(jìn)行NGS，最終獲得一個(gè)名為蛇鞭菊輕斑駁病毒（GMMV）的黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）新成員。同樣，Green等13伽將病樣分離物摩擦接種于本氏煙，從而提取有癥狀的本氏煙總RNA，構(gòu)建cDNA文庫，利用Illumi-na公司的NextSeq 500平臺(tái)進(jìn)行NGS，最終獲得蕪菁黃花葉病毒屬（Tymovirus）的新成員，暫時(shí)命名為奎東茄褪綠花葉病毒（NarCMV）。

Tang等為了提高NGS病毒序列的檢出率，先將病原分離物摩擦接種于本氏煙，提取本氏煙總核酸，利用脫氧核糖核酸酶I消除DNA，同時(shí)消減宿主的rRNA，利用消減后的RNA構(gòu)建eDNA文庫，基于454平臺(tái)進(jìn)行NGS，最終獲得一個(gè)暫時(shí)命名為罌粟花葉病毒（OPMV）的全基因組序列。值得關(guān)注的是，根據(jù)RNA病毒中間體dsRNA的特征，Petrzik等通過直接提取樣品中的dsRNA，大大減少宿主核酸的影響，構(gòu)建文庫，進(jìn)行NGS，最終獲得醋栗病毒A（cu-VA）。此外，為了進(jìn)一步減少宿主核酸的影響，Pardi-na等直接從提純的病毒顆粒中提取核酸，進(jìn)行NGS，最終獲得甘薯G病毒（sPVG）的全基因組序列。

2.2基于siRNA深度測(cè)序的NGS

siRNA是在RNA沉默機(jī)制中產(chǎn)生的一種具有序列特異性調(diào)控功能的分子。植物RNA沉默機(jī)制的主要功能之一是抗病毒。植物對(duì)病毒產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)，會(huì)在被病毒侵染的植物細(xì)胞中產(chǎn)生與病毒相關(guān)的siRNA，這些siRNA可用于檢測(cè)植物中的RNA和DNA病毒，甚至可用于檢測(cè)一些結(jié)構(gòu)新穎的類病毒。siRNA與已知病毒沒有明顯的序列相似性，因此，siRNA高通量測(cè)序技術(shù)不依賴于已知病毒信息，可以檢測(cè)樣品群體中的全部病毒信息，適用于新病毒的發(fā)現(xiàn)，為植物未知病毒研究開拓新的思路。

迄今為止，通過對(duì)siRNA進(jìn)行NGS，檢測(cè)植物未知病原分離物較成功的案例來自于li等的報(bào)道。他們提取有癥狀番茄樣品中的siRNA，并進(jìn)行深度測(cè)序，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，樣品中含有馬鈴薯紡錘塊莖病類病毒（PSTVd）、鳳果花葉病毒（PepMV）和1種新的病毒暫時(shí)命名為番茄壞死矮化病毒（ToNSV）]。有學(xué)者采用siRNA深度測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了2種薔薇科植物內(nèi)侵染的新病毒，即來自野薔薇樣品的玫瑰葉叢簇伴隨相關(guān)病毒（RLRaV）和來自有果實(shí)開裂癥狀桃植株樣品的桃裂果伴隨相關(guān)病毒（Pc-FaV）。此外，陳莎利用小RNA深度測(cè)序技術(shù)對(duì)云南省和貴州省玉米病毒病進(jìn)行檢測(cè)，獲得3種未知的RNA病毒[玉米黃化花葉病毒（MYMV）、玉米相關(guān)的形影病毒（MAUV）、玉米相關(guān)的整體病毒（MATV1）]和1種國(guó)內(nèi)首次報(bào)道的DNA病毒留尼旺玉米線條病毒云南分離物（MSRV-YN）]。

3展望

植物病毒多樣性的研究尚處于起步階段，作物中新病毒的發(fā)現(xiàn)，野生植物中新病毒的潛在生態(tài)影響以及病毒在感染植物中的潛在作用，這些問題的解決都依賴于未知病毒檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。綜上所述，利用已有的基因組序列，設(shè)計(jì)各個(gè)病毒屬所特有的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增，這種方法操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低，是研究人員發(fā)現(xiàn)新病毒的首選方法。由于病毒種類繁多，所以研究人員需要克服簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)的困難。

NGS技術(shù)具有高效、快速、非序列依賴性的優(yōu)勢(shì)，革新了發(fā)現(xiàn)和鑒定病毒的方法，在短短5年時(shí)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)多種新病毒種類，但是NGS也有一定缺陷。首先，對(duì)于病毒滴度較小的病毒，二代測(cè)序技術(shù)往往會(huì)忽略該類病毒的存在：其次，NGS雖然可以發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法難以發(fā)現(xiàn)的新病毒，但是它往往會(huì)忽略科赫法則，不能證明新病毒是導(dǎo)致病害的病原體;再次，對(duì)于較大規(guī)模的植物病毒種類普查項(xiàng)目，二代測(cè)序技術(shù)的成本昂貴?？傊?，單一的未知植物病毒分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，難免存在局限性，所以在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)樣品和調(diào)查項(xiàng)目狀況，有針對(duì)性地選擇1種或者幾種檢測(cè)技術(shù)，才能有效挖掘更多未知的植物病毒。