石曄飛，徐 徐，袁楊楊，李淼新，彭文輝

（1.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣州 510080；3.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 200040）

肺栓塞（pulmonary embolism，PE）是以各種栓子阻塞肺動脈或其分支為發(fā)病原因的一組疾病或臨床綜合征的總稱，主要包括肺血栓栓塞（pulmonary thromboembolism，PTE）、脂肪栓塞、羊水栓塞、空氣栓塞等。其中，PTE 為肺栓塞最常見的類型［1］。抗凝血酶是一種關(guān)鍵的內(nèi)源性抗凝血劑，其缺乏是血栓形成的危險因素，高達(dá)80%的抗凝血酶缺乏患者具有SERPINC1 基因缺陷［2］。本文通過全外顯子組測序，確診了1 例由 SERPINC1 基因 c.1277C＞T（p.Ser426Leu）突變導(dǎo)致的肺血栓栓塞家系，現(xiàn)報道如下。

1 病例資料

先證者：男，40 歲，2015年 10月因“活動后氣促3 天”于同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院就診，查血小板254×109／L，凝血酶原時間（PT）12.1 s，活化部分凝血活酶時間（APTT） 24.5 s，凝血酶時間（TT）19.3 s，抗凝血酶Ⅲ活性102%，D-二聚體 7.51 mg／L，肺部CTA：右肺動脈主干及兩肺諸葉肺動脈分支多發(fā)栓塞（圖1），診斷為肺栓塞，予低分子肝素抗凝治療，好轉(zhuǎn)出院后不規(guī)律服用達(dá)比加群酯抗凝治療，自行停藥半年后，于2018年10月因“喘息1 天伴暈厥”再次到同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院就診，查血小板206×109／L，PT 17.4 s，APTT 40.2 s，TT 29.4 s，抗凝血酶Ⅲ活性104%，D-二聚體58.96 mg／L，復(fù)查肺部CTA：兩肺肺動脈主干及分支多發(fā)栓塞（圖2），診斷為肺栓塞，于阿替普酶溶栓、低分子肝素抗凝，好轉(zhuǎn)后改為口服利伐沙班抗凝治療。

先證者之父，男，65 歲，2017年 7月因“右側(cè)胸痛”就診，查血小板 203×109／L，PT 12.6 s，APTT 27.6 s，TT 11.6 s，抗凝血酶Ⅲ活性 108%，D-二聚體1.929 mg／L，肺部CTA：右肺動脈主干充盈缺損（圖3），診斷為肺栓塞，予低分子肝素抗凝治療，好轉(zhuǎn)口服達(dá)比加群酯抗凝治療。

先證者母親、妻子、女兒無胸痛不適癥狀，凝血相關(guān)指標(biāo)均正常；先證者叔叔及其妻兒均無胸痛不適癥狀，凝血相關(guān)指標(biāo)均正常；先證者祖代均已過世，無肺栓塞相關(guān)癥狀。在該家系中，肺栓塞存在遺傳傾向，總結(jié)該家系遺傳系譜圖如圖4 所示。

圖1 先證者2015年肺部CTAFig.1 Lung CTA of the proband in 2015

圖2 先證者2018年肺部CTAFig.2 Lung CTA of the proband in 2018

圖3 先證者之父2017年肺部CTAFig.3 Lung CTA of the father of proband in 2017

圖4 先證者家系遺傳系譜圖Fig.4 The family tree of the proband

2 基因測序及分析

2.1 血液樣本采集及基因測序

取得患者及家屬同意后簽署知情同意書，采集該家系成員的外周靜脈血5 mL，委托上海中優(yōu)精準(zhǔn)醫(yī)療科技股份有限公司進(jìn)行全外顯子組基因測序。

2.2 生物信息學(xué)分析及基因致病性的判斷

獲得測序數(shù)據(jù)后，按照既往研究所采用的方法［3］，使用 GATK、Strelka2 和 Sentieon 分別進(jìn)行變異位點(diǎn)的檢測，將所得到結(jié)果分別通過KGGSeq 過濾注釋分析，并用Phenolyzer 進(jìn)行表型相關(guān)性分析。按照隱性模式篩選得到唯一的候選基因TMEM104（rs3803784），沒有關(guān)于這個基因的功能研究，且在模式生物數(shù)據(jù)庫中也沒有相關(guān)的報道，不考慮。按照顯性遺傳模式篩選出兩位患者存在SERPINC1 基因c.1277C＞T（p.Ser426Leu）雜合突變，根據(jù) Phenolyzer 表型分析結(jié)果，表明SERPINC1 基因與凝血功能相關(guān)，該基因突變會導(dǎo)致肺栓塞、血栓栓塞、靜脈血栓形成、異常栓塞形成等表型。對家系成員該基因位點(diǎn)進(jìn)行Sanger 測序驗(yàn)證（圖5），先證者與其父親存在該位點(diǎn)的雜合突變，其他成員該位點(diǎn)無突變，證實(shí)該家系為SERPINC1 基因 c.1277C＞T（p.Ser426Leu）突變致病。

圖5 先證者家系SERPINC1 基因Sanger 測序Fig.5 The results of Sanger sequencing of proband's family

3 討 論

PTE 和深靜脈血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）統(tǒng)稱為靜脈血栓栓塞（venous thromboembo?lism，VTE），全球每年約有1 000 萬例VTE 發(fā)生，是繼心肌梗死和中風(fēng)之后的第 3 大心血管疾?。??5］。PTE 與DVT 實(shí)質(zhì)上為VTE 在不同部位、不同階段的不同表現(xiàn)形式［6?7］。VTE 危險因素包括遺傳性和獲得性兩大類，遺傳性危險因素主要包括抗凝血酶缺乏、凝血因子Ⅴleiden 突變、凝血酶原G20210A 基因突變、蛋白C 缺乏、蛋白S 缺乏等，獲得性危險因素主要包括高齡、癌癥、肥胖、慢性病、妊娠、口服避孕藥、手術(shù)、外傷等［8］。其中，SERPINC1 基因突變引起的遺傳性抗凝血酶缺乏扮演著重要角色［9］。

SERPINC1 基因位于 1q23?25.1，跨越 13.4 kbp，包含 7 個外顯子［10］。該基因編碼的抗凝血酶Ⅲ（antithrombin Ⅲ，AT Ⅲ）屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，在肝臟合成464 個氨基酸組成的蛋白質(zhì)前體后，剪切去除32 個前導(dǎo)氨基酸后形成432 個氨基酸組成的成熟蛋白質(zhì)［11］。AT Ⅲ的生理功能是滅活凝血酶（Ⅱa 因子）和 Xa 因子，同時對因子Ⅸa、Ⅺa、Ⅻa、ⅤⅡa 也有一定的作用［12?13］。該蛋白質(zhì)包括兩個重要的功能區(qū)：位于N 端的肝素結(jié)合區(qū)和位于C端的反應(yīng)位點(diǎn)。AT Ⅲ的反應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合凝血酶活性中心，形成穩(wěn)定的抗凝血酶-凝血酶復(fù)合物，進(jìn)一步滅活凝血酶。在循環(huán)血液中，AT Ⅲ的抗凝活性比較弱，當(dāng)與肝素中特殊的戊糖序列結(jié)合后，AT Ⅲ構(gòu)象發(fā)生變化，暴露出反應(yīng)中心環(huán)，發(fā)揮出有效的抗凝作用［14?15］。在肝素存在的條件下，AT Ⅲ的抗凝作用可以增加數(shù)千倍［16］。AT Ⅲ是最重要的凝血因子抑制劑，具有較低的多態(tài)性，揭示了該分子對輕微遺傳缺陷的敏感性，任何錯義突變都有可能導(dǎo)致抗凝血酶功能改變［10］。

遺傳性抗凝血酶缺乏癥是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，其特征是反復(fù) VTE［17］。1965年，Egeberg 報道了首例遺傳性抗凝血酶缺乏癥［18］，之后的幾十年里，不同突變導(dǎo)致的遺傳性抗凝血酶缺乏癥被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD）的報告，截至2019年1月，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有420 種不同的SERPINC1 基因突變導(dǎo)致遺傳性抗凝血酶缺乏。在中國人群中，已有關(guān)于遺傳性抗凝血酶缺乏所致肺栓塞的報道，如p.Met1Leu［19］、p.Cys29Ser［20］、p.Arg13Gln、p.Ser82Arg［21］。而在本研究中，首次報道了中國人群中p.Ser426Leu 突變（在成熟蛋白中為Ser394［22］）所致的肺栓塞，豐富了中國人群的抗凝血酶基因突變數(shù)據(jù)庫。

根據(jù)血漿中檢測到的抗凝血酶的水平，可以將遺傳性抗凝血酶缺乏癥分為兩大類型：Ⅰ型（絕對缺乏）和Ⅱ型（結(jié)構(gòu)異常）。Ⅰ型抗凝血酶缺乏癥表現(xiàn)為血液中抗凝血酶活性和抗凝血酶濃度均降低，屬于抗凝血酶絕對缺乏。產(chǎn)生這種情況的原因是SERPINC1 基因發(fā)生堿基的插入或缺失，影響了mRNA 正常合成，導(dǎo)致抗凝血酶的合成障礙。Ⅱ型抗凝血酶缺乏癥表現(xiàn)為抗凝血酶水平正常但活性降低，根據(jù)功能缺陷區(qū)分為3 種亞型：Ⅱa 型（反應(yīng)位點(diǎn)型），突變位于反應(yīng)中心環(huán)，導(dǎo)致編碼的蛋白失去正常的活性，滅活凝血酶和Xa 因子能力大大降低，常見于382、384、392、393 和394 密碼子；Ⅱb 型（肝素結(jié)合位點(diǎn)型），突變位點(diǎn)位于肝素結(jié)合區(qū)，影響肝素與抗凝血酶的相互作用，常見于 41、47、99 和 129 密碼子；Ⅱc（多效應(yīng)型），突變導(dǎo)致反應(yīng)性和肝素結(jié)合能力的異常，常見于 402、404～407 和 429 密碼子［23?24］。結(jié)合本文報道家系的突變位點(diǎn)，該家系屬于Ⅱa 型。

研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)抗凝血酶檢測存在一定缺陷，使用人的凝血酶測定可能缺乏特異性，并且使用Xa 因子測定可能無法檢測到Ⅱa 型，比如AT Cambridge Ⅱ（p.Ala416Ser）和 AT Denver（p.Ser426Leu），使用牛凝血酶作為反應(yīng)物檢測時，檢測到了低水平的AT 活性，但當(dāng)使用Xa 因子作為反應(yīng)物時卻檢測到AT 活性及抗原水平正常［13］。隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，遺傳分析診斷疾病的應(yīng)用越來越普遍，使用遺傳分析方法檢測編碼抗凝血酶基因SERPINC1 中的突變，已成為鑒定遺傳性抗凝血酶缺陷癥的最佳方法［25］。

根據(jù)2014年歐洲心臟病學(xué)會急性肺栓塞診治指南，抗凝治療是預(yù)防早期死亡和復(fù)發(fā)及致命性VTE 的有效手段［26］，新型口服抗凝藥物 Xa 因子拮抗劑利伐沙班和凝血酶抑制劑達(dá)比加群酯的療效不劣于使用維生素K 拮抗劑的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，同時出血風(fēng)險更低，無須頻繁監(jiān)測凝血功能［27?28］。在該家系中，達(dá)比加群酯和利伐沙班均有使用。

綜上所述，此先證者及其父親存在SERPINC1基因 c.1277C＞T（p.Ser426Leu）突變，突變后 AT Ⅲ滅活凝血酶和Xa 因子的能力減弱，血液處于高凝狀態(tài)，易形成深靜脈血栓，并導(dǎo)致肺動脈血栓栓塞。對于遺傳性抗凝血酶缺乏癥患者，如能早期行基因檢測明確是否有致病突變，有利于疾病早期預(yù)防血栓，并幫助選擇合適的抗凝藥物，對于疾病的治療及預(yù)后具有重要意義。